Name: Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprenda a aislar médula ósea de ratones neonatales y generar macrófagos derivados mediante técnica no enzimática. Este método reproducible permite estudiar respuestas inmunes tempranas en investigación neonatal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [R01 AI163333] para CMR. Reconocemos el apoyo financiero adicional brindado a la Instalación Central de Citometría de Flujo y Célula Única de la Universidad de Virginia Occidental mediante las siguientes subvenciones: WV CTSI grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE grant GM121322 y NIH grant OD016165.

Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Virginia Occidental y se realizaron siguiendo las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación. Para este estudio se utilizaron crías de ratón C57BL/6J. Los detalles de todos los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de los medios
<ol><li>Prepare 3 mL de medio de cultivo MEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES y penicilina (100 U/mL)/estreptomicina (100 μg/mL) en un tubo de centrífuga de 5 mL, y manténgalo en hielo.</li>
	<li>Si es necesario almacenar los progenitores de la médula ósea en nitrógeno líquido, prepare medios de congelación que contengan 10% de DMEM, 80% de FBS y 10% de DMSO.</li>
	<li>Para obtener DMEM completo, prepare DMEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES y penicilina (100 U/mL)/estreptomicina (100 μg/mL).</li>
	<li>Para la diferenciación de macrófagos, prepare DMEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de glutamina, penicilina (100 U/mL)/estreptomicina (100 μg/mL) y sobrenadante de células L929 al 10% 9,10,11.</li>
</ol>2. Preparación del sobrenadante de células L929
<ol><li>Descongele las células L929 almacenadas en nitrógeno líquido y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 5 ml de DMEM completo. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células en 5 mL de medio DMEM completo y siembrójelas en un matraz de cultivo de tejidos T25 a una densidad de 2×105 células. Cuente las celdas con un contador de células automatizado usando azul de tripán al 0,4%. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 hasta alcanzar el 70% de confluencia.</li>
	<li>Para separar las células, primero lávelas con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Aspire el PBS y reemplácelo con 2,5 mL de tripsina-EDTA al 0,05%.</li>
	<li>Incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 5 min y añadir 5 mL de DMEM completo.</li>
	<li>Recoja las células y centrifugue a 350 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet de celda en 15 mL de medio DMEM completo y transfiéralo a un matraz T75.</li>
	<li>Incubar a 37 °C con 5% de CO2 hasta que las células alcancen el 90% de confluencia, y luego recoger el medio y centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Filtre el medio que contiene M-CSF a través de un filtro de 0,45 μm y congele a -80 °C en alícuotas de 5 mL.</li>
</ol>3. Preparación animal
<ol><li>Bajo un gabinete de bioseguridad, separe cuidadosamente a los cachorros de ratón C57BL/6J de 7-9 días de edad (una camada de 6 cachorros) de la madre y colóquelos en una jaula separada.</li>
	<li>Remoje una bola de algodón en 2 ml de isoflurano de grado veterinario en un frasco de campana u otra cámara de contención.</li>
	<li>Coloque un cachorro en la cámara y cierre la tapa. Monitoree al neonato durante aproximadamente 90 s para asegurarse de que se quede inmóvil e inconsciente.</li>
	<li>Retire rápidamente al cachorro y decapitánelo con tijeras afiladas (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) antes de que el cachorro pueda recuperar la conciencia. NOTA: Los neonatos no respiran lo suficientemente profundo como para la eutanasia solo por inhalación de isoflurano.</li>
	<li>Asegúrese de cerrar la tapa del recipiente después de retirar cada cachorro. La misma bola de algodón se puede usar para 5-7 cachorros.</li>
</ol>4. Aislamiento de la médula ósea neonatal
<ol><li>Esterilizar el cuerpo del neonato con etanol al 70%.</li>
	<li>"Con fórceps y tijeras quirúrgicas de punta fina, haga una incisión entre el abdomen y patas traseras. Retire la piel tirando hacia el pie de las extremidades traseras.</li>
	<li>Raspe el tejido conectivo y el músculo adherido a los huesos con pinzas de bordes afilados.</li>
	<li>Corte la tibia y el fémur, como se muestra en la Figura 1, con unas tijeras para separar y quitar. Con fórceps, coloque estos huesos en el tubo de medios sobre hielo. Repite el proceso para cada cachorro.</li>
	<li>Transfiera los huesos con la ayuda de pinzas a un colador de 40 μm con un tubo de recolección. Triture los huesos y libere la médula presionando con un émbolo de jeringa de 3 ml contra el colador.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 350 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender las células mediante un pipeteo suave en NaCl al 0,2%, una solución hipotónica para la lisis de los eritrocitos. Agregue inmediatamente un volumen igual de 1.6% de NaCl para llevar la solución a isotónico.</li>
	<li>Centrifugar a 350 x g durante 5 min a 4 °C y retirar la solución de lisis.</li>
	<li>Vuelva a suspender en DMEM completo para uso inmediato o medios de congelación para almacenamiento y cuente las células utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. NOTA: Para el presente estudio, este método produjo 6,55 (± 1,44) × 106 células de médula ósea/pup (Figura 1E).</li>
	<li>Almacene las células a -80 °C en medios de congelación o utilícelas inmediatamente como se describe a continuación. NOTA: Debido a la edad, los huesos son transparentes y lo suficientemente claros como para visualizar la médula a través de ellos. Es importante tener cuidado al tirar de los huesos, ya que la aplicación de una ligera presión sobre ellos puede ser suficiente para liberar la médula. La médula ósea de los huesos neonatales se encuentra en forma de líquido en lugar de un hilo intacto que se encuentra en los huesos adultos. Es difícil recoger la médula si se escapa durante la recogida de los huesos.</li>
</ol>5. Diferenciación de macrófagos derivados de la médula ósea neonatal
<ol><li>Siembre 2 × 107 células de médula ósea por matraz T75 en 10 mL de DMEM completo que contiene un 10% de sobrenadante de células L929 (2,5 mL) como fuente de M-CSF. Incubar las placas de cultivo a 37 °C con 5% de CO2 durante 5 días. Agregue 2 mL de medios acondicionados con L929 en el día 3 de diferenciación.</li>
	<li>Observe las células bajo el microscopio diariamente utilizando un microscopio invertido y un sistema de imágenes con un aumento de 20x. Tras la diferenciación, los macrófagos deben aparecer adherentes, alargados y heterogéneos (Figura 2).</li>
	<li>Para recolectar los macrófagos para ensayos posteriores, aspire los medios de diferenciación.</li>
	<li>Lave las células con 5 mL de PBS para eliminar las células no adherentes y las proteínas séricas que interferirán con el desprendimiento. Aspirar el PBS.</li>
	<li>Recolectar las células añadiendo 5 mL de tripsina-EDTA al 0,05% al matraz. Coloque el matraz de cultivo a 37 °C con una incubadora de CO2 al 5% durante 5 min y añada 5 mL de DMEM.</li>
	<li>Pipetear las células a separar y centrifugar a 350 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Disociar el pellet de la célula en 1 mL de DMEM completo, y contar y comprobar la viabilidad de la célula utilizando azul de tripán. Las BMDM aisladas mediante este método son 7,05 (± 2,52) ×105 células/cría (Figura 1E). NOTA: Observe la presencia de células fusiformes que comienzan a aparecer en el segundo día de diferenciación (Figura 1B, flechas rojas). Si el color de los medios se vuelve amarillo, lo que indica que se ha gastado, agregue más medios condicionados por L929 en el día 4 de diferenciación; No se recomienda el reemplazo completo de los medios.</li>
</ol>6. Inmunomarcaje y análisis de citometría de flujo
<ol><li>Bloquee el marcaje de anticuerpos no específicos de los BMDM (2x105/etiqueta) mediante el tratamiento con 10 μL/107 células de reactivo bloqueante FcR según las recomendaciones del fabricante en un volumen de tampón de citometría de flujo de 100 μL/etiqueta (PBS suplementado con 2 mM de EDTA y 0,5% de albúmina sérica bovina). Mantener en hielo durante 10 min. NOTA: Las celdas se pueden bloquear a granel o en pocillos o tubos individuales. Todos los pasos posteriores indican cantidades y volúmenes por etiqueta de marcador celular individual a un volumen final de 100 μL.</li>
	<li>Lave las células añadiendo 200 μL de tampón de citometría de flujo y centrifugar a 525 x g durante 7 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y siembre las células en una placa de 96 pocillos con fondo en U a una densidad de 5 × 105 células por pocillo. Tiña las células añadiendo FVS780-Colorante de recuento de células vivas/muertas diluido a 3.000 veces y 0,625 μL de BV786-CD11b, PE-F4/80 y AlexaFluor488-CD206 en 100 μL de tampón de citometría de flujo, ya sea individualmente o en combinación 12,13,14,15. Incubar las células durante 45 minutos sobre hielo cubierto con papel de aluminio.</li>
	<li>Añadir 100 μL de tampón de citometría de flujo y lavar las células centrifugando a 525 x g durante 7 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y agite suavemente la célula en ráfagas. Añadir 100 μL de paraformaldehído al 0,4% a cada pocillo e incubar durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Lavar las células añadiendo 100 μL de tampón de citometría de flujo y pellet por centrifugación a 525 x g durante 7 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células en 400 μL de tampón de citometría de flujo y analice con un citómetro de flujo.</li>
</ol>7. Ensayo in vitro para evaluar la eficacia fagocítica de macrófagos derivados de la médula ósea neonatal
<ol><li>Vuelva a suspender los BMDM en DMEM completo sin rojo de fenol ni antibióticos y siembróguelos a una densidad de 2 × 105/ cuadrante en una placa cuádruple de 35 mm a un volumen de 500 μL.</li>
	<li>Para preparar el inóculo bacteriano a una multiplicidad de infección (MOI) de 25 u otro MOI deseado, retire una reserva precalculada de Escherichia coli O1:K1:H7 almacenada a -80 °C.</li>
	<li>Alícuota el volumen deseado de bacterias en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Lave las bacterias agregando PBS a un volumen total de 1 mL. Granular las bacterias por centrifugación a 2.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Repita el paso de lavado.</li>
	<li>Vuelva a suspender el gránulo bacteriano en 50 μL de PBS y agregue un colorante verde fluorescente sensible al pH hasta una concentración final de 500 μM. Se trata de un colorante sensible al pH sin señal fluorescente a pH neutro y emite fluorescencia brillante en ambientes ácidos, como los fagosomas acidificados, durante el proceso de fagocitosis.</li>
	<li>Incubar las células bacterianas durante 20 minutos en la oscuridad para la conjugación del tinte.</li>
	<li>Lavar las bacterias cuatro veces con 1 mL de PBS por centrifugación a 1000 × g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Resuspender las bacterias en 500 μL de DMEM completo sin rojo de fenol y añadir a los cultivos de BMDM.</li>
	<li>Incubar los BMDM a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 4 h y luego añadir 200 ng de un colorante fluorescente rojo permeable a las células que tiñe los lisosomas. NOTA: Las bacterias fagocíticas se pueden visualizar mediante microscopía fluorescente.</li>
</ol>

Evaluación del ensayo fagocítico de macrófagos derivados de la médula ósea neonatal 

<ol><li>Lucas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+the+bone+marrow+and+its+role+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).</li>
<li>Deb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+stem+cells+turn+into+bone+and+fat%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">How stem cells turn into bone and fat.</a> N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).</li>
<li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%3A+Aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li>
<li>Soleimani, M., Nadri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).</li>
<li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+hematopoietic+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific hematopoietic growth factors.</a> N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Translat%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Smith, A. M., Davis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+to+enhance+global+drug+development+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates.</a> Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).</li>
<li>Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+clinical+trials+for+children+and+young+people%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dis+Child%22%5BJournal%5D)">Challenges in clinical trials for children and young people.</a> Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).</li>
<li>Heap, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+characterization+of+the+L929+cell+supernatant+and+its+role+in+BMDM+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation.</a> Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957(2021).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, pub prot5080 (2008).</li>
<li>Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+bone+marrow-derived+macrophages+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.</a> J Vis Exp. (196), e64566(2023).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+An+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mac-1%3A+A+macrophage+differentiation+antigen+identified+by+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody.</a> Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).</li>
<li>Austyn, J. M., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F4%2F80%2C+a+monoclonal+antibody+directed+specifically+against+the+mouse+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage.</a> Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).</li>
<li>Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+murine+CD68%2B+CCR2%2B+and+CD68%2B+CD206%2B+lung+macrophages+in+acute+pancreatitis-associated+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury.</a> PLoS One. 7 (10), e42654(2012).</li>
<li>Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+physiological+and+pathological+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy.</a> Front Immunol. 10, 792(2019).</li>
<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+CD11c+defines+two+types+of+tissue-resident+macrophages+with+different+origins+in+steady-state+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands.</a> Sci Rep. 12 (1), 931(2022).</li>
<li>Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowing+the+immaturity+myth%3A+The+cost+of+defending+from+neonatal+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease.</a> Front Immunol. 9, 1077(2018).</li>
<li>Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+the+newborn+and+young+infant+from+infectious+diseases%3A+Lessons+from+immune+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny.</a> Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).</li>
<li>Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+characterization+of+murine+young-adult+long+bone+skeletal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358(2022).</li>
<li>Winterberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phenotypic+features+of+neonatal+murine+macrophages%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages).</a> Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).</li>
<li>de Brito Monteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF-+and+L929-derived+macrophages+present+distinct+metabolic+profiles+with+similar+inflammatory+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes.</a> Immunobiology. 225 (3), 151935(2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses relevantes para este artículo.

La investigación con modelos de ratones neonatos puede presentar una serie de desafíos. Los neonatos tienen un sistema inmunológico en desarrollo que es único en comparación con los adultos8. Como tal, no se debe asumir que los datos generados a partir de modelos animales adultos se aplican a los recién nacidos, y varios trabajos publicados han articulado bien esta idea18,19. Por lo tanto, se necesitan modelos neonatales específicos y fuentes de células para estudiar las complejidades de la respuesta inmunitaria en los primeros años de vida. Sin embargo, debido al tamaño, la sensibilidad y la naturaleza delicada de los ratones neonatos, la cantidad de muestras biológicas puede ser limitada y el proceso de recolección puede llevar mucho tiempo. Este protocolo establece un procedimiento sencillo y eficiente en el tiempo para extraer médula ósea de ratones neonatos.
Los huesos de ratón adulto son lo suficientemente grandes como para insertar una aguja y extraer fácilmente la médula. Por el contrario, el acceso a la médula ósea neonatal con una aguja es un desafío debido a su tamaño y fragilidad. Algunos estudios han empleado la digestión enzimática con colagenasa tipo II y dispasa20. Aquí, debido a la naturaleza blanda y diminuta de los huesos neonatales, adoptamos un método de trituración para liberar la médula ósea. Después de la purificación, dependiendo de la aplicación de investigación de interés, estas células se pueden diferenciar en tipos celulares específicos.
Los neonatos exhiben poblaciones fenotípicas de macrófagos distintas21. Este estudio dilucidó la diferenciación de las BMDM de las células de la médula ósea de los cachorros de 7-9 días de edad sin utilizar enzimas. Los pasos críticos involucrados en la metodología incluyen la naturaleza delicada general de las crías de ratón neonatales, la recolección de los huesos pequeños de una manera que no permita la liberación de la médula ósea y la ubicación del lugar adecuado en la tibia y el fémur para hacer cortes en tijera. Observamos que las BMDM neonatales son más sensibles que las adultas en el cultivo, y una mayor duración del aislamiento de la médula ósea de los neonatos impidió su capacidad de diferenciación. Por lo tanto, no se sugiere la extracción de más de 7 cachorros a la vez. Además, la adición de medios de diferenciación BMDM en el segundo día de diferenciación también dio lugar a malos resultados, como una diferenciación deficiente y una menor viabilidad.
Este protocolo utilizó el sobrenadante celular L929 como fuente de M-CSF para la diferenciación de células de médula ósea en macrófagos. Las células L929 son fibroblastos murinos conocidos por producir grandes cantidades de M-CSF10. Se espera que los macrófagos estén expuestos a otras sustancias secretadas en el sobrenadante L929, junto con M-CSF. El M-CSF purificado comercial también se puede utilizar para la diferenciación de macrófagos; sin embargo, no lo hemos comparado directamente con el uso del sobrenadante de cultivo L929. También es importante destacar que L de Brito Monteiro et al. observaron distintos perfiles metabólicos entre los macrófagos generados con L929 y el comercial M-CSF22.
Este método estableció un enfoque económico y que ahorraba tiempo sin el uso de enzimas digestivas. La técnica produjo un aislamiento fiable de la médula ósea neonatal que dio lugar a una clara diferenciación de las BMDM neonatales. Las BMDM neonatales aisladas pueden utilizarse para estudiar la dinámica de los macrófagos neonatales durante diversas infecciones y la regulación de la inflamación por estas células. Las limitaciones del método incluyen una curva de aprendizaje para el establecimiento inicial y la adaptación al proceso de extracción de los huesos pequeños, que eventualmente mejora con la experiencia y minimiza la duración del proceso con una mayor viabilidad de las células. El tamaño de la camada de las crías es una consideración adicional para el número de macrófagos que se pueden diferenciar según la necesidad experimental.

La médula ósea encierra poblaciones de células madre hematopoyéticas y mesenquimales que son autorrenovables y se pueden diferenciar en varios linajes celulares. Las células madre hematopoyéticas de la médula ósea dan lugar a linajes mieloides y linfoides1. Las células madre mesenquimales producen osteoblastos (hueso), adipocitos (grasa) o condrocitos (cartílago)2. Estas células tienen múltiples aplicaciones en el campo de la biología celular y la ingeniería de tejidos, incluida la terapia génica 3,4. Las células progenitoras presentes en la médula ósea se diferencian en tipos celulares específicos en presencia de factores de crecimiento específicos del linaje. La eritropoyetina promueve la proliferación de células progenitoras eritroides, el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) estimula el crecimiento de colonias de neutrófilos y la trombopoyetina regula la producción de plaquetas, como algunos ejemplos de factores de crecimiento específicos del linaje5. El FACS marcado con antígeno de superficie celular y la clasificación celular activada magnéticamente (MACS) son métodos bien establecidos para el aislamiento y la purificación de los tipos específicos de células derivadas de la médula ósea6.
Aunque los estudios neonatales están avanzando hacia la búsqueda de las causas de las muertes neonatales y el tratamiento de las complicaciones durante los partos prematuros, el desarrollo terapéutico directo sigue siendo una necesidad médica insatisfecha. Smith y Davis afirmaron: "Los pacientes pediátricos siguen siendo huérfanos terapéuticos"7. Existen varios desafíos, como muestras pequeñas, efectos de por vida del resultado y cuestiones éticas en la obtención del consentimiento en los estudios clínicos de neonatos8. Por lo tanto, existe una gran demanda de modelos de estudio in vivo e in vitro específicos para neonatos para lograr relevancia traslacional. Debido a las similitudes entre los niveles anatómicos y tisulares, los períodos de gestación cortos y el tamaño de las camadas, los roedores son el sistema modelo de mamíferos más estudiado.
Aquí, describimos un procedimiento detallado, altamente factible y reproducible para aislar médula ósea de crías de ratón de 7-9 días de edad y su capacidad para diferenciarse en macrófagos. Sin embargo, se podría lograr una variedad de linajes celulares con el uso de señales de diferenciación distintas. También demostramos la presencia de marcadores de superficie celular y la presencia de actividad fagocítica in vitro esperada para los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM).

<table><tbody><tr><td>40 y micro; colador m</td><td>Greiner</td><td>542040</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Placa inferior redonda (U) de 96 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-65</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD11b-BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>740861</td><td>Análisis FACS</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD206-Alexa Fluor488</td><td>BD Biosciences</td><td>141709</td><td>Análisis FACS</td></tr><tr><td>Anti-ratón F4/80-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>565410</td><td>Análisis FACS</td></tr><tr><td>Countess3</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSI-C3ACC</td><td>Contador celular automatizado</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>WN182</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>DPBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Escherichia coli O1:K1:H7</td><td>ATCC</td><td>11775</td><td>Infección</td></tr><tr><td>EVOS FL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12-563-649 Sistema de</td><td>Imágenes Celulares&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor&nbsp;</td><td>76419-584</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>FluoroBright BMDM</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td>Medios de cultivo sin colorantes</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Cytiva</td><td>SH30034.01</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cytiva</td><td>SH30237.01</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>L-929</td><td>ATCC</td><td></td><td>Diferenciación</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Citómetro</td></tr><tr><td>de flujo Lysotracker rojo DND 99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>Colorante fluorescente</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-010-CV</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Penicilina /estreptomicina&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>pHrodo verde STP éster&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P35369</td><td>Matraz de colorante fluorescente</td></tr><tr><td>T75</td><td>Cell star</td><td>658170</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300120</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Zeiss 710&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>P20GM103434</td><td>Confocal</td></tr></tbody></table>

aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

Varias técnicas para aislar la médula ósea de ratones adultos han sido bien establecidas. Sin embargo, aislar la médula ósea de ratones neonatos es un desafío y requiere mucho tiempo, pero para algunos modelos, es traslacionalmente relevante y necesario. Este protocolo describe un método eficiente y sencillo para preparar células de médula ósea de cachorros de 7 a 9 días de edad. Estas células se pueden aislar o diferenciar aún más en tipos específicos de células de interés. Los macrófagos son células inmunitarias cruciales que desempeñan un papel importante en la inflamación y la infección. Durante el desarrollo, los macrófagos neonatales contribuyen significativamente a la remodelación de los tejidos. Además, el fenotipo y las funciones de los macrófagos neonatales difieren de los de sus homólogos adultos. Este protocolo también describe la diferenciación de los macrófagos neonatales de las células aisladas de la médula ósea en presencia de medio condicionado con L929. Los marcadores de superficie para macrófagos neonatales diferenciados se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo. Para demostrar la funcionalidad, también se probó la eficiencia fagocítica utilizando Escherichia coli conjugada con colorante sensible al pH.

Utilizando el método descrito en este estudio, se pueden aislar con éxito de 25 a 37 millones de células de médula ósea de una camada de cinco crías de ratón C57BL/6. Este método ha sido validado con tamaños de camada que oscilan entre 5 y 7 crías. La edad mínima para el aislamiento en nuestros experimentos ha sido de 7 días. Dependiendo del tamaño de la camada y del número de células necesarias para el experimento, que es inferior a un millón, los investigadores podrían intentar este protocolo para ratones menores de 7 días de edad. En presencia de sobrenadante de células L929 como fuente de M-CSF, las células de la médula ósea se diferenciaron en macrófagos en 5 días (Figura 2). La formación de células fusiformes se observó en el segundo día de diferenciación (Figura 2B), casi la mitad de las células mostraron una forma de huso en el tercer día (Figura 2C), y la mayoría de las células se adhirieron y formaron formas de huso alargadas en el quinto día de diferenciación (Figura 2D). El rendimiento de macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) con este método fue de 2,5-5 millones de células de 5 crías de 7 días de edad.
Para caracterizar fenotípicamente las BMDMs diferenciadas, las células de cultivos de 5 días fueron inmunomarcadas para CD11b, CD206 y F4/80. En la Figura 1 se pueden ver los esquemas de dispersión frontal/lateral y de compuerta de un solo marcador. Los resultados del análisis de citometría de flujo demostraron que el 76,4% de los BMDM son positivos tanto para CD11b como para F4/80 (Figura 3A). La población de F480-CD11b+ es consistente con el número aproximado de células positivas para CD206 (Figura 3B). Este último se considera generalmente un marcador consistente con los macrófagos similares a M2, y mientras que la abundancia de etiquetado CD206 puede variar hasta dos veces más, una mayor proporción de etiquetado F4/80 es consistente con la capacidad de M-CSF para promover la diferenciación a un fenotipo similar a M116,17 (Figura 3).
Además, evaluamos la capacidad de las BMDM neonatales diferenciadas para fagocitar bacterias y transportarlas a compartimentos acidificados como medida funcional. Las bacterias marcadas con un colorante sensible al pH solo deben emitir fluorescencia verde cuando se fagocitan y se trafican a compartimentos acidificados. Se detectaron abundantes bacterias verdes fluorescentes fagocitadas en el interior de los BMDM tras la infección (Figura 4A). La fluorescencia verde se localiza aún más con fluorescencia roja indicativa de lisosomas acidificados (Figura 4B, C). También se observó la fagocitosis y la aparición de DMM neonatales sensibles al pH verde y positivas para colorantes a lo largo de las 4 h de infección (Figura 4D y vídeo complementario). La actividad funcional que se muestra aquí es consistente con la actividad de los macrófagos inflamatorios similares a M1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66613/66613fig01.jpg"> Figura 1: Aislamiento de médula ósea de crías de ratón C57BL/6J de 7 días de edad. (A) Huesos de las extremidades traseras de crías de 7 días de edad en un plato de 100 mm. (B) Extremidad trasera de un cachorro de 7 días de edad después de quitar la piel y el tejido subcutáneo; Las líneas punteadas negras indican el lugar donde se debe cortar para la extracción de la médula ósea. (C) La extremidad posterior neonatal procesó los huesos con médula antes de triturarlos. (D) La extremidad posterior neonatal procesó los huesos después de triturarlos con un émbolo de jeringa en un colador. (E) El número medio ± error estándar de células de macrófagos derivadas de médula ósea (BM) y derivadas de médula ósea obtenidas de tres experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/66613fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66613/66613fig02.jpg"> Figura 2: Diferenciación de BMDMs de células de médula ósea neonatal de 7 días de edad. Células de la médula ósea en el día 1 (A), el día 2 (B), el día 3 (C) y el día 5 de diferenciación (D). Las flechas rojas en el panel B indican células adheridas en forma de huso en el día 2 de diferenciación. Barras de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/66613fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66613/66613fig03.jpg"> Figura 3: Detección de marcadores de macrófagos murinos mediante análisis de citometría de flujo. Macrófagos diferenciados derivados de la médula ósea neonatal que muestran la expresión de los antígenos de superficie F4/80 y CD11b (A) o CD206 y CD11b (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/66613fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66613/66613fig04.jpg"> Figura 4: Fagocitosis de E. coli marcada con colorante sensible al pH por BMDM neonatales. (A) Macrófagos derivados de la médula ósea que muestran E. coli marcada con colorante sensible al pH (verde) fagocitada después de 4 h de infección. (B) BMDM marcados con tinción para lisosomas acidificados (rojo). (C) Imagen fusionada de los paneles (A) y (B). Barras de escala: 20 μm. (D) Una superposición de bacterias fluorescentes verdes sobre macrófagos mostrada en contraste de fase. El aumento en (D) es el mismo que en (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/66613fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Vídeo complementario. Un video de 4 horas de imágenes de células vivas de bacterias fluorescentes verdes por BMDM neonatales como en la Figura 4, panel A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/Annamanedi-et-al_Supplemental-Figure-2_highres.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Figura complementaria 1: Análisis de citometría de flujo de BMDM. (A) Los BMDM se cerraron por primera vez en FSC y SSC para eliminar escombros y dobletes. Se muestra la tinción única de F4/80 (B), CD11b (C) y CD206 (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66613/Supplemental%20Figure%201%20v2.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...

El objetivo de este estudio es comprender algunas de las limitaciones de la respuesta inmunitaria en los primeros años de vida a la infección bacteriana. Para lograr esto, necesitamos desarrollar y utilizar modelos de investigación que sean específicos para los recién nacidos. El aislamiento de la médula ósea de un cachorro de siete días es difícil y no está bien establecido.Los macrófagos derivados de la médula ósea neonatal son sensibles y propensos al estrés en comparación con otros BMDM. La técnica utilizada en este protocolo es sencilla y reproducible. Este método guía a los usuarios en el aislamiento de la médula ósea de ratones neonatos de siete a nueve días de edad sin el uso de ninguna enzima.Este estudio proporciona una estrategia estandarizada para generar macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones neonatos que se puede utilizar para abordar preguntas sobre inmunología neonatal. Este método reproducible proporciona un modelo específico por edad para avanzar en la investigación inmunológica neonatal en muchas áreas de especialización.

neonatal-mouse-bone-marrow-isolation-preparation-bone-marrow-derived

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Los macrófagos juegan un papel central en la homeostasis y la patología en muchos tejidos. El protocolo presentado aquí se describen métodos para agotar los...

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

En este video, demostramos la activación de macrófagos derivados de la médula ósea en respuesta al lipopolisacárido bacteriano y la inmunoglobulina intravenosa.

Activación de macrófagos derivados de la médula ósea de ratón en respuesta a anticuerpos

El artículo describe una adaptación fácil...

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Los macrófagos han sido reconocidos como un componente crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa. La reciente explosión de conocimientos relativos a los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de la interacción entre los macrófagos y los microbios ha renovado la atención científica a los macrófagos. Este artículo describe un método para diferenciar los macrófagos de médula ósea de ratón.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Medicamentos a base de anticuerpos han revolucionado el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Además de tener efectos directos sobre objetivos específicos, anticuerpos pueden activar macrófagos a ser antiinflamatorias. Este protocolo describe cómo antiinflamatorio macrófago activación puede ser evaluado in vitro, utilizando los macrófagos de la médula ósea de ratón y en vivo, con los macrófagos peritoneales.

Evaluación de los efectos de drogas basados en anticuerpos en médula ósea murina y activación de los macrófagos peritoneales

Demostramos cómo identificar y aislar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de médula murine usando una combinación de magnético y fluorescencia clasificación (MACS y FACS). Este protocolo puede ser utilizado para RNA/proteína análisis, experimentos de transferencia adoptiva en vivo y en vitro ensayos de cultura (culturas de la pastilla o líquido).

Identificación y aislamiento de Oligopotent y linaje comprometido progenitores mieloides de la médula ósea de ratón

En este artículo, nos proporcionan que un protocolo detallado para la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en médula ósea murina derivados de macrófagos y células dendríticas. El método se basa en la transducción de la médula ósea progenitores con retrovirales construcciones seguidas de diferenciación en macrófagos y dendríticas de las células en vitro.

Expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos

Este protocolo se ha establecido para cultivar macrófagos murinos primarios deficientes en tetrahidrobiopterina (BH4) y óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) para estudiar la biología del NO-redox. El estudio se centra en reducir la contaminación potencial de BH4 y otros artefactos encontrados en los métodos tradicionales de aislamiento y cultivo que pueden confundir los resultados experimentales y la interpretación de los resultados.

Aislamiento y cultivo in vitro de macrófagos derivados de la médula ósea para el estudio de la biología NO-redox

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Aprenda a aislar médula ósea de ratones neonatales y generar macrófagos derivados mediante técnica no enzimática. Este método reproducible permite estudiar respuestas inmunes tempranas en investigación neonatal.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Explorar más videos