Name: Cultivo de esferoides desmoplásicos tridimensionales de cáncer de páncreas a partir de cocultivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Aprenda a generar esferoides desmoplásicos tridimensionales mediante cocultivo para investigación del cáncer de páncreas. Este modelo reproducible replica el microambiente tumoral clínico y permite evaluar respuestas terapéuticas.

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1. Cultivo celular 2D
<ol><li>Cultive células PANC-1 en el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco, complementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) en condiciones estériles. Crezca hasta un 70%-80% de confluencia antes de los pasajes, y no lo use más allá del20º paso. Consulte el proceso descrito en el paso 4.2.1. NOTA: Como punto de referencia, 1 x 106 células en 20 mL de medio necesitan unos 2-3 días para alcanzar una confluencia del 70-80%.</li>
	<li>Cultive células HPaSteC en medios de células estrelladas suplementadas con un 2 % de FBS, un 1 % de PenStrep y un 1 % de suplemento de crecimiento de células estrelladas (SteCGS) utilizando el kit suministrado por el fabricante en condiciones estériles. Crezca de acuerdo con las instrucciones del fabricante (con algunas modificaciones) como se muestra en el paso 4.2.2 en un matraz recubierto de Poly-L-Lisina.<ol><li>Omita el paso de neutralización de FBS durante la tripsinización del protocolo del fabricante, ya que se utiliza la solución de neutralización de tripsina (TNS). Neutralizar la suspensión celular con un volumen total de 10 mL de TNS, como se describe en el paso 4.2.2.2. NOTA: Como punto de referencia, 0,5 x 106 células y 1 x 106 células en 20 mL de medio necesitan 3 días y 2 días, respectivamente, para alcanzar una confluencia del 90%.</li>
		<li>Recolecta células al 90% de confluencia. No use celdas más allá del pasaje 7.</li>
	</ol></li>
	<li>Mantener las células a 37 °C, con 5% de CO2, en incubadoras estériles con humedad relativa del 90%-95%. Realizar todos los estudios de cultivo celular en un matraz T-75.</li>
</ol>2. Recubrimiento de solución de poli(2-hidroxietilato de metacrilato (poli-HEMA) para placa de 96 pocillos
<ol><li>Prepare la solución de poli-HEMA a 5 mg/mL con etanol al 95% dejando que se mezcle durante la noche con un agitador calentado a 37 °C. (por ejemplo, 500 mL de solución necesitan 2,5 g de poly-HEMA)<ol><li>Marque la ubicación del volumen de inicio antes de agregar el agitador. Use etanol al 95% para compensar cualquier pérdida en la solución al día siguiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrar la solución final en una campana estéril con un filtro de 0,22 μm y guardarla en la nevera a 4 °C. NOTA: Poly-HEMA se utiliza para aumentar la hidrofobicidad de una superficie, lo que sirve como elemento disuasorio para que las células se adhieran. Dado que este estudio requiere que las células no se adhieran a los pocillos y crezcan como una monocapa, el poli-HEMA se utiliza como un elemento disuasorio adicional a la característica natural de baja adherencia de las placas, lo que las convierte en placas de fijación ultrabaja.</li>
	<li>Agregue 50 μL de la solución fría a cada pocillo de una placa de micropocillo redonda de poliestireno con fondo de 96 pocillos dentro de una campana de cultivo celular para recubrir la placa.</li>
	<li>Deje los pocillos con la tapa puesta en un horno de aire caliente a 37 °C durante 3 días para asegurarse de que las placas estén completamente secas.</li>
	<li>Esterilizar las placas con UV durante 30 min en la campana de cultivo celular antes de la siembra celular. Guárdelo en un cierre hermético para almacenamiento a largo plazo y esterilícelo antes de usarlo.</li>
</ol>3. Planificación del cultivo celular en 2D
<ol><li>Cronometre el experimento para que las células PANC-1 estén disponibles con una confluencia del 70%-80% el mismo día que las células HPaSteC alcancen el 90%. NOTA: Los viales que contienen alrededor de 1 millón de células de PANC-1 o HPaSteC, cuando se elevan a partir de nitrógeno líquido el mismo día, con alguna variación, requieren 8 días de cultivo de PANC-1 y 6-7 días de cultivo de HPaSteC para tener ambas líneas celulares listas el mismo día.</li>
</ol>4. 3D crecimiento de la cultura
<ol><li>Consulte la descripción general de todo el proceso en la Figura 1 antes de iniciar el proceso. ATENCIÓN: Tanto PANC-1 como HPaSteC son de origen biológico. Manipule PANC-1 (línea celular cancerosa) con cuidado.</li>
	<li>Trypsinzing y recuento de células<ol><li>Tripsinze y recuento de células PANC-1:<ol><li>Deseche el sobrenadante y lave las células PANC-1 con 9 mL de HBSS (3 mL a la vez). Deseche los reactivos usados en la campana en una solución de lejía al 20-25% V/V para garantizar la muerte completa del material vivo/viable.</li>
			<li>Tripsinizar las células con 2 mL de tripsina. Después de casi 10 min (puede necesitar más tiempo), cuando todas las células estén separadas, neutralice la suspensión con 10 mL de DMEM + 10% de FBS. Comience con 3 ml y siga con los pasos de lavado posteriores usando 1 ml por lavado (7 lavados restantes) para garantizar la máxima recolección de células tripsinizadas.</li>
			<li>Agrupe cada alícuota neutralizada en el mismo tubo de 15 mL. El volumen final en el tubo estará cerca de 12 mL (~2 mL de tripsina que se ha neutralizado con un medio de 10 mL).</li>
			<li>Centrifugar la suspensión de celda neutralizada a 700 x g durante 2 min y 30 s. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet obtenido en 1 mL de DMEM +10% FBS. Tome una alícuota de esto para el recuento de celdas y etiquete el valor obtenido de esta sección como "Recuento A".</li>
		</ol></li>
		<li>Tripsinze y recuento de células HPaSteC.<ol><li>Deseche el sobrenadante y lave las células HPaSteC con 9 mL de HBSS (3 mL a la vez).</li>
			<li>Tripsinizar las células con 2 mL de tripsina. Después de casi 10 minutos, cuando todas las células estén desprendidas, neutralice la suspensión con 10 mL de solución de neutralización de tripsina. Comience con 3 ml y siga con los pasos de lavado posteriores usando 1 ml por lavado (7 lavados restantes) para garantizar la máxima recolección de células tripsinizadas.</li>
			<li>Agrupe cada alícuota neutralizada en el mismo tubo de 15 mL. El volumen final en el tubo estará cerca de 12 mL (~2 mL de tripsina que ha sido neutralizada con 10 mL de solución neutralizante).</li>
			<li>Centrifugar la suspensión de celda neutralizada a 700 x g durante 2 min y 30 s. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet obtenido en 1 mL del medio celular estrellado suplementado. Tome una alícuota de esto para el conteo de celdas y etiquete el valor obtenido de esta sección como "Recuento B".</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Dilución de suspensiones celulares iniciales<ol><li>Haga una pausa en este paso si es necesario (no más de 0,5 h) durante un breve período de tiempo después de obtener ambos recuentos A y B o después de intentar tripsinizar y neutralizar tanto PANC-1 como HPaSteC. Mantenga los medios de cultivo no utilizados a 37 °C y las suspensiones celulares a temperatura ambiente (RT; 25 ± 2 °C).</li>
		<li>Utilice el Recuento A y el Recuento B obtenidos anteriormente, para tomar alícuotas y realizar las diluciones respectivas (en tubos separados) de modo que el volumen final sea de 1 mL (diluyente: DMEM + 10% FBS para ambos viales) y el recuento final esté entre 110.000-140.000 células para cada tipo de célula. Una vez realizada esta dilución, se verifican los recuentos de células de cada dilución para dar el recuento C (PANC-1) y el recuento D (HPaSteC).</li>
		<li>Haga una pausa en este paso si es necesario (no más de 15-30 minutos) después de obtener el recuento C y el recuento D. No se detenga una vez que se hayan realizado las diluciones finales en el paso 4.3.3.2; Experimente para evitar la sedimentación de las células. Mantenga los medios de cultivo no utilizados a 37 °C y las suspensiones celulares a RT (25 ± 2 °C).<ol><li>Mantenga el número final de celdas necesarias por pocillo en HPaSteC: PANC-1: 60:120. Utilice 110 pozos para el cálculo a fin de tener en cuenta el exceso. Calcule con un valor base de 100 μL de suspensión de celda por pocillo (el volumen total de suspensión es de 11 mL para 110 pocillos con HPaSteC: PANC-1: 60:120). Prepare esta suspensión en un tubo de centrífuga estéril de 50 ml para facilitar la mezcla.</li>
			<li>Utilice el recuento C y el recuento D, y agregue suficiente suspensión celular en una solución DMEM + 10% FBS para tener HPaSteC: PANC-1: 60:120 en un volumen final de 11 mL (6.600 células HPaSteC y 13.200 células PANC-1 en 11 mL). Mezcle bien la solución con una pipeta de 1 ml agitando y pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Evite la formación de espuma.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Siembra<ol><li>Utilice una pipeta de 200 μL o 100 μL para mezclar la suspensión final (agite moviendo la punta de la pipeta combinada con el pipeteo hacia arriba y hacia abajo) en cada paso antes de añadir 100 μL de la suspensión por pocillo. Agregue los 100 μL suavemente a lo largo de la esquina del pocillo.<ol><li>Vuelva a utilizar la misma punta para varios pozos a menos que se caiga. Mezcle de un lado a otro y cuente hasta 10 o 15 (no segundos) entre las adiciones a cada pocillo para la primera mitad (aproximadamente los primeros 43 pocillos) del plato. Reduzca el conteo de mezcla a 5-10 entre cada pocillo para la segunda mitad (43 pocillos restantes) ya que el volumen de suspensión es menor y requiere menos duración de mezcla.</li>
			<li>No utilice una pipeta de repetición, ya que el recubrimiento hidrofóbico de poli-HEMA hará que la suspensión rebote en la placa, lo que provocará una distribución desigual.</li>
		</ol></li>
		<li>Deseche cualquier exceso de suspensión después de que se hayan llenado todos los pozos.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugación<ol><li>Centrifugar la placa final que contiene la suspensión celular para juntar todas las celdas como un pellet. Envuelva cuidadosamente la placa con parafilm alrededor del borde de la placa para evitar la contaminación durante este paso. Después del envolteado, centrifugar la placa con un contrapeso a 1000 x g durante 2 min.</li>
		<li>Vuelva a colocar la placa en la campana de cultivo celular (use guantes rociados con etanol para manipularla), retire el parafilm y guarde las placas en la incubadora a 37 °C, con 5% de CO2. No rocíe la placa con una mezcla de etanol y agua en ningún momento.</li>
	</ol></li>
	<li>Mantenimiento de la cultura<ol><li>Observe las células que se unen para formar esferoides bajo un microscopio óptico con un aumento de 4x-5x en el día 3. Siga el protocolo de mantenimiento del cultivo como se describe a continuación.<ol><li>El día 3, mida 5-6 mL de DMEM + 10% de FBS y agregue 50 μL a cada pocillo a lo largo del costado del pocillo.<ol><li>No mezcle ni agite el medio de ninguna manera durante la adición, ya que esto dañará el esferoide o provocará una extracción accidental del esferoide. El volumen final por pocillo será de ~150 μL.</li>
			</ol></li>
			<li>Más allá del día 3, consulte la Figura 2 para familiarizarse con la estructura del pozo y la ubicación de la reflexión de la luz (entre la parte cilíndrica y curva del pozo) que se ve en el medio conocido como halo. Realice operaciones cerca del halo con precaución para asegurarse de que los esferoides permanezcan intactos.</li>
			<li>El día 6, mida 10-11 mL de DMEM + 10% FBS. Utilice una pipeta de 1 ml para extraer los medios a granel de varios pocillos extrayendo los medios hasta el halo. Haga esto para toda la placa, seguido de un reemplazo de medios. Recoja el sobrenadante a granel y deséchelo, o deséchelo a medida que lo extrae.</li>
			<li>Reemplace el medio desechado con medio nuevo agregando 100 μL de medio a lo largo del costado de cada pocillo. El volumen final en el pozo será cercano a los 200 μL.<ol><li>No tire de los medios más allá del halo, ya que aumenta el riesgo de extraer accidentalmente el esferoide.</li>
			</ol></li>
			<li>El día 10/11, mida 10-11 mL de DMEM + 10% FBS. Utilice una pipeta de 1 ml para extraer los medios a granel de varios pocillos extrayendo los medios hasta el halo. Haga esto para toda la placa, seguido de un reemplazo de medios. Recoja el sobrenadante a granel y deséchelo, o deséchelo a medida que lo extrae.</li>
			<li>Reemplace el medio desechado con medio nuevo agregando 100 μL de medio a lo largo del costado de cada pocillo. El volumen final en el pozo será cercano a los 200 μL.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Evaluación del último día<ol><li>Realizar un tratamiento farmacológico con los esferoides el día 14. Tome imágenes de los esferoides antes de su uso utilizando un microscopio invertido de campo claro bajo un objetivo 4x para determinar el volumen inicial del esferoide. Calcule el volumen (V) utilizando la siguiente fórmula: V = 0,5 × L × W2</li>
		<li>Siga la ecuación para calcular los volúmenes de esferoides que se describe anteriormente. Aquí L es la longitud del eje mayor, y W es el ancho (la línea más larga perpendicular al eje mayor). Convierte todas las unidades originales de micrómetros a milímetros para obtener un volumen en milímetros cúbicos.</li>
		<li>El volumen inicial en cada pocillo en el día 14 está entre 150-200 μL debido a la evaporación. Para tratamientos farmacológicos, retire los medios hasta alcanzar el halo de cada pocillo y reemplácelos con 100 μL de la solución del fármaco con una concentración 2x, junto con una mezcla suave (mezcle los medios suavemente de un lado a otro mientras cuenta hasta 2 entre cada pocillo).<ol><li>Utilice soluciones de concentración 2x para permitir que la solución final del fármaco esté a 1x y para evitar eliminar completamente los medios viejos de los pocillos, de lo contrario, los esferoides pueden ser perturbados. Use los esferoides dentro de los 3 días posteriores a este período de tiempo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Colección de esferoides<ol><li>Mida los volúmenes de esferoides antes de la recolección como se describe en el paso 4.7.2.</li>
		<li>Recoja los esferoides el día 14 o 17, dependiendo de las necesidades del experimento, retirando los medios de cada pocillo hasta alcanzar el halo.</li>
		<li>Utilice una pipeta de 1 mL para extraer el medio y recoger el sobrenadante en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL de varios pocillos.</li>
		<li>Una vez que todos los pocillos tengan medios a nivel de halo, reduzca el ajuste de la pipeta de 1 ml a entre 200 y 300 μl.</li>
		<li>Alinee la placa contra el fondo de la campana o un fondo oscuro (por ejemplo, un bastidor de tubos) para ver los esferoides asentados en la parte inferior.</li>
		<li>Inserte suavemente la punta cerca del esferoide (vaya por debajo del halo) y pipetee una pequeña cantidad de medio (por ejemplo, una estimación visual de cerca de 50 μL) hacia adelante y hacia atrás para alterar el esferoide. No coloque la punta directamente sobre el esferoide, ya que esto puede dañar su estructura.<ol><li>No saque todos los medios del pozo en este paso. Controle firmemente el movimiento del pulgar en el pistón de la pipeta.</li>
		</ol></li>
		<li>Desplaza los medios hasta que el esferoide ya no permanezca en el centro y se pueda ver moviéndose contra el fondo. Levante suficiente medio para succionar el esferoide y moverlo a la ubicación deseada (p. ej., agruparlo con otros esferoides en un pozo que sea parte del mismo conjunto de tratamiento).</li>
	</ol></li>
	<li>Descarte de residuos<ol><li>Deseche todas las muestras líquidas una vez neutralizadas con lejía de acuerdo con los protocolos del Departamento de Medio Ambiente y Seguridad Sanitaria de los laboratorios respectivos. Esteriliza en autoclave y desecha todas las pipetas y matraces usados con residuos biopeligrosos.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general del proceso para cultivar esferoides de cáncer de páncreas desmoplásicos en 3D (generado con BioRender). La figura ofrece una descripción general de los procesos básicos involucrados; Es decir, tripsinzar las células, utilizar el recuento inicial de células para hacer suspensiones celulares diluidas, preparar un cocultivo utilizando las suspensiones celulares diluidas, añadir suspensiones celulares a cada pocillo, incubar los cultivos, realizar el mantenimiento de los medios y la formación final de esferoides como se esperaba el día 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig02.jpg"> Figura 2: Estructura del pozo de fondo U. La imagen de la derecha es una forma exagerada para demostrar la parte del "halo" del pozo. La figura tiene como objetivo definir dónde se encuentra la parte del "halo" del pozo, ya que trabajar por encima del halo es fundamental para el crecimiento de los esferoides y evitar pérdidas accidentales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
5. Evaluación de componentes de ECM y microscopía confocal
<ol><li>Utilizar la inmunotinción para evaluar la respuesta de la MEC al tratamiento farmacológico según el protocolo descrito por Durymanov et al.38.<ol><li>Agrupar los esferoides y lavar dos veces con 100 μL de PBS. Incrustar en un medio de inclusión de tejido a temperatura óptima de corte (OCT), congelar y mantener a -80 °C.</li>
		<li>Corte los bloques tumorales congelados en secciones de 10 μm, fije las secciones en una mezcla de acetona y metanol (1:1) durante 15 minutos y deje que se sequen al aire en RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Para determinar los componentes de la MEC, inmunotiñir las criosecciones con anticuerpos primarios monoclonales anti-fibronectina de conejo, anticuerpos policlonales de colágeno anti-tipo I de conejo, anticuerpos anti-laminina policlonales de conejo y anticuerpos policlonales anti-ácido hialurónico de oveja.</li>
	<li>Use IgG anticonejo de cabra marcada con Alexa Fluor 488 o anti-oveja de burro conjugada con Alexa Fluor 568 como anticuerpos secundarios. NOTA: Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron a 1:200 y 1:300, respectivamente.</li>
	<li>Adquiera imágenes de todas las secciones de esferoides utilizando un microscopio de escaneo láser confocal equipado con una lente de objetivo de 20x/0,45.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Modelo 3D-PDAC que captura la desmoplasia para su evaluación terapéutica

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<li>Giustarini, G., Teng, G., Pavesi, A., Adriani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+3D+heterocellular+spheroids+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+for+the+study+of+cell+interactions+in+the+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Characterization of 3D heterocellular spheroids of pancreatic ductal adenocarcinoma for the study of cell interactions in the tumor immune microenvironment.</a> Front Oncol. 13, 1156769(2023).</li>
<li>Alseud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+activity+of+11-oxygenated+and+heterocyclic+estrone+analogs+in+pancreatic+cancer+monolayers+and+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological activity of 11-oxygenated and heterocyclic estrone analogs in pancreatic cancer monolayers and 3D spheroids.</a> Bioorg Med Chem. , (2024).</li>
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<li>Wishart, G., Gupta, P., Schettino, G., Nisbet, A., Velliou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+models+as+tools+for+radiotherapy+screening+for+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">3D tissue models as tools for radiotherapy screening for pancreatic cancer.</a> Br J Radiol. 94 (1120), 20201397(2021).</li>
<li>Peirsman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MISpheroID%3A+a+knowledgebase+and+transparency+tool+for+minimum+information+in+spheroid+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity.</a> Nat Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).</li>
<li>Durymanov, M., Kroll, C., Permyakova, A., Reineke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endocytosis+in+nanoparticle+penetration+of+3D+pancreatic+cancer+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Role of endocytosis in nanoparticle penetration of 3D pancreatic cancer spheroids.</a> Mol Pharm. 16 (3), 1074-1082 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microscopio invertido Axio Observer</td><td>Carl Zeiss</td><td>0450-354</td><td></td></tr><tr><td>Celómetro Auto T4</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Auto-T4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, polvo, alta glucosa</td><td>Gibco</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-ovejas conjugado con Alexa Fluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175712</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>SH3091003HI</td><td></td></tr><tr><td>IgG anticonejo de cabra marcada con Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Solución salina equilibrada (HBSS)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175145</td><td></td></tr><tr><td>Células Estrelladas Pancreáticas Humanas (HPaSteC)</td><td>Microscopio ScienCell</td><td>3830</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Nikon</td><td>Nikon Eclipse</td><td>Ts 100</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96-Pocillos Poliestireno Placas de Micropocillos de Fondo Redondo</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-331</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview FV1200 láser confocal</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Producto</td></tr> <tr>descatalogado<td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>Poly-HEMA</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos policlonales anti-laminina de conejo&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab11575</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos policlonales de colágeno anti-tipo I de conejo&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos policlonales de ácido hialurónico para ovejas</td><td>Abcam</td><td>ab53842</td><td></td></tr><tr><td>Kit completo de medios de células estrelladas&nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>5301</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>153571</td><td>solución de tripsina preparada de acuerdo con el protocolo del fabricante y utilizada al 0,25%w/v&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de neutralización de tripsina (TNS)</td><td>ScienCell</td><td>103</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo de esferoides desmoplásicos tridimensionales de cáncer de páncreas a partir de cocultivo

Growing Desmoplastic Three-Dimensional Pancreatic Cancer Spheroids from Co-Culture

Tres de los pasos más críticos involucrados en el crecimiento de los esferoides son el recuento inicial de células, los pasos de mezcla durante la siembra de los esferoides y la realización de cambios oportunos en los medios para permitir que los esferoides crezcan (Figura 1). Además, es fundamental estar familiarizado con la Figura 2 sobre los cambios de medios después del día 3 para permitir cambios de medios efectivos debido al aumento del volumen de medios por pocillo. Cuando todos estos pasos se realizan de acuerdo con las instrucciones dadas, se encuentra que los esferoides (Figura 3) crecen hasta un volumen promedio de 0,048 ± 0,012mm3 (451 μm x 462,84 μm) (Figura 4). Se han encontrado casos en los que las células pueden crecer mejor, lo que lleva a volúmenes promedio iniciales más grandes de 0,096 ± 0,014 mm3 (611 μm x 560 μm) en el día 14. Una variedad de razones pueden llevar a que los esferoides tengan volúmenes iniciales más grandes, como el mantenimiento de la temperatura y la humedad de la incubadora o el uso de pasajes celulares más tempranos, que tienen una vitalidad ligeramente mejorada en comparación con los pasajes posteriores.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig03.jpg"> Figura 3: Un esferoide representativo visto en el día 14 (tamaño: 451,59 μm x 462,84 μm). Barra de escala = 200 μm. Cada esferoide se mide a lo largo de su eje más largo y más corto, respectivamente, y se utiliza la ecuación descrita en la sección de métodos para calcular el volumen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig04.jpg"> Figura 4: Progreso del crecimiento de los esferoides a lo largo de 17 días. Las placas 1 y 2 son réplicas. Las barras de error representan la desviación estándar. La figura se puede utilizar como una estimación aproximada de los volúmenes de esferoides que se pueden ver en los días 6, 10, 14 y 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Sin embargo, en los casos en que las células no se cuentan correctamente o cuando la suspensión celular no se mezcla completamente, o el cultivo final no se mantiene regularmente, o se produce una combinación de estos errores, puede conducir al desarrollo de esferoides más pequeños o esferoides incompletamente desarrollados. También se observaron esferoides con apariencias similares cuando los estudios iniciales de optimización solo complementaron los medios en los pozos alrededor de la periferia de la placa en el día 3 en lugar de toda la placa (Figura 5). Alternativamente, en los casos en que las células no se mezclan bien, o los errores iniciales de conteo/dilución conducen a la siembra de más células por pocillo de lo recomendado, se pueden observar múltiples esferoides por pocillo. Un hallazgo similar se observó cuando se utilizaron células PANC-1:HPaSteC en una proporción de 240:120 (Figura 6). Esto también se puede ver ocasionalmente cuando los esferoides crecen en cada dirección, pero tales esferoides son menos en número (por ejemplo, 4/96 pocillos pueden contener dos esferoides por pocillo en lugar de uno). En los casos en que se encuentren múltiples esferoides, evite usar los pozos con múltiples esferoides o tome notas de los cambios en los volúmenes cuando se traten estos esferoides. Los cambios de medio inadecuados en los que la punta de la pipeta se sumerge por debajo del halo (Figura 1) también pueden provocar la pérdida accidental de los esferoides.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig05.jpg"> Figura 5: Una imagen representativa de un esferoide mal crecido en el día 14. Barra de escala = 200 μm. Aquí, las celdas no se han agregado bien, por lo que se vuelve difícil medir la longitud y el ancho del esferoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig06.jpg"> Figura 6: Una imagen representativa de un pozo que contiene dos esferoides mal desarrollados, como se ve el día 14. Barra de escala = 200 μm. Aquí, uno de los esferoides tiene un tamaño de 246,61 μm x 178,31 μm y el otro de 289,13 μm x 252,35 μm. Este es un ejemplo en el que es probable que haya un problema con las diluciones iniciales o con la calidad de las células que se utilizaron para iniciar el experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los esferoides también desarrollan una MEC con cuatro de los componentes primarios de la MEC: colágeno-I, laminina, ácido hialurónico y fibronectina. En estudios que el laboratorio ha publicado anteriormente, se ha demostrado la ventaja del cocultivo sobre PANC-1 solo en términos de esferoides de homo PANC-1 que muestran colágeno difuso, sin fibronectina y con menor deposición de ácido hialurónico.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig07.jpg"> Figura 7: Imagen representativa de los cuatro componentes primarios de la MEC vistos en el día 17 en esferoides no tratados: colágeno I, laminina, ácido hialurónico y fibronectina. Estas imágenes se obtienen después de la inmunotinción de criosecciones del esferoide. El brillo de estas imágenes se ha incrementado uniformemente para ayudar a resaltar las diferencias en la apariencia. Las áreas donde el tejido está dañado o faltante deben ajustarse mientras se realizan las mediciones de intensidad. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Cultivo de esferoides desmoplásicos tridimensionales de cáncer de páncreas a partir de cocultivo

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest cancers with a 5-year survival rate of &#60;12%. The biggest barrier to therapy is the ...

growing-desmoplastic-three-dimensional-pancreatic-cancer-spheroids

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Un método simple se describe para analizar los efectos de los fibroblastos del tejido en las células epiteliales asociados. La combinación de este método y tridimensional cultivo de tejidos puede facilitar el análisis de las células después del aislamiento de 3D. La técnica es aplicable a las células de diferentes potencial maligno, permitiendo el estudio sistemático de los efectos de estroma asociado al tumor en las células tumorales.

Aislamiento de células epiteliales mamarias de tridimensional mixto de células Esferoide Co-cultura

Este vídeo explica la bioimpresión magnética en 3D de células de cáncer de páncreas y fibroblastos cocultivados. Las células de cáncer de páncreas y las células de fibroblastos pancreáticos activados se cocultivan y magnetizan utilizando un ensamblaje de nanopartículas biocompatibles, para generar esferoides, bajo la influencia de fuerzas magnéticas.

Cocultivos de esferoides 3D bioimpresos magnéticamente: un método para el cocultivo de células cancerosas y fibroblastos

Este video muestra un método para establecer un cocultivo tridimensional de esferoide tumoral y células T. Se prepara un molde de agarosa con micropocillos que contienen esferoides tumorales, seguido de la adición de células T. Después de la incubación, esta configuración permite estudiar la interacción de las células T con los esferoides tumorales en un entorno tridimensional controlado.

Un modelo de cocultivo tridimensional de células T infiltrantes en esferoides tumorales

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Aquí, se describe un método para la preparación de la cultura de co de 3 dimensiones (3D) esferoide de células de cáncer de páncreas y fibroblastos, seguidos por la medida de las funciones metabólicas utilizando un analizador de flujo extracelular.

Preparación y análisis metabólico de 3 dimensiones del esferoide co-cultivos de células de cáncer de páncreas y fibroblastos

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Este protocolo presenta un sistema nuevo, robusto, y reproducible de la cultura para generar y para crecer esferoides tridimensionales de las células de la adenocarcinoma de los dos puntos Caco2. Los resultados proporcionan la primera prueba de concepto de la idoneidad de este enfoque para estudiar la biología de las células madre cancerosas, incluida la respuesta a la quimioterapia.

Un modelo tridimensional de esferoides para estudiar las células madre del cáncer de colon

Faltan modelos integrales in vitro que recapitulen fielmente la enfermedad humana relevante. El presente estudio presenta la creación y cultivo de esferoides tumorales tridimensionales (3D), una herramienta in vitro fiable para estudiar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular humano.

Un modelo esferoide tridimensional para investigar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular

El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Este estudio presenta una metodología rentable y eficiente para generar estructuras celulares en 3D utilizando un sistema basado en sellos para crear micropocillos en moldes de agarosa. El sistema promueve la formación de esferoides/organoides uniformes, mejorando así las interacciones celulares. Este enfoque reduce la variabilidad experimental y apoya las aplicaciones en pruebas de fármacos e ingeniería de tejidos.

Generación de esferoides/organoides tridimensionales a partir de cultivos celulares bidimensionales utilizando un novedoso dispositivo de estampado

Aprenda a generar esferoides desmoplásicos tridimensionales mediante cocultivo para investigación del cáncer de páncreas. Este modelo reproducible replica el microambiente tumoral clínico y permite evaluar respuestas terapéuticas.

Cultivo de esferoides desmoplásicos tridimensionales de cáncer de páncreas a partir de cocultivo

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