Name: Construcción de redes metabólicas fuera de equilibrio en vesículas de tamaño nanométrico y micrométrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprende a construir redes metabólicas fuera de equilibrio en vesículas de tamaño nanométrico y micrométrico mediante reconstitución de proteínas de membrana y encapsulación de enzimas. Este protocolo avanza hacia células sintéticas capaces de crecimiento autónomo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen a Aditya Iyer por la clonación del gen pBAD-PercevalHR y a Gea Schuurman-Wolters por ayudar con la producción y purificación de proteínas. La investigación fue financiada por el programa de Gravitación del Nuevo Orden Mundial "Construyendo una Célula Sintética" (BaSyC).

Protocolo de encapsulación de vesículas lipídicas para redes complejas de proteínas

<ol><li>Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+bottom-up+assembly+of+molecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems.</a> Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).</li>
<li>Ivanov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+synthesis+of+artificial+cells%3A+recent+highlights+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges.</a> Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).</li>
<li>Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industrial+biomanufacturing%3A+The+future+of+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Industrial biomanufacturing: The future of chemical production.</a> Science. 355 (6320), (2017).</li>
<li>Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+synthetic+biology+platform+for+emerging+industrial+biomanufacturing%3A+Bottom-up+pathway+design%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Syst+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design.</a> Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).</li>
<li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-target+and+glucose-responsive+polymersomes+toward+mimicking+endogenous+insulin+secretion+with+improved+hepatic+glucose+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization.</a> Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168(2020).</li>
<li>Kanter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+production+of+scFv+fusion+proteins%3A+an+efficient+approach+for+personalized+lymphoma+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines.</a> Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).</li>
<li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology and personalized medicine.</a> Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).</li>
<li>Schwille, P., Frohn, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+protein+functions+and+what+they+may+teach+us%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hidden protein functions and what they may teach us.</a> Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).</li>
<li>Sachsenmeier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industry+5.0-The+relevance+and+implications+of+bionics+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology.</a> Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).</li>
<li>Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).</li>
<li>Godoy-Hernandez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+stable+membrane+reconstitution+by+LAiR+enables+the+study+of+physiological+integral+membrane+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions.</a> ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).</li>
<li>Sikkema, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+by+ionic+strength+and+safety+check+by+cyclic-di-AMP+in+the+ABC+transporter+OpuA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA.</a> Sci Adv. 6 (47), 7697(2020).</li>
<li>Foucaud, C., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactose+transport+system+of+Streptococcus+thermophilus.+Functional+reconstitution+of+the+protein+and+characterization+of+the+kinetic+mechanism+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport.</a> J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).</li>
<li>Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+on+solubilization+and+lipid+reconstitution+of+Na%2CK-ATPase%3A+enzyme+kinetic+and+biophysical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization.</a> Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).</li>
<li>Simidjiev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+large%2C+ordered+lamellae+from+non-bilayer+lipids+and+integral+membrane+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).</li>
<li>Harris, N. J., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+and+stability+of+membrane+transport+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Folding and stability of membrane transport proteins in vitro.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).</li>
<li>Jackson, M. L., Litman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-egg+phosphatidylcholine+reconstitution+by+an+octyl+glucoside+dilution+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).</li>
<li>Szoka, F., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+preparation+of+liposomes+with+large+internal+aqueous+space+and+high+capture+by+reverse-phase+evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation.</a> Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).</li>
<li>Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1">https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1</a> (2023).</li>
<li>Lee, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+artificial+organelles+sustain+and+control+ATP-dependent+reactions+in+a+protocellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system.</a> Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).</li>
<li>Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%A9l%C3%A9ard%2C+P+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. , Elsevier. 161-176 (2009).</li>
<li>Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+transmembrane+protein%2C+the+voltage-gated+ion+channel%2C+KvAP%2C+into+giant+unilamellar+vesicles+for+microscopy+and+patch+clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies.</a> J. Vis. Exp. (95), e52281(2015).</li>
<li>Doeven, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li>
<li>Pols, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+metabolic+network+for+physicochemical+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis.</a> Nat Commun. 10 (1), 4239(2019).</li>
<li>Bailoni, E., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+recycling+fuels+sustainable+glycerol+3-phosphate+formation+in+synthetic+cells+fed+by+dynamic+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis.</a> ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).</li>
<li>Van Der Heide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+osmotic+signal+and+osmosensing+mechanism+of+an+ABC+transport+system+for+glycine+betaine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine.</a> EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).</li>
<li>Van'T Klooster, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipid+requirements+of+the+lysine+transporter+Lyp1+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae.</a> J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).</li>
<li>Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microfluidic-based+approach+to+formulate+size-tuneable+large+unilamellar+cationic+liposomes%3A+Formulation%2C+cellular+uptake+and+biodistribution+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).</li>
<li>Weiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+bottom-up+assembly+of+mechanically+stabilized+synthetic+cells+by+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics.</a> Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).</li>
<li>Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymology+of+the+pathway+for+ATP+production+by+arginine+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown.</a> FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).</li>
<li>Yandrapalli, N., Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+capacity+microfluidic+trapping+of+giant+vesicles+for+high-throughput+membrane+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies.</a> Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).</li>
<li>Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459">http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459</a> (2019).</li>
<li>Elias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+characterization+of+biomimetic+membrane+mechanics+with+an+on-chip+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+Nano+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette.</a> Micro Nano Eng. 8, 100064(2020).</li>
<li>Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+trapping+of+giant+unilamellar+vesicles+to+study+transport+through+a+membrane+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore.</a> Biomicrofluidics. 7 (4), 044105(2013).</li>
<li>Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+Pressure+Enables+High-Yield+Assembly+of+Giant+Vesicles+in+Solutions+of+Physiological+Ionic+Strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths.</a> Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).</li>
<li>Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4 (1), 2550(2013).</li>
<li>Setyawati, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+dynamically+interacting+integral+membrane+subunits+of+energy-coupling+factor+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters.</a> eLife. 9, e64389(2020).</li>
<li>Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+coffee+ring+effect+for+a+defect-free+electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles.</a> Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).</li>
<li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+liposomes+from+spin-coated+films+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener ningún interés financiero contrapuesto.

Presentamos un protocolo para la síntesis de proteínas (de membrana) que contienen vesículas lipídicas de tamaño submicrométrico (proteoLUVs), y la conversión de proteoLUVs en vesículas unilamelares gigantes (proteoGUVs). El protocolo debería ser aplicable para la reconstitución de otras proteínas de membrana 13,19,30,40 y la encapsulación de redes metabólicas distintas de la descomposición de L-arginina y las vías de síntesis de glicerol 3-fosfato presentadas aquí.
La reconstitución de las proteínas de membrana en los liposomas generalmente produce una orientación aleatoria de las proteínas dentro de la membrana lipídica. Para ArcD y Glpt, la orientación no importa, porque las proteínas operan bidireccionalmente y los solutos se mueven dependiendo del signo del potencial electroquímico total. Para las proteínas que funcionan en una dirección, la mitad de las moléculas no estarán disponibles para la actividad cuando su orientación sea 50/50.
La extrusión de vesículas a través de un filtro de policarbonato reduce la distribución del tamaño, y las vesículas se vuelven más homogéneas cuanto menor es el tamaño de los poros de los filtros. Sin embargo, las vesículas más pequeñas tienen el precio de tener un volumen menor y, por lo tanto, un número muy pequeño de proteínas (enzimas, proteínas de membrana) por vesícula. Para minimizar la fracción de LUVs a los que les faltan uno o más componentes, la concentración de las proteínas se puede ajustar como se muestra en la Figura 3A, B , pero con vesículas muy pequeñas los efectos estocásticos son inevitables.
El método de hinchazón asistido por gel se basa en la deposición de vesículas sonicadas (SUV) en una superficie de agarosa seca. Durante el proceso de secado, se forma un gradiente de concentración de vesículas y la concentración de lípidos es más alta en la periferia de la mancha. Esto se debe a un fenómeno conocido como efecto mancha de café 41,42. Como resultado, solo una pequeña región dentro de la mancha contiene una concentración de lípidos adecuada para la formación de GUV. Las manchas lipídicas circulares desiguales y concentradas dan lugar a grandes áreas no utilizadas que no están disponibles para la fusión de vesículas; por lo tanto, la eficiencia de la formación de GUV se vuelve baja en este enfoque. Para aumentar el rendimiento de los GUV, se debe aspirar a una deposición uniforme de lípidos, lo que se puede lograr mediante el recubrimiento giratorio42 o aprovechando el efecto de mancha de café41.
Más notas sobre el protocolo:
Se debe tener cuidado de que varias proteínas de membrana (>10) se reconstituyan en promedio por vesícula para evitar efectos estocásticos. Por lo tanto, evite las proporciones de lípidos a proteínas superiores a 400:1 p/p. Se supone una orientación aleatoria para la mayoría de las proteínas.
Idealmente, el volumen de proteínas totales de membrana es lo más pequeño posible y, de todos modos, no excede el 10-20% del volumen del liposoma. La adición de volúmenes más grandes introducirá más detergente y la mayoría de los liposomas preformados pueden lisarse, lo que puede tener un efecto negativo en la eficiencia de la reconstitución.
El preequilibrio del extrusor con la solución adecuada es importante para evitar la dilución de los componentes durante la encapsulación. Idealmente, la solución de preequilibrio también debería contener las enzimas solubles, pero incluir enzimas puede ser demasiado costoso debido al volumen relativamente grande necesario para el preequilibrio de la extrusora. Por lo tanto, normalmente omitimos estos componentes y aceptamos una dilución del 5% de las enzimas.
Se deben agregar ionóforos a las mezclas que contienen proteoliposomas porque las moléculas son altamente hidrofóbicas y pueden adsorberse a las superficies si no hay vesículas presentes. Se debe tener cuidado de que el volumen de solvente añadido sea bajo (<1% del volumen total de reacción). Se realizan controles para verificar que los disolventes no afectan a las redes metabólicas de las vesículas. Las concentraciones de ionóforos de aproximadamente 1 μM son generalmente seguras para concentraciones totales de lípidos de ~ 3 mg / mL.
Se debe tener cuidado de secar bien las gotas. Si las gotas no están lo suficientemente secas, la formación de GUV es menos eficiente, ya que los lípidos formarán agregados lipídicos y se pueden formar MLV cuando se agrega la solución de hinchazón.
La glucosa se utiliza para igualar la osmolaridad del medio externo al interno; este último contiene sacarosa en lugar de glucosa para aumentar la densidad de las vesículas y facilitar así la sedimentación de los GUV. Además, la glucosa en el entorno externo mejora el contraste de fases, haciendo que la vesícula sea más fácilmente visible.
Los efectos estocásticos son un problema mucho menor con los GUV; Pero aquí, la relación superficie-volumen puede llegar a ser inaceptablemente baja, de modo que el número de proteínas de membrana (por ejemplo, transportadores) se vuelve limitante para la red metabólica interna. El método descrito en este protocolo no permite un control preciso sobre el tamaño de los proteoGUVs, pero la mayoría se encuentran en el rango de tamaño de 5-50 μm.
En conclusión, el trabajo presentado aquí proporciona una visión completa de la reconstitución de proteínas de membrana y la encapsulación de enzimas en vesículas lipídicas de diferentes tamaños. Demostramos la construcción de vesículas funcionales para la síntesis de ATP y bloques de construcción a partir de precursores simples como aminoácidos y glicerol. La reconstitución de las proteínas de membrana en los GUV sigue siendo un reto, pero los protocolos presentados aquí allanan el camino para futuros desarrollos en la investigación de biología sintética de abajo hacia arriba.

El campo de la biología sintética ascendente se centra en la construcción de células (mínimas) 1,2 y biorreactores metabólicos con fines biotecnológicos 3,4 o biomédicos 5,6,7,8. La construcción de células sintéticas proporciona una plataforma única que permite a los investigadores estudiar proteínas (de membrana) en condiciones bien definidas que imitan las de los entornos nativos, lo que permite el descubrimiento de propiedades emergentes y funciones bioquímicas ocultas de las proteínas y las redes de reacción9. Como paso intermedio hacia una célula sintética que funcione de forma autónoma, se desarrollan módulos que capturan características esenciales de las células vivas, como la conservación de la energía metabólica, la síntesis de proteínas y lípidos y la homeostasis. Estos módulos no solo mejoran nuestra comprensión de la vida, sino que también tienen aplicaciones potenciales en los campos de la medicina8 y la biotecnología10.
Las proteínas transmembrana están en el corazón de prácticamente cualquier red metabólica, ya que transportan moléculas dentro o fuera de la célula, señalizan y responden a la calidad del medio ambiente y desempeñan numerosas funciones biosintéticas. Así, la ingeniería de módulos metabólicos en células sintéticas requiere en la mayoría de los casos la reconstitución de proteínas de membrana integrales y/o periféricas en una bicapa de membrana compuesta por lípidos específicos y de alta integridad (baja permeabilidad). El manejo de estas proteínas de membrana es un desafío y requiere conocimientos específicos y habilidades experimentales.
Se han desarrollado varios métodos para reconstituir proteínas de membrana dentro de vesículas de fosfolípidos, la mayoría de las veces con el propósito de estudiar la función11,12, la regulación13, las propiedades cinéticas14,15, la dependencia lipídica15,16 y/o la estabilidad17 de una proteína específica. Estos métodos implican la dilución rápida de proteínas solubilizadas con detergente en medios acuosos en presencia de lípidos18, la eliminación de detergentes mediante la incubación de proteínas solubilizadas con detergente con vesículas lipídicas desestabilizadas con detergente y la absorción de los detergentes en perlas de poliestireno19, o la eliminación de detergentes mediante diálisis o cromatografía de exclusión por tamaño20. Los disolventes orgánicos se han utilizado para formar vesículas lipídicas, por ejemplo, a través de la formación de interfases aceite-agua21, pero la mayoría de las proteínas integrales de la membrana se inactivan cuando se exponen a dichos disolventes.
En nuestro laboratorio, reconstituimos principalmente proteínas de membrana por el método de absorción de detergente para formar vesículas unilaminares grandes (LUVs)19. Este método permite la co-reconstitución de múltiples proteínas de membrana y la encapsulación en la luz de la vesícula de enzimas, metabolitos y sondas22,23. Las LUV que contienen proteínas de membrana pueden convertirse en vesículas unilamelares gigantes (GUV) con/sin encapsulación de componentes solubles en agua, utilizando electroformación24 o hinchazón asistida por gel25 y condiciones específicas para preservar la integridad de las proteínas de membrana26.
En este trabajo se presenta un protocolo para la reconstitución en LUVs de una red metabólica fuera de equilibrio que regenera ATP a través de la descomposición de L-arginina en L-ornitina27. La formación de ATP está acoplada a la producción de glicerol-3-fosfato (G3P), un componente importante para la síntesis de fosfolípidos22,28. La vía metabólica consta de dos proteínas de membrana integrales, una arginina/ornitina (ArcD) y un antiportador G3P/Pi (GlpT). Además, se requieren tres enzimas solubles (ArcA, ArcB, ArcC) para el reciclaje de ATP, y GlpK se usa para convertir el glicerol en glicerol 3-fosfato, utilizando el ATP de la descomposición de L-arginina, consulte la Figura 1 para obtener una descripción general esquemática de la vía. Este protocolo representa un buen punto de partida para la futura construcción de redes de reacción aún más complejas, para la síntesis de lípidos o proteínas o la división de células. La composición lipídica de las vesículas apoya la actividad de una amplia variedad de proteínas integrales de membrana y ha sido optimizada para el transporte de diversas moléculas dentro o fuera de las vesículas 27,29,30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg"> Figura 1: Descripción general de la vía para la producción de ATP y la síntesis y excreción de glicerol 3-fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En resumen, se añaden proteínas de membrana purificadas (solubilizadas en dodecil-β-D-maltósido, DDM) a vesículas lipídicas preformadas que han sido desestabilizadas con Triton X-100, lo que permite la inserción de las proteínas en la membrana. Las moléculas de detergente se eliminan posteriormente (lentamente) mediante la adición de perlas de poliestireno activado, lo que da lugar a la formación de proteoliposomas bien sellados. A continuación, se pueden añadir componentes solubles a las vesículas y encapsularlos mediante ciclos de congelación y descongelación, lo que atrapa las moléculas en el proceso de fusión de la membrana. Las vesículas obtenidas son muy heterogéneas y muchas son multilaminares. Luego se extruyen a través de un filtro de policarbonato con un tamaño de poro de 400, 200 o 100 nm, lo que produce vesículas de tamaño más uniforme; Cuanto menor es el tamaño de los poros, más homogéneas y unilaminares son las vesículas, pero a costa de un menor volumen interno. Las proteínas no incorporadas y las moléculas pequeñas se eliminan de la solución externa mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Los proteoLUV se pueden convertir en vesículas de tamaño micrométrico mediante hinchazón asistida por gel, y estos proteoGUV se recogen y atrapan en un chip microfluídico para su caracterización y manipulación microscópica. En la figura 2 se muestra una descripción general esquemática del protocolo completo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg"> Figura 2: Resumen del protocolo para la reconstitución de proteínas de membrana y la encapsulación de enzimas y componentes solubles en agua en vesículas lipídicas de tamaño submicrométrico (LUVs) y micrométrico (GUVs). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los protocolos de reconstitución y encapsulación funcionan bien y se conserva la funcionalidad de las proteínas, pero los proteoLUVs y proteoGUVs son heterogéneos en tamaño. Los enfoques microfluídicos31,32 permiten la formación de vesículas de tamaño micrométrico que son más homogéneas en tamaño, pero la reconstitución funcional de las proteínas de membrana generalmente no es posible porque el solvente residual en la bicapa inactiva las proteínas. Los proteoLUVs varían en tamaño de 100 a 400 nm, y a bajas concentraciones de enzimas, la encapsulación puede conducir a vesículas con vías metabólicas incompletas (efectos estocásticos; ver Figura 3). Los LUV son ideales para construir módulos metabólicos específicos, como se muestra aquí para la producción de ATP y bloques de construcción como G3P. Dichos proteoLUV pueden encapsularse potencialmente en GUV y servir como compartimentos similares a orgánulos para las vesículas del huésped.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg"> Figura 3: Número de moléculas por vesícula con un diámetro de 100, 200 o 400 nm. (A) Cuando las proteínas encapsuladas (enzimas, sondas) están en el rango de 1-10 μM. (B) La reconstitución se realiza a 1 a 1.000, 1 a 10.000 y 1 a 100.000 proteínas de membrana por lípido (mol/mol). Suponemos que las moléculas se encapsulan en las concentraciones indicadas y se incorporan a la membrana en estas proporciones proteína-lípido. En el caso de algunas enzimas, hemos visto que se unen a las membranas, lo que puede aumentar su concentración aparente en las vesículas. Abreviatura: LPR = Relación Lípido-Proteína <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de corte Amicon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Milipore Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa</td><td></td> <td>paramedio-D</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sacarosa</td><td>paramedio-DDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Glycon</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>paramedio&nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td></td> Extrusora MFCD00003568 <td></td></tr><tr><td></td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>Fluorímetro</td><td>Jasco</td><td>Espectrofluorómetro FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>Columna de flujo por gravedad</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton 100 &micro; L Hamilton</td><td></td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>jeringa Hamilton 1000 y micro; L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador LCP de mano</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador de mano</td><td>Hielscher Ultrasound Technology</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BOOM</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Kimtech</td><td>Science</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de tubo Falcon grande</td><td>Centrífuga Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-ornitina</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM Microscopio confocal de barrido láser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chip microfluídico</td><td>Hecho en casa&nbsp;</td>DOI <td>basado en PDMS</td><td>: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro Nanodrop</td><td>Isogen Life Science</td><td>ND-1000 espectrofotómetro NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>agujas para GUVs</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm</td></tr><tr><td>Agujas para microfluídica</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm</td></tr><tr><td>Ni2+ Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>Medidor</td> <td>de osmolalidadGonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 osmómetro básico de punto de congelación</td> Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger Filtro de policarbonato Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrana Producto: 10417104 0.4 y micro;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> m</td></tr><tr><td>Tubo ultracentrífugo de policarbonato</td><td>Beckman Coulter</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>Piranina</td><td>Acros Organics</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo (negro)</td><td>Hellma Analytics</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75 resina&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics Sonics & Materiales INC</td><td>Sonics vibra cell</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Sarstedt</td><td>Filtropur S plus 0.2</td><td>0.2 &micro; m</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>Centrífuga Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>Espaciador de teflón</td><td>Hecho en casa&nbsp;</td><td>Teflón</td><td>45 x 26 x 1,5 o 45 x 26 x 3 o 20 x 20 x 3 mm</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara UV</td><td>Spectroline</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS Espectrómetro</td><td>Jasco</td><td>V730</td><td></td></tr><tr><td>Valinomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia de campo amplio</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Caseína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

construcción de redes metabólicas fuera de equilibrio en vesículas de tamaño nanométrico y micrométrico

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

Presentamos un método para incorporar a las vesículas redes complejas de proteínas, que involucran proteínas de membrana integrales, enzimas y sensores basados en fluorescencia, utilizando componentes purificados. Este método es relevante para el diseño y construcción de biorreactores y el estudio de redes complejas de reacciones metabólicas fuera de equilibrio. Comenzamos reconstituyendo (múltiples) proteínas de membrana en grandes vesículas unilaminares (LUVs) de acuerdo con un protocolo previamente desarrollado. A continuación, encapsulamos una mezcla de enzimas purificadas, metabolitos y sensores basados en fluorescencia (proteínas fluorescentes o colorantes) mediante congelación-descongelación-extrusión y eliminamos los componentes no incorporados mediante centrifugación y/o cromatografía de exclusión por tamaño. El rendimiento de las redes metabólicas se mide en tiempo real mediante el seguimiento de la relación ATP/ADP, la concentración de metabolitos, el pH interno u otros parámetros mediante la lectura de fluorescencia. Nuestras vesículas que contienen proteínas de membrana de 100-400 nm de diámetro se pueden convertir en vesículas unilaminares gigantes (GUV), utilizando procedimientos existentes pero optimizados. El enfoque permite la inclusión de componentes solubles (enzimas, metabolitos, sensores) en vesículas de tamaño micrométrico, aumentando así el volumen de los biorreactores en órdenes de magnitud. La red metabólica que contiene los GUV queda atrapada en dispositivos microfluídicos para su análisis mediante microscopía óptica.

La reconstitución de las proteínas de membrana solubilizadas en liposomas requiere la desestabilización de las vesículas preformadas. La adición de pequeñas cantidades de Triton X-100 inicialmente resulta en un aumento de la absorbancia a 540 nm (A540) debido a un aumento en la dispersión de la luz por la hinchazón de las vesículas (Figura 4). El valor máximo de A540 es el punto en el que los liposomas están saturados con detergente (Rsat), después del cual cualquier adición adicional de Triton X-100 dará lugar a la solubilización parcial de las vesículas. En Rsol, los liposomas están completamente solubilizados (Figura 4). Para la reconstitución de las proteínas de membrana, normalmente utilizamos vesículas desestabilizadas al 60% más allá de Rsat (indicado por una flecha).
La proteína de membrana reconstituida ArcD se utiliza para transportar L-arginina dentro y L-ornitina fuera de las vesículas y se utiliza junto con las enzimas encapsuladas ArcA, ArcB y ArcC para reciclar ATP de ADP y fosfato inorgánico. El GlpT es un glicerol 3-fosfato/antiportador de fosfato que, junto con el GlpK, es necesario para la síntesis (y excreción) de glicerol 3-fosfato a partir de glicerol más ATP producido por la descomposición de la L-arginina. La adición de 5 mM de L-arginina a t = 0 a los proteoliposomas da como resultado un aumento pronunciado en la relación entre la fluorescencia de PercevalHR a 500 y la excitación de 430 nm39, que refleja la relación ATP/ADP dentro de las vesículas (Figura 5). Tras la adición de glicerol, el ATP se utiliza para la síntesis de glicerol 3-fosfato, lo que resulta en una disminución de la relación ATP/ADP28. La descomposición de la L-arginina también conduce a cambios en el pH, que se pueden cuantificar utilizando piranina o pHluorin27.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg"> Figura 5: Reciclaje de ATP por la vía de descomposición de L-arginina. Los LUV a 2,7 mg de lípidos/mL se colocan en una cubeta y se registra la relación de fluorescencia a 500 nm y 430 nm. Se añaden 5 mM de L-arginina a t = 0. La relación F500/F430 es una medida de la relación ATP/ADP dentro de las vesículas. Abreviatura: LUVs = vesículas unilaminares grandes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los LUV productores de ATP también se pueden utilizar para formar GUV. La rehidratación de proteo-LUVs secos en un gel de agarosa de LGT da lugar a la formación de vesículas de tamaño micrométrico (Figura 6). La formación de proteo-GUVs dentro de las manchas secas de LUV depende en gran medida de la concentración local de lípidos y del grado de deshidratación. Algunas áreas tienen grandes parches de GUV, mientras que en otros lugares, en la misma gota, no se pueden formar GUV o se pueden formar pocos. La formación de GUV a través de la hinchazón asistida por agarosa de LGT da como resultado una gama de tamaños de GUV, generalmente desde unos pocos micrómetros hasta más de 50 μm.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg"> Figura 6: Imágenes DIC de proteoGUVs formados por hinchazón asistida por gel. Barra de escala = 25 μm. Abreviaturas: DIC = contraste de interferencia diferencial; GUVs = vesículas unilaminares gigantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los GUV se recolectan y se atrapan en un dispositivo microfluídico basado en PDMS pasivado con β-caseína (Figura 7). El dispositivo está diseñado de manera que muchas vesículas pueden ser atrapadas y analizadas dentro de un solo experimento, y el dispositivo se utiliza para controlar el entorno externo (caudal, composición del tampón, etcétera). 34. Incluso cuando el rendimiento de los proteo-GUV es bajo, el flujo constante de GUV a través del chip microfluídico permite recoger muchas vesículas. Una vez que se atrapan suficientes GUV, el sistema se lava con un tampón osmóticamente equilibrado para eliminar los componentes externos como proteínas solubles, moléculas pequeñas y sondas fluorescentes. A continuación, el tampón de lavado se sustituye por una solución de sustrato de igual osmolalidad que contiene 50 mM KPi (pH 7,0), cantidades variables de glucosa (para ajustar la osmolalidad) y sustratos como 10 mM de L-arginina. Se realiza un experimento de series temporales en varias trampas del chip microfluídico y se toman imágenes cada 90 s (405 nm y 488 nm de excitación cuando se utiliza PercevalHR). Además, se toma una imagen de campo claro en cada punto de tiempo. La relación de las intensidades de emisión después de la excitación a 488 y 405 nm es una medida de la relación ADP/ATP en las vesículas.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg"> Figura 7: Atrapamiento de vesículas con el chip microfluídico. (A) Atrapamiento de las vesículas, acompañado de la capacidad de controlar el entorno externo y el caudal. (B) ProteoGUVs atrapados en un dispositivo microfluídico y excitados con un láser de 405 nm (verde) y un láser de 488 (rojo). La emisión de ambos canales se mide a &gt;500 nm. La imagen de campo claro permite la visualización de las vesículas sin fluorescencia. Barra de escala = 25 μm. Abreviatura: GUVs = vesículas unilaminares gigantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos un protocolo para la reconstitución de proteínas de membrana y encapsulación de enzimas y otros componentes solubles en agua en vesículas lipídicas de tamaño submicrométrico y micrométrico.

Construcción de redes metabólicas fuera de equilibrio en vesículas de tamaño nanométrico y micrométrico

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

En los Países Bajos, el consorcio BaSyC tiene como objetivo construir células sintéticas a partir de componentes moleculares. El consorcio BaSyC está compuesto por grupos de investigación que van desde la biología molecular hasta la química, la física y las ciencias computacionales. El objetivo de este consorcio es crear un sistema autorreplicante, capaz de crecer de forma autónoma, transmitir información y dividirse.Y actualmente nos centramos en la construcción de redes moleculares que se integren hacia sistemas moleculares más complejos. Los desarrollos recientes en biología sintética incluyen la ingeniería de módulos para funciones celulares, integrándolos en redes complejas para aplicaciones en diagnóstico, terapia, inmunología sintética y materiales adaptativos. Este progreso abarca grupos en Europa, América y Asia, que promueven enfoques de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba para la construcción de células sintéticas.Las tecnologías actuales en nuestro campo incluyen la ingeniería y los métodos evolutivos para construir y optimizar redes metabólicas. Utilizamos IA para la selección molecular y técnicas bioquímicas y biofísicas avanzadas para el aislamiento de componentes y la formación de redes. También empleamos la reconstitución de membranas, la encapsulación física y la visualización mediante espectroscopía fluorescente y microscopía.Con la integración de módulos, el número de proteínas y enzimas de membrana aumenta enormemente, lo que plantea limitaciones en nuestras tecnologías de reconstitución y encapsulación. La encapsulación estocástica se convierte en un problema con vesículas de tamaño submicrométrico, y la eficiencia de la formación de vesículas de tamaño micrométrico disminuye cuando se reconstituyen múltiples proteínas de membrana en la membrana lipídica. En Groningen, hemos desarrollado redes metabólicas para la producción de ATP y el mantenimiento de un estado fuera de equilibrio a través de la alimentación con sustrato y la exportación de productos.Además, vinculamos el reciclaje de ATP con la síntesis y excreción de precursores lipídicos, lo que permite que las vesículas secundarias produzcan lípidos, lo que supone un avance significativo en nuestro campo.

construction-out-equilibrium-metabolic-networks-nano-micrometer-sized

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este documento se describen los métodos simples para la preparación de vesículas, la encapsulación de la transcripción y la maquinaria de traducción, y el seguimiento de la producción de proteínas. Los sistemas libres de células resultantes se pueden utilizar como un punto de partida para construir imita celulares cada vez más complejas.

La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares

El protocolo presentado describe el análisis del transporte mediado por proteínas de membrana a nivel de transportador único utilizando bicapas lipídicas sin disolventes que atraviesan poros. Esto se logra mediante la creación de chips de matriz de nanoporos producidos a granel, combinados con la adquisición y el análisis de datos altamente paralelos, lo que permite el establecimiento futuro de cribados de efectores de proteínas de membrana.

Membrana de transporte de procesos analizados por un sistema de nanoporos viruta altamente paralela a la Resolución de la proteína individual

Muchas proteínas realizan su función cuando se unen a las superficies de las membranas. La unión de proteínas extrínsecas en membranas de nanodiscos se puede obtener indirectamente mediante microscopía electrónica de transmisión. Demostramos que el apilamiento característico (rouleau) de los nanodiscos inducido por la tinción negativa de fosfotungstato de sodio se previene mediante la unión de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

Muchas proteínas en la célula de sensación e inducen curvatura de la membrana. Se describe un método para nanotubos de membrana de las vesículas de lípidos para el estudio de la interacción de proteínas o cualquier molécula activa de curvatura con membranas curvo in vitro.

Tirando de nanotubos de membrana de las vesículas unilaminar gigante

Apoyo sólido, libre de proteína, dobles membranas de bicapa de fosfolípidos (DLBM) pueden transformarse en redes de nanotubos de lípidos complejos y dinámicos y pueden servir como modelos 2D de abajo hacia arriba del retículo endoplasmático.

Formación espontánea y cambio de redes de nanotubos lipídica Artificial como un modelo Bottom-Up de retículo endoplasmático

Este protocolo describe un proceso para fabricar redes de nanotubos lipídicos utilizando la motilidad de la quinesina deslizante junto con vesículas lipídicas unilamelares gigantes.

Fabricación de redes de nanotubos lipídicos multicomponente utilizando el ensayo de motilidad de quinesina deslizante

En la interfaz de disolventes orgánicos y acuosos, las proteínas anfifílicas a medida similares a la elastina se ensamblan en estructuras supramoleculares complejas como vesículas, fibras y coacervados desencadenados por parámetros ambientales. Los protocolos de montaje descritos producen compartimentos basados en membranas de proteínas (PMBC) con propiedades ajustables, lo que permite la encapsulación de varias cargas.

Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

El presente protocolo describe el ensamblaje de liposomas asistido por octanol (OLA), una técnica microfluídica para generar liposomas biocompatibles. OLA produce liposomas monodispersos de tamaño micrométrico con encapsulación eficiente, lo que permite la experimentación inmediata en chip. Se prevé que este protocolo sea particularmente adecuado para la biología sintética y la investigación de células sintéticas.

Conjunto de liposomas asistido por octanol en chip para bioingeniería

Este artículo presenta una reconstitución simple de redes de citoesqueletos dentro de vesículas gigantes separadas en fase. El método puede generalizarse y aplicarse a la encapsulación o confinamiento de una amplia gama de biomoléculas.

In vitro Reconstitución de redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV) separadas en fase

Aprende a construir redes metabólicas fuera de equilibrio en vesículas de tamaño nanométrico y micrométrico mediante reconstitución de proteínas de membrana y encapsulación de enzimas. Este protocolo avanza hacia células sintéticas capaces de crecimiento autónomo.

Construcción de redes metabólicas fuera de equilibrio en vesículas de tamaño nanométrico y micrométrico

Explorar más videos