Name: Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 32 s
Description: Aprende microinyección embrionaria para transgénesis en Drosophila usando el sistema phiC31 integrasa. Este protocolo optimizado mejora la eficiencia en la generación de moscas transgénicas mediante agujas biseladas con presión de aire.

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El trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación Científica para Talentos de Alto Nivel de la Universidad del Sur de China.

1. Preparación de plásmidos
<ol><li>Aísle plásmidos de cultivos bacterianos nocturnos de 4 mL utilizando un kit de minipreparación de plásmidos. Elución con 40 μL de tampón de elución. NOTA: No es necesario el aislamiento de plásmidos mediante un kit de preparación midi de plásmidos. Un kit de minipreparación de plásmidos puede cumplir plenamente con los requisitos experimentales para la microinyección de embriones. En este protocolo, los plásmidos UAS-cDNA/ORF preparados contienen diez copias de UAS, un promotor mínimo Hsp70, un sitio attB, un gen mini-blanco y un gen de interés.</li>
	<li>Determine la concentración de ADN plasmídico utilizando un espectrofotómetro y guárdelo a -80 °C en el congelador. NOTA: La concentración de plásmidos no es crítica para el éxito de la microinyección de embriones, ya que las concentraciones de plásmidos que oscilan entre 20 ng/μL y 1683 ng/μL funcionan bien para la transgénesis en Drosophila (Tabla suplementaria 1).</li>
	<li>Justo antes de la microinyección, descongele los plásmidos y centrifugue a 13000 x g durante 5 min.</li>
	<li>Transfiera 10 μL de cada plásmido de la capa superior del líquido a un nuevo tubo de 1,5 mL.</li>
</ol>2. Tirar de las agujas
<ol><li>Encienda un extractor de agujas con los ajustes seleccionados (Calor: 500, Tirón: 50, Vela: 60, Retardo: 90, Presión: 200, Prueba de rampa: 510).</li>
	<li>Inserte un capilar de vidrio de borosilicato (diámetro exterior de 1,0 mm, diámetro interior de 0,75 mm, 10 cm de longitud) en el extractor de agujas y cierre la tapa.</li>
	<li>Presione el botón Tirar . Cada capilar de vidrio forma dos agujas.</li>
</ol>3. Agujas de molienda (Figura 1)
<ol><li>Utilice una amoladora de agujas montada con una placa abrasiva adecuada (para tamaños de punta de 0,7-2,0 μm) de una amoladora de agujas.</li>
	<li>Humedecer el paño (hilo de referencia) con solución de molienda (100 ml de agua destilada con 0,9 g de NaCl, 1 ml de agente humectante) y fijar el paño.</li>
	<li>Encienda la amoladora de agujas y mantenga la placa de molienda girando.</li>
	<li>Conecte una aguja a una bomba de aire de pie con un manímetro a través de un tubo capilar de silicona y, a continuación, monte la aguja en un soporte de aguja de la amoladora de agujas. Ajuste el ángulo de la aguja con respecto a la placa de molienda a 35° (Figura 1A, B).</li>
	<li>Ajuste la posición de la punta de la aguja justo por encima de la superficie de la placa de molienda utilizando una perilla de control gruesa debajo del microscopio (Figura 1C). NOTA: Las agujas estiradas obtenidas en la sección 2 tienen un cono de 6-8 mm y una punta inferior a 1 μm (Figura 1D), tal y como se describe en el manual de usuario del extractor.</li>
	<li>Mantenga la presión interna de la aguja a 40 psi usando la bomba de aire de pie. Ajuste la posición de la punta de la aguja usando una perilla de control fino debajo del microscopio y haga que la punta de la aguja toque la placa de molienda.</li>
	<li>Moler durante 3-5 s. Cuando salgan pequeñas burbujas de aire de la punta de la aguja, descargue la aguja (Figura 1E). NOTA: En el proceso de molienda, el uso de una bomba de aire evita que la solución de molienda se desvíe.</li>
	<li>Coloque las agujas molidas en un estuche de almacenamiento. NOTA: Use agujas recién molidas tanto como sea posible, aunque las agujas molidas se pueden guardar en un estuche de almacenamiento durante al menos unas semanas antes de la microinyección.</li>
</ol>4. Preparación de pipetas para la carga de plásmidos
<ol><li>Calentar una pipeta de 200 μL con la llama exterior de un quemador de alcohol.</li>
	<li>Una vez que empiece a derretirse, estira la pipeta.</li>
	<li>Corte el extremo sellado de la pipeta estirada con unas tijeras, y la pipeta estirada estará lista para cargar el ADN en una aguja rectificada. NOTA: Alternativamente, se comercializan puntas extremadamente largas y finas para llenar agujas molidas.</li>
	<li>Coloque estas pipetas en una caja de plástico esterilizada en autoclave.</li>
</ol>5. Recolección de embriones
<ol><li>Recoja moscas (vas-phiC31; + ; attP2) que expresen la integrasa phiC31 y lleven el sitio de acoplamiento attP2 3 días después de que hayan eclosionado de 50 viales y transfiéralas a una jaula (φ 90 mm x 150 mm). Agregue un poco de pasta de levadura fresca en el centro de cada plato de agar uva18.</li>
	<li>Prepara de 2 a 4 jaulas de moscas. Mantenga las jaulas y las placas a 25 °C y cambie las placas todos los días durante 2-4 días. NOTA: Este estudio combinó el transgén vas-phiC31 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) en el primer cromosoma y el transgén attP2 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) en el tercer cromosoma. El stock resultante (vas-phiC31; + ; attP2) se utiliza en este protocolo. La pasta de levadura debe prepararse a diario, y la pasta de levadura fresca debe alimentarse con las moscas. Las jaulas reemplazadas deben limpiarse y secarse para deshacerse de los embriones restantes en las jaulas.</li>
	<li>El día de la microinyección, cambie las jaulas y las placas por la mañana. Luego, cambie las placas cada 30 minutos y recoja los embriones de estas placas. Cambie todas las jaulas y placas a temperatura ambiente (RT) y luego mantenga las jaulas y placas a 25 °C. NOTA: Algunos protocolos prefieren incubar las jaulas y placas a 18 °C para la puesta de huevos. Depende del número de embriones que se necesiten para la microinyección.</li>
</ol>6. Embriones descorionantes
<ol><li>Prepare lejía al 30% mezclando 60 mL de lejía (con un contenido de cloro activo de 34-46 g/L) y 140 mL de agua bidestilada.</li>
	<li>Retire las moscas restantes en las placas de agar jugo de uva con un cepillo o pinzas, y enjuague los embriones en un colador de células con agua destilada doble.</li>
	<li>Seque el colador de células que contiene los embriones con papel de seda.</li>
	<li>Colóquelo en una placa de Petri que contenga un 30% de lejía y agite el colador de celdas con la mano o con un agitador horizontal durante 1,5 min a 60 rpm. NOTA: El enjuague es un paso crítico. Si el tiempo de enjuague no es lo suficientemente largo, la cáscara de un embrión no se desprenderá por completo. Si el tiempo de enjuague es demasiado largo, hará que el embrión se ablande y se rompa fácilmente. El colador de células debe estar completamente sumergido en el 30% de lejía. Use un par de guantes de goma y una bata de laboratorio para evitar lesiones causadas por la lejía.</li>
	<li>Enjuague los embriones durante 2 minutos con agua destilada doble almacenada en una botella de lavado de plástico de laboratorio para eliminar la lejía residual. Elige los embriones flotantes para la alineación.</li>
</ol>7. Alinear embriones
<ol><li>Corta el agar jugo de uva sólido en tiras largas con una cuchilla. NOTA: Use jugo de uva morada para que sea más fácil alinear los embriones blancos.</li>
	<li>Transfiera los embriones a una tira larga con un pincel.</li>
	<li>Alinee alrededor de 60 embriones con una aguja de disección a lo largo del borde de una tira larga con sus partes posteriores mirando hacia el exterior de la tira. Alinee alrededor de 60 embriones en 5 minutos. NOTA: El micrópilo es una protuberancia en forma de cono en el polo anterior del embrión, a través de la cual entran los espermatozoides para fecundar el ovocito (Figura 2A). Por lo tanto, a partir de la protuberancia en forma de cono en el polo anterior del embrión, es fácil determinar la parte posterior del embrión decorionado.</li>
	<li>Coloque una cinta adhesiva de doble cara de 18 mm a lo largo del borde de un cubreobjetos (18 mm x 18 mm) y retire el soporte de papel. Presione suavemente el cubreobjetos sobre los embriones alineados. Asegúrate de que los embriones estén pegados al centro de la cinta.</li>
</ol>8. Desecación de embriones
<ol><li>Coloque el cubreobjetos con los embriones alineados en una caja que contenga desecante. El tiempo de secado varía en función de la temperatura y la humedad. NOTA: El tiempo de secado es crítico para la microinyección y debe determinarse experimentalmente. El tiempo de secado suele ser de 9-10 min en verano y de 17-18 min en invierno.</li>
	<li>Cubre los embriones con aceite de halocarbono. NOTA: No deje caer demasiado aceite sobre los embriones, ya que el aceite adicional puede desbordar el adhesivo. La relación de volumen del aceite de halocarbono 700 y el aceite de halocarbono 27 es de 1:3.</li>
</ol>9. Microinyección de embriones
<ol><li>Cargue 2 μL de ADN en la aguja utilizando la pipeta estirada. Asegúrese de que no haya burbujas en la aguja. Coloque la aguja en el portaagujas del micromanipulador.</li>
	<li>Coloque los embriones alineados cubiertos con aceite de halocarbono bajo un microscopio invertido. Asegúrese de que los extremos posteriores de los embriones miren hacia la aguja.</li>
	<li>Utilice el micromanipulador para acercar la aguja a los embriones. Limpie la aguja. Asegúrese de que una gota de líquido que sale de la aguja sea visible. A partir de una presión de inyección de 300 hPa y una presión de equilibrio de 20 hPa, ajuste la presión de inyección y la presión de equilibrio para garantizar el tamaño óptimo de la gota de líquido.</li>
	<li>Utilice el micromanipulador para insertar la aguja en los extremos posteriores de los embriones, y utilice el pedal de control conectado al microinyector para inyectar el ADN (Figura 2). Si hay un pequeño halo visible, el ADN se inyecta con éxito en el embrión. NOTA: Seleccione los embriones multinucleados para la inyección y mate los embriones más viejos usando el botón "limpiar". Si se filtra una gran cantidad de citoplasma después de la inyección, los embriones no se secan lo suficiente. Si solo se filtra una pequeña cantidad o ninguna cantidad de citoplasma después de la inyección, las inyecciones se consideran exitosas. Si más de un tercio de los embriones pierden citoplasma después de la inyección, prolongue el tiempo de secado entre 1 y 2 minutos. Si más de un tercio de los embriones se han secado en exceso, acorte el tiempo de secado en 1-2 minutos.</li>
	<li>Retire la aguja del embrión. Mueva la aguja hasta el extremo posterior del siguiente embrión. Repita los pasos anteriores.</li>
	<li>Coloque los embriones inyectados en una placa de agar. Coloque la placa en una habitación a 18-20 °C. Al día siguiente, transfiera la placa a una incubadora a una temperatura de 25 °Cy una humedad del 50%-60%, e incube durante 1 día. NOTA: Después de la inyección, mantener los embriones a una temperatura de 18-20 °C para ralentizar su desarrollo, facilitar la integración del ADN plasmídico en el genoma de Drosophila y aumentar la tasa de supervivencia de los embriones inyectados.</li>
</ol>10. Recolección de larvas
<ol><li>Use una aguja de disección para raspar y aflojar la comida en un frasco. Suministra la comida con unas gotas de agua destilada. NOTA: Permita que el agua destilada se absorba en la comida para evitar que las larvas se ahoguen.</li>
	<li>Saque las placas de la incubadora.</li>
	<li>Recoja las larvas eclosionadas con un pincel bajo un microscopio estereoscópico y transfiéralas al vial.</li>
	<li>Coloque el vial en una incubadora a una temperatura de 25 °Cy una humedad del50%-60%.</li>
</ol>11. Obtención de moscas transgénicas
<ol><li>Recoja las moscas eclosionadas después de incubar el vial a 25 °Cdurante 10 días.</li>
	<li>Cruce una sola mosca macho con tres moscas hembra vírgenes de los balanceadores TM2/TM6C Sb1 Tb1 , y cruce una sola mosca hembra con tres moscas macho de los balanceadores TM2/TM6C Sb1 Tb1 .</li>
	<li>Coloque las cruces en una incubadora a una temperatura de 25 °C y una humedad del 50%-60%.</li>
	<li>Examina la progenie en busca de moscas con ojos naranjas. Estas son las moscas transgénicas (Figura 3A-C). NOTA: Las moscas portadoras de una copia del transgén en el sitio de acoplamiento attP2 tienen ojos anaranjados.</li>
	<li>Cruce una sola mosca macho de ojos naranjas con tres moscas hembra vírgenes de los balanceadores TM2/TM6C Sb1 Tb1 para establecer una población. NOTA: Es necesario establecer más de una generación de cruzamientos para eliminar el transgén phiC31 en el primer cromosoma.</li>
</ol>

phiC31 Transgénesis embrionaria mediada por integrasa en Drosophila

<ol><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).</li>
<li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phic31%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31.</a> Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phic31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).</li>
<li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).</li>
<li>Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+transformation+of+Drosophila+via+phic31+integrase-mediated+cassette+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange.</a> Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).</li>
<li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%5Bacman%5D%3A+A+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).</li>
<li>Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+to+detect+in+vivo+Y+chromosome+loss+in+Drosophila+wing+disc+cells%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells.</a> G3. 2 (9), Bethesda. 1095-1102 (2012).</li>
<li>Ringrose, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).</li>
<li>Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+attp40+docking+site+and+derivatives+are+insertion+mutations+of+msp-300%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300.</a> PLoS One. 17 (12), e0278598(2022).</li>
<li>Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Drosophila+attp40+background+on+the+glomerular+organization+of+or47b+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons.</a> G3. 13 (4), Bethesda. 022(2023).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li>
<li>Bellen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+gene+disruption+project%3A+Progress+using+transposons+with+distinctive+site+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities.</a> Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).</li>
<li>Zirin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transgenic+drosophila+resource+collections+for+loss-+and+gain-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies.</a> Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+transgenic+Drosophila+by+microinjecting+the+site-specific+phic31+integrase+mRNA+and+a+transgene-containing+donor+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).</li>
<li>Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).</li>
<li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li>
<li>Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+techniques+in+fly+embryos+to+study+the+function+and+dynamics+of+SMC+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes.</a> Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo se presenta un protocolo de microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila. Para la transgénesis específica del sitio mediada por phiC31, inyectamos entre 120 y 140 embriones para cada plásmido y obtuvimos al menos una línea transgénica para alrededor del 85% de los plásmidos (Tabla suplementaria 2). En nuestra experiencia, el ADN plasmídico aislado por un kit de minipreparación de plásmidos es suficiente para la transgénesis en Drosophila. Las concentraciones de ADN plasmídico que oscilan entre 20 ng/μL y 1683 ng/μL podrían no tener ningún efecto aparente sobre la tasa de éxito de la transgénesis porque la mayoría de ellas pueden producir moscas transgénicas (Tabla suplementaria 1).
La preparación de las agujas de inyección es fundamental para una microinyección eficiente de embriones. Una aguja de inyección se cierra después de que un tirador de agujas tira de ella. Para la transgénesis rutinaria mediada por phiC31 en Drosophila, la punta de una aguja suele romperse con un cubreobjetos17. Sin embargo, las agujas rotas al azar a menudo no son adecuadas para la microinyección de embriones, ya que pueden bloquearse o causar fugas de una gran cantidad de citoplasma y, por lo tanto, deben ser reemplazadas por una nueva durante la inyección. Las agujas de inyección cuyas puntas están biseladas por un molinillo no suelen bloquearse ni provocar grandes fugas citoplasmáticas, lo que reduce la frecuencia de reemplazo de la aguja. Nos dimos cuenta de que la solución de molienda puede entrar en la punta biselada de una aguja una vez que la punta está abierta durante la molienda. Una vez que ingresa a la aguja, la solución de molienda no se secará rápidamente de forma natural. Para evitar que la solución de molienda se sifone, conectamos una aguja de inyección a una bomba de aire de pie con un manómetro. Mientras molemos la punta de la aguja, usamos la bomba de aire para aplicar presión de aire a la aguja y, por lo tanto, se evita que la solución de molienda ingrese a la punta biselada, lo que permite que la aguja biselada se use de inmediato. En conjunto, la bomba de aire de pie con el manómetro deberían ayudar a acelerar la transgénesis en Drosophila, particularmente para un gran número de plásmidos.
La identificación de embriones en la etapa pre-blastoderm o blastodermo sincitial es crítica para la microinyección 19,20, ya que la inyección de embriones en etapas posteriores apenas produce moscas transgénicas. Las moscas de menos de 10 días de edad se utilizan para la puesta de huevos, ya que tienden a poner más huevos que las mayores. En el proceso de descorionación de los embriones, se utiliza un filtro de células para simplificar el tratamiento con lejía y el enjuague con agua doble destilada de los embriones. Después del enjuague de los embriones, los embriones flotantes indican que las cáscaras de huevo han sido bien tratadas y pueden utilizarse para la microinyección posterior. Tanto el tiempo de decorionación como el de secado de los embriones son críticos para la microinyección y deben optimizarse experimentalmente, ya que el tiempo prolongado de decorionación o secado puede matar a los embriones. El tiempo de decorionación y secado se ve afectado por la temperatura y la humedad, que varían de un lugar a otro y de vez en cuando, y deben ajustarse en consecuencia en función de la tasa de eclosión embrionaria.

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es extremadamente susceptible a la manipulación genética y al análisis genético. Las moscas transgénicas de la fruta son ampliamente utilizadas en la investigación biológica. Desde que se desarrolló a principios de la década de 1980, la transgénesis mediada por transposones del elemento P ha sido indispensable para la investigación de Drosophila 1. En algunos escenarios, otros transposones, como piggyBac y Minos, también se han utilizado para la transgénesis en Drosophila 2. Los transgenes a través de transposones se insertan aleatoriamente en el genoma de Drosophila, y los niveles de expresión de los transgenes en diferentes loci genómicos pueden variar debido a los efectos de posición y, por lo tanto, no se pueden comparar2. Estos inconvenientes fueron superados por la transgénesis específica del sitio3 mediada por phiC31. El gen bacteriófago phiC31 codifica una integrasa que media la recombinación específica de la secuencia entre los sitios attB y attP en Drosophila3. Muchos sitios de acoplamiento attP han sido caracterizados y están disponibles en el Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.
El sistema de transgénesis phiC31 para Drosophila ha sido ampliamente utilizado por la comunidad de moscas. Entre los sitios de acoplamiento de attP, attP18 en el cromosoma X, attP40 en el segundo cromosoma y attP2 en el tercer cromosoma suelen ser los sitios preferidos para la integración de transgenes en cada cromosoma porque los transgenes en los tres sitios muestran altos niveles de expresión inducible mientras que tienen bajos niveles de expresión basal5. Recientemente, sin embargo, van der Graaf y sus colegas descubrieron que el sitio attP40, cerca del locus del gen Msp300, y los transgenes integrados en attP40 causan el agrupamiento nuclear del músculo larvario en Drosophila10. En otro estudio reciente, Duan y sus colegas encontraron que el cromosoma homocigoto attP40 interrumpe la organización glomerular normal de la clase de neuronas receptoras olfativas Or47b en Drosophila11. Estos hallazgos sugieren que se deben incluir controles rigurosos al diseñar experimentos e interpretar los datos.
Drosophila es un organismo modelo ideal para la interrogación in vivo de la función génica debido a su corto ciclo de vida, bajo costo y fácil mantenimiento. El cribado genético de todo el genoma se basa en la construcción de bibliotecas de transgénicos de todo el genoma en Drosophila 12,13,14,15. Previamente generamos 5551 construcciones UAS-cDNA/ORF basadas en el sistema binario GAL4/secuencia activadora ascendente (GAL4/UAS), que cubren el 83% de los genes de Drosophila conservados en humanos en la Colección de Oro del Centro de Recursos Genómicos de Drosophila (DGRC)16. Los plásmidos UAS-cDNA/ORF se pueden utilizar para la creación de una biblioteca transgénica de UAS-cDNA/ORF en Drosophila. La tecnología eficiente de microinyección de embriones puede acelerar la creación de bibliotecas de moscas transgénicas.
Para la microinyección de embriones, la punta de la aguja normalmente se rompe contra un cubreobjetos17. Por lo tanto, las agujas con frecuencia se obstruyen o causan fugas de grandes cantidades de citoplasma, y cuando surgen estos problemas, se deben emplear nuevas agujas. Aunque las agujas de biselado pueden mejorar la eficiencia de la microinyección, la solución de molienda ingresa a la punta biselada durante el proceso de molienda. La solución de molienda en la punta biselada no se evapora rápidamente de forma natural; Por lo tanto, las agujas no se pueden utilizar para la microinyección directamente después del biselado. Estos factores reducen la eficiencia de los procedimientos de microinyección de embriones. Aquí, utilizando como ejemplo la transgénesis específica mediada por phiC31 en Drosophila , presentamos un protocolo para la microinyección de embriones para la transgénesis en Drosophila. Para evitar que la solución de molienda ingrese a la aguja, utilizamos una bomba de aire para ejercer presión de aire dentro de la aguja, evitando así que la solución de molienda ingrese a la punta biselada. Las agujas biseladas están listas para la carga de muestras y la microinyección directamente después del biselado.

<table><tbody><tr><td>100 &mu; m Colador de celdas</td><td>NEST</td><td>258367</td><td></td></tr><tr><td>3M adhesivo de doble cara</td><td>3M</td><td>415</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato</td><td>SUTTER</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Placa abrasiva de diamante</td><td>SUTTER</td><td>104E</td><td></td></tr><tr><td>FLAMING/BROWN Extractor de micropipetas</td><td>SUTTER</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de aire de pie con manómetro</td><td>Shenfeng</td><td>SF8705D</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de halopato 27</td><td>Sigma</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2R</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de microinyección</td><td>eppendorf</td><td>FemtoJet 4i</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>eppendorf</td><td>TransferMan 4r</td><td></td></tr><tr><td>Biseladora de micropipetas</td><td>SUTTER</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio (18 mm x 18 mm)</td><td>CITOLAS</td><td>10211818C</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio (25 mm x 75 mm)</td><td>CITOLAS</td><td>188105W</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (90 mm x 15 mm)</td><td>LAIBOER</td><td>4190152</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>1026269</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Estéreo Microscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

microinyección embrionaria para la transgénesis en drosophila

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

La transgénesis en Drosophila es un enfoque esencial para estudiar la función de los genes a nivel de organismo. La microinyección de embriones es un paso crucial para la construcción de moscas transgénicas. La microinyección requiere algunos tipos de equipos, incluidos un microinyector, un micromanipulador, un microscopio invertido y un microscopio estereoscópico. Los plásmidos aislados con un kit de minipreparación de plásmidos están calificados para microinyección. Los embriones en la etapa pre-blastodermo o blastodermo sincitial, donde los núcleos comparten un citoplasma común, se someten a microinyección. Un filtro de células facilita el proceso de descorionación de los embriones. El momento óptimo para la decorionación y desecación de los embriones debe determinarse experimentalmente. Para aumentar la eficiencia de la microinyección de embriones, las agujas preparadas por un extractor deben ser biseladas por un molinillo de agujas. En el proceso de molienda de agujas, utilizamos una bomba de aire de pie con un manómetro para evitar el efecto capilar de la punta de la aguja. Inyectamos rutinariamente entre 120 y 140 embriones para cada plásmido y obtenemos al menos una línea transgénica para alrededor del 85% de los plásmidos. Este artículo toma como ejemplo la transgénesis mediada por la integrasa phiC31 en Drosophila y presenta un protocolo detallado para la microinyección de embriones para la transgénesis en Drosophila.

La punta de una aguja de inyección es biselada por un molinillo de agujas (Figura 1). Se pueden biselar 50-60 agujas en una hora. El ADN se microinyecta en la parte posterior de un embrión en la etapa pre-blastodermo o blastodermo sincitial, donde los núcleos comparten un citoplasma común (Figura 2A). La parte posterior de un embrión se puede localizar fácilmente en función del micrópilo en la parte anterior del embrión (Figura 2A). Los embriones en las etapas de blastodermo celular y gastrulación no se pueden utilizar para la inyección, ya que cada núcleo está rodeado por una membrana celular en estas etapas y, por lo tanto, la posibilidad de obtener moscas transgénicas es casi nula (Figura 2B). Los embriones sobresecados se deforman cuando se perforan y no se pueden utilizar para la microinyección (Figura 2C). Los embriones subsecos pueden extruir una gran cantidad de citoplasma cuando se pinchan con la aguja (Figura 2D), lo que resulta en una menor tasa de supervivencia de los embriones. Los embriones que se secan adecuadamente pueden o no perder una pequeña cantidad de citoplasma cuando se inyectan (Figura 2E).
La línea de Drosophila que expresa la integrasa phiC31 y que lleva el sitio de acoplamiento attP2 que se utiliza para la microinyección de embriones en este protocolo tiene ojos blancos (Figura 3A), y las moscas envejecidas de este genotipo tienen ojos rosados como resultado de la proteína fluorescente roja acumulada expresada específicamente en el ojo (Figura 3B). Utilizamos el gen mini-blanco como marcador selectivo de la transgénesis en Drosophila, y las moscas transgénicas se identifican por el color de los ojos que va del amarillo claro al rojo. Las moscas transgénicas que portan un transgén en el sitio de acoplamiento attP2 tienen ojos anaranjados (Figura 3C), lo que se puede distinguir fácilmente de las moscas que no tienen transgenes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66679/66679fig01.jpg"> Figura 1: Molienda de las agujas. (A) Se utiliza una bomba de aire de pie con un manómetro para aplicar presión de aire a la aguja. (B) Una aguja está montada en una amoladora de agujas en un ángulo de 35 ° con respecto a la superficie de una placa de molienda. (C) Use una perilla de ajuste grueso para colocar la punta de la aguja justo por encima de la superficie de la placa de molienda, luego use una perilla de ajuste fino para comenzar a biselar la punta. (D) La punta de una aguja tirada está bajo un microscopio. Barras de escala = 10 μm. (E) Una aguja biselada se coloca bajo un microscopio. La punta biselada de la aguja se indica con una flecha. Barras de escala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66679/66679fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66679/66679fig02.jpg"> Figura 2: Embriones de Drosophila aptos para microinyección. (A) Un embrión de Drosophila en la etapa pre-blastoderm o blastodermo sincitial puede inyectarse en el polo posterior del embrión, denotado por una elipse roja. El micrópilo en el polo anterior del embrión está indicado por una flecha. (B) Un embrión de Drosophila en la etapa de blastodermo celular no puede usarse para microinyección. (C) Un embrión que está sobredesecado se ve deformado. (D) La desecación insuficiente de un embrión conduce a una gran cantidad de fuga citoplasmática después de la inyección. (E) Para una inyección exitosa, una pequeña cantidad de citoplasma puede filtrarse. Barras de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66679/66679fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66679/66679fig03.jpg"> Figura 3: Color de ojos de Drosophila transgénica portadora de un transgén en el sitio de acoplamiento attP2. (A) La línea de inyección de attP2 que expresa la integrasa phiC31 (vas-phiC31; + ; attP2) tiene un ojo blanco. La RFP expresada específicamente en el ojo se utiliza como marcador selectivo para el transgén phiC31. (B) La línea de inyección attP2 envejecida que expresa la integrasa phiC31 tiene una conjuntivitis resultante de la proteína RFP acumulada en el ojo. (C) Las moscas portadoras de un transgén integrado en el sitio de acoplamiento attP2 tienen un ojo naranja. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66679/66679fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla suplementaria 1: Transgénesis en Drosophila resultante de la microinyección embrionaria de 100 plásmidos distintos. Se inyectaron en embriones un total de 100 plásmidos distintos de diversas concentraciones que oscilaban entre 20 ng/μL y 1683 ng/μL, y se obtuvieron moscas transgénicas para 85 de los 100 plásmidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66679/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria 2: Eficacia de la microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila. Se inyectaron un total de 120 plásmidos distintos en embriones, y se obtuvieron moscas transgénicas para 101 de los 120 plásmidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66679/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este artículo toma como ejemplo la transgénesis mediada por la integrasa phiC31 en Drosophila y presenta un protocolo optimizado para la microinyección de embriones, un paso crucial para la creación de moscas transgénicas.

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

La transgénesis en Drosophila es esencial para estudiar la función de los genes a nivel de organismo. La microinyección de embriones es un paso crucial para la construcción de moscas transgénicas. Aquí, tomamos como ejemplo la transgénesis mediada por la integrasa phiC31 en Drosophila y presentamos un protocolo detallado para la microinyección de embriones para la transgénesis en Drosophila.Las agujas de inyección cuyas puntas están biseladas por un molinillo no suelen bloquearse ni provocar grandes fugas citoplasmáticas. Sin embargo, la solución de molienda puede entrar en la punta biselada de una aguja durante el proceso de molienda y la solución de molienda dentro de la punta no se seca naturalmente rápidamente. Nuestro protocolo utiliza una bomba de aire de pie con un manómetro para aplicar presión de aire a una aguja mientras se muele su punta.Esto evita que la solución de molienda se sifone, por lo tanto, se evita que la solución de molienda ingrese a la punta biselada, lo que permite que la aguja biselada se use de inmediato.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

En este video, Nijole Jasinskiene demuestra la metodología utilizada para generar transgénicos mosquito Aedes aegypti, que son vectores de la fiebre del dengue. Las técnicas para la correcta preparación de las agujas de microinyección, desecación embriones, y la realización de la microinyección se demuestran.

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Debido a su gran tamaño y organización relativamente simple, las células nodriza de Drosophila son ideales para estudios de imágenes de células vivas. Este video describe un método de microinyección para la administración de compuestos exógenos en las células, y el protocolo presentado demuestra el procedimiento con sondas de oligonucleótidos fluorescentes llamadas balizas moleculares (MB) que se utilizan para visualizar transcripciones endógenas de ARNm.

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Este video describe una técnica de microinyección de embriones para administrar compuestos en el saco vitelino del pez cebra.

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Microinyección de embriones de Nasonia vitripennis es un método esencial para la generación de modificaciones heredables del genoma. Se describe aquí es un procedimiento detallado para la microinyección y el trasplante de embriones de Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente la manipulación del genoma futuro en este organismo.

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Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

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Aquí se presenta un protocolo para microinyecyar y al mismo tiempo la imagen de múltiples embriones Drosophila durante el desarrollo embrionario utilizando un imager basado en placas y alto contenido.

Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Muchas características de la eusocialidad de los insectos se basan en la comunicación dentro de la colonia y la división del trabajo. La manipulación genética de genes reguladores clave en embriones de hormigas a través de microinyección y mutagénesis mediada por CRISPR proporciona información sobre la naturaleza del comportamiento altruista en insectos eusociales.

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Aprende microinyección embrionaria para transgénesis en Drosophila usando el sistema phiC31 integrasa. Este protocolo optimizado mejora la eficiencia en la generación de moscas transgénicas mediante agujas biseladas con presión de aire.

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

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