Name: Aislamiento de células endoteliales pancreáticas de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprenda a aislar células endoteliales pancreáticas de ratón mediante disociación suave y separación magnética. Este protocolo permite estudiar la vascularización pancreática y su función en enfermedades.

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<meta charset="utf8"></head><body>Optimización de la extracción de células endoteliales pancreáticas de ratón para estudios de enfermedades

<table><tbody><tr><td>1.5 mL eppendorf</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>plato de 10 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>25G agujas</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q712-03-AA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL eppendorf</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14282300</tr><tr><td>placa de 6 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; colador m</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-biotina</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>REA784</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina tratada con choque térmico</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo 1, de piel de becerro</td><td>Sigma Aldrich& nbsp;</td><td>C9791</td><td>Reactivo de fijación en el protocolo</td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo 1&nbsp;</td><td>Worthington Bio</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Countess Contador de celdas automático</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>D1306</td><td>inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Bisturíes de seguridad desechables</td><td>Myco Instrumentation</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>260913&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Ca2+,Mg2+)</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14080055</tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td><td>mantenida a 37 &deg; C 5% CO2</td></tr><tr><td>LS Columnas</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand con el separador QuadroMACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>Microperlas anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td></td><td>Para evaluar la morfología celular</td></tr><tr><td>Grado molecular Agua</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Agitador orbital&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) Anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab56299</td><td>inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) Anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (10X) (sin Ca2+, sin Mg2+)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507-XB</td><td></td></tr><tr><td>Primer 36B4 Forward mouse</td><td>IDT</td><td></td><td>AGATTCGGGATATGCTGTTGGC</td></tr><tr><td>Primer 36B4 Revese mouse&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Forward mouse&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCAGAATCCTCTTCCATGC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Ratón inverso</td><td>IDT</td><td></td><td>AAACCTCCTGCAAGCAAATG</td></tr><tr><td>Primer Nkx6.1 Ratón inverso&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>CACGGCGGACTCTGCATCACTC</td></tr><tr><td>Primer Nxk6.1 Ratón delantero</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCTACTTTAGCCCCAGCG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Ratón delantero</td><td>IDT</td><td></td><td>ACGCTGGTGCTCTATGCAAG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Ratón inverso</td><td>IDT</td><td></td><td>TCAGTTGCTGCCCATCATCA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin RNasa</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Pinza larga estéril de 12"</td><td>F.S.T</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fina estéril</td><td>F.S.T</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijera fina estéril</td><td>F.S.T</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos 2cm</td><td>Reactivo Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109886001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin Anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Baño de</td><td></td><td></td><td></td> agua</tr></tbody></table>

aislamiento de células endoteliales pancreáticas de ratón

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

Siguiendo este protocolo, se pueden obtener aproximadamente 2 x 106 células vivas al agrupar 3 páncreas de ratón y 750.000 células de un solo páncreas de ratón. Para validar el enriquecimiento de CE, realizamos los siguientes análisis: 1) PCR cuantitativa: en comparación con las muestras de flujo continuo (FT) (es decir, las fracciones no unidas al anticuerpo CD31), las fracciones de CE tenían niveles significativamente más altos de Pecam1 (que codifica CD31) y Kdr (que codifica VEGFR2), dos genes marcadores de CE33, y niveles más bajos de NK6 homeobox 1 (Nkx6.1), un factor de transcripción en las células endocrinas pancreáticas (Figura 4A); 2) Western blot: Las muestras enriquecidas con CE de tres preparaciones (pEC-1-3) mostraron fuertes señales de CD31 al tamaño esperado (~130 kDa). En comparación, las muestras de entrada y FT mostraron una señal CD31 mínima. Como control positivo, los lisados de las células MS1, una línea celular pEC, también mostraron una fuerte señal de CD31 (Figura 4B); 3) tinción con azul de tripano: encontramos que la viabilidad de las células aisladas era de alrededor del 50% (Figura 4C); 4) citometría de flujo siguiendo un protocolo publicado15 : a través de la activación de la población de células vivas (Figura 4D), encontramos que las células CD31+ estaban al 88% y las células TdTomato+ al 76%. Cabe destacar que la mayoría de las células aisladas co-expresan CD31 y TdTomato (Figura 4E). Como controles negativos, las células MS1 no teñidas y MS1 incubadas con IgG no mostraron células vivas marcadas por CD31. Como control positivo, es decir, las células MS1 teñidas para CD31 mostraron cerca del 100% de células CD31+ vivas (Figura 4F). También cultivamos las células aisladas, realizamos la tinción por inmunofluorescencia de PECAM1 siguiendo un protocolo publicado36 y tomamos imágenes de TdTomato, que mostró señales robustas de ambos marcadores en las células aisladas, lo que sugiere la presencia de CE (Figura 4G).
<img alt="Diagrama del páncreas que ilustra las CE intraislotales para el estudio de la estructura vascular y el análisis de la interacción celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Ilustración de la vascularización del páncreas y los islotes pancreáticos. Una representación pictórica de las células endoteliales pancreáticas (CE) y las CE intraislotes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de preparación del páncreas unicelular; centrifugación, etiquetado de CD31-biotina, análisis de flujo continuo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Descripción general del flujo de trabajo. 1) disección del páncreas, 2) digestión mecánica, 3) incubación de enzimas, 4) centrifugación, 5a) eliminación del sobrenadante y 5b) digestión secundaria de la colagenasa de los gránulos celulares con trituración para filtrar en 6), 7) y 8) reconstitución de gránulos y unión de anticuerpos, 9) incubación de microperlas, 10) enriquecimiento de la columna MACS, 11) recuento de células para la viabilidad y 12) análisis posterior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Disección de tejido que muestra el proceso de recolección, aislamiento y recorte del páncreas en la investigación biológica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Pasos del procesamiento de tejidos. Imágenes de (A) la cavidad abdominal, (B) el páncreas de ratón aislado y (C) el páncreas de ratón recortado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Resultados de expresión génica, análisis de CD31, DAPI, clasificación celular, fluorescencia y citometría de flujo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Validación de fracciones de CE aisladas de páncreas de ratón. (A) qPCR de muestras de FT y fracción de EC enriquecida con CD31 para su enriquecimiento. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) y Nkx6.1 (factor de transcripción específico de células β pancreáticas)33. * denota p &lt;0.05 en comparación con FT basado en pruebas t . n = 3-4 muestras agrupadas, compuestas por 3 ratones cada una. (B) Western blot de CD31. pEC-1-3 indica EC enriquecidas a partir de 3 muestras de ratón agrupadas por separado. Se cargaron lisados celulares de 30 mg en cada carril, seguidos de la tinción de Ponceau S. (C) Recuento de células y tinción con azul de tripano de pEC enriquecidas para el ensayo de viabilidad. (D) Estrategia de activación por citometría de flujo para pEC de ratón teñidos con anticuerpos 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y CD31. (E) Histogramas de citometría de flujo de MS1 sin teñir (arriba a la izquierda), MS1 teñido con el anticuerpo secundario AlexaFluor-488 (control de IgG; arriba a la derecha), MS1 teñido con CD31 (abajo a la izquierda) y las pEC de ratón aisladas teñidas con CD31 (abajo a la derecha). (F) Porcentaje de células vivas cuantificadas mediante citometría de flujo. (G) Inmunofluorescencia de la expresión de CD31 (verde) con contratinción de DAPI (azul) y reportero fluorescente endógeno TdTomato (rojo). Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Microscopía de inmunofluorescencia CD31/CD144/DAPI, análisis de expresión génica UMAP de Cdh5, Pecam1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Especificidad de CD31 y CD144 en páncreas de ratón. (A) Inmunofluorescencia de páncreas de ratón con CD31 (magenta) y CD144 (cian), con contratinción de DAPI. Imagen capturada con una lente 10x bajo un microscopio fluorescente invertido de campo amplio. Barra de escala = 100 μm. Las líneas discontinuas delimitan el área de los islotes. (B) Aproximación y proyección uniforme de colectores (UMAP) que muestra la expresión de Cdh5 y Pecam1 en las EC de los islotes de ratones C57BL6 detectados por scRNA-seq (GSE128565)37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Enzima</td>
			<td>Uso</td>
			<td>Temperatura y tiempo</td>
			<td>Referencia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenasa I</td>
			<td>Disociación unicelular, enriquecimiento de la CE de todo el páncreas</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>Este protocolo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenasa IV</td>
			<td>Aislamiento de islotes y disociación no enzimática</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenasa + Tripsina</td>
			<td>Examen de las células ductales en el páncreas de ratón</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenasa B</td>
			<td>Suspensión unicelular del páncreas</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenasa NBI</td>
			<td>Aislamiento de islotes</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenasa P</td>
			<td>Acinar suspensión viable</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colagenasa XI</td>
			<td>Aislamiento de islotes</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispasa</td>
			<td>Suspensión unicelular</td>
			<td>37 °C, 45 min</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Suspensión unicelular</td>
			<td>37 °C, 10 min</td>
			<td>25, 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsina</td>
			<td>Disociación de una sola célula, páncreas completo</td>
			<td>4 °C, O/N</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Resumen de varios protocolos utilizados para procesar muestras de páncreas de ratón.

Aislamiento de células endoteliales pancreáticas de ratón

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and ...

isolation-of-mouse-pancreatic-endothelial-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los islotes pancreáticos, también llamados islotes de Langerhans, son un grupo de células endocrinas que producen hormonas para la regulación de la glucosa y otras funciones biológicas importantes. Este protocolo explica un método para aislar los islotes pancreáticos mediante la perfusión de colagenasa a través de la ampolla de Vater para digerir el tejido pancreático exocrino y una centrifugación en gradiente de densidad simplificada para purificar los islotes de ratones.

Aislamiento de islotes pancreáticos mediante perfusión de colagenasa: un método enzimático para aislar células de islotes pancreáticos

En esta publicación, se describe un procedimiento rápido y conveniente para el aislamiento y cultivo de las células acinares pancreáticas primarias del páncreas murino. Este método constituye un enfoque valioso para el estudio de la fisiología de las células pancreáticas exocrinas normales / no transformada primarios frescos.

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

Este protocolo está preparado para compartir nuestro método de aislamiento de células endoteliales coronarias de ratón con fines de obtención de imágenes o para realizar experimentos de biología molecular.

Aislamiento de células endoteliales de ratón coronaria

Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 - 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.

El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales

Este protocolo de aislamiento de islotes describió una novedosa vía de inyección de colagenasa para digerir el tejido exocrina y un procedimiento de gradiente simplificado para purificar los islotes de ratones. Implica digestión enzimática, separación/purificación de gradientes y selección manual de islos. El aislamiento exitoso puede producir entre 250 y 350 islotes de alta calidad y completamente funcionales por ratón.

Un protocolo simple de alta eficiencia para el aislamiento de islotes pancreáticos de ratones

Aquí presentamos un protocolo para aislar células de islote pancreático de ratón para la detección de las inducciones de ROS por los xenobióticos con el fin de identificar los potenciales químicos xenobióticos diabetogenic.

Una proyección basadas en células de islotes pancreáticos murinos Diabetogenic ambiental productos químicos

Aquí, presentamos un protocolo para la toma de imágenes y la cuantificación de la dinámica de calcio en poblaciones de células heterogéneas, como las células de los islotes pancreáticos. Los reporteros fluorescentes se entregan en la capa periférica de las células dentro del islotes, que luego se inmoviliza e imagen, y se realiza un análisis por célula de la dinámica de la intensidad de la fluorescencia.

Imagen de la dinámica del calcio en subpoblaciones de células de islotes pancreáticos de ratón

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

En este artículo, las células endoteliales pulmonares primarias se aislaron y cultivaron de ratones neonatos.

Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón

Este estudio desarrolló un método simplificado para extraer eficientemente islotes primarios funcionales y células acinas del páncreas del ratón, ofreciendo una herramienta valiosa para estudiar la comunicación intercelular en la patogénesis de la Diabetes Inducida por Pancreatitis Aguda.

Un método sencillo y rápido para el aislamiento simultáneo de islotes primarios y células acinares pancreáticas primarias de ratones

Aprenda a aislar células endoteliales pancreáticas de ratón mediante disociación suave y separación magnética. Este protocolo permite estudiar la vascularización pancreática y su función en enfermedades.

Aislamiento de células endoteliales pancreáticas de ratón

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