Name: Generación y verificación funcional de células T receptoras de antígenos quiméricos sensibles a la hipoxia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a generar células T CAR sensibles a la hipoxia mediante lentivirus y verifica su citotoxicidad selectiva en tumores sólidos. Este protocolo mejora la seguridad y eficacia en inmunoterapia oncológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

En este estudio, se comparó HER2-BBz-ODD, un CAR sensible a la hipoxia dirigido a HER2 (Gene ID: 2064) con su contraparte regular, HER2-BBz. Los esquemas de los dos CAR se ilustran en la Figura 1A, que muestra que HER2-BBz-ODD se deriva de HER2-BBz agregando la secuencia ODD al C-terminal de CD3ξ. La construcción de vectores lentivirales que expresan los dos CARs y la generación del lentivirus correspondiente por transfección de células 293T ha sido descrita previamente31.
1. Generación de células CAR-T sensibles a la hipoxia por infección lentiviral
<ol><li>Descongele rápidamente las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) criopreservadas a 37 °C en un baño de agua. Transfiera las PBMC descongeladas a un tubo de 15 mL que contenga 9 mL de medio de cultivo de linfocitos libre de suero suplementado con 400 UI de IL-2, 5 ng/mL de IL-7 y 10 ng/mL de IL-15 (medio de crecimiento de células T humanas, denominado TGM a partir de entonces).</li>
	<li>Después de tomar una alícuota para el recuento de células, centrifugar el tubo a 300 × g durante 5 min. Vuelva a suspender las PBMC peletizadas con TGM a una densidad de 4 × 106 células/mL y transfiera la suspensión a una placa de 6 pocillos.</li>
	<li>Prepare inmunoperlas recubiertas anti-hCD3/hCD28.<ol><li>Transfiera 100 μL de perlas magnéticas de IgG de ratón a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y lávelas 2 veces con un soporte magnético con PBS.</li>
		<li>Vuelva a suspender las perlas en 100 μL de PBS y añada 0,2 μg de anticuerpo anti-CD3 humano de ratón y 2 μg de anticuerpo anti-CD28 humano de ratón. Mezcle suavemente la mezcla con una pipeta y recoja durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Lave las perlas 2 veces con un soporte magnético con PBS y vuelva a suspenderlas en 100 μL de PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>En el paso 1.2, añada inmunoperlas recubiertas con anti-hCD3/hCD28 a la placa en una proporción de perlas por célula de 1:1. Coloque la placa en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 °C.</li>
	<li>Después de 48 h de incubación, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml después de mezclar suavemente las células con una pipeta. Coloque el tubo en un soporte magnético durante 3 minutos, luego transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mL para eliminar las inmunoperlas de los PBMC.</li>
	<li>Tome una alícuota para el conteo de células, luego siembre las PBMC a 5 × 105 células/pocillo en 300 μL de TGM en una placa plana de 48 pocillos. Añadir 200 μL de caldo lentiviral en los pocillos correspondientes y añadir sulfato de protamina hasta una concentración final de 10 μg/mL.</li>
	<li>Centrifugar la placa a 1.000 × g a 32 °C durante 1,5 h y retirar y desechar con cuidado 300 μL de sobrenadante de cada pocillo con una pipeta. A continuación, añada 1 mL de TGM fresco con una pipeta y coloque la placa en una incubadora humidificada con 5% deCO2 a 37 °C.</li>
	<li>Agregue TGM fresco para ajustar la densidad celular a 0.5-2 × 106 células/mL cada 2-3 días. Comience transfiriendo las células primero a una placa de 12 pocillos y luego a una placa de 6 pocillos. Continúe cultivando las células hasta que el número total alcance 6 × 106 en un volumen de 4 ml. NOTA: Paralelamente, realice la transducción CAR de las células T Jurkat siguiendo los mismos procedimientos descritos anteriormente, excepto que el TGM se reemplaza con RPMI1640 medio que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS).</li>
</ol>2. Evaluación de la expresión de CAR dependiente de oxígeno en células CAR-T mediante citometría de flujo
<ol><li>Coloque las células T transducidas por CAR del paso 1,8 en dos placas de 12 pocillos a una densidad de 2,5 × 106 células/pocillo en 2 ml de TGM. Coloque una placa directamente en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 °C (condición normóxica, ya que la condición estándar para las células de cultivo tiene 21% de O2) y coloque la otra placa en una cámara de incubación móvil de CO2/O2/N2 con el nivel de O2 preestablecido al 1% (condición hipóxica) y luego mantenga la cámara en un lugar humidificado, Incubadora 5% CO2/94% N2 a 37 °C.</li>
	<li>Cada 24 h, recoja 5 × 105 células de las placas en condiciones hipóxicas o normóxicas en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar los tubos a 500 × g durante 5 min, retirar el sobrenadante y resuspender suavemente las células en 1 mL de PBS mediante pipeteo. Repita el lavado de PBS una vez más.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células peletizadas en 50 μL de tampón FACS (PBS suplementado con 2% de FBS) en cada tubo. Añadir 50 μL de una dilución 1:100 de anticuerpo anti-Flag conjugado con PE (0,2 μg/mL) y mezclar bien mediante pipeteo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min.</li>
	<li>Al final de la incubación, agregue 1 mL de tampón FACS a cada tubo. Mezclar bien pipeteando, luego centrifugar a 500 × g durante 5 min.</li>
	<li>Retire y deseche con cuidado el sobrenadante con una pipeta y repita el paso 2.4 una vez más.</li>
	<li>Retire y deseche con cuidado el sobrenadante con una pipeta. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón FACS, luego transfiera la suspensión celular resultante a tubos de flujo de 5 mL.</li>
	<li>Realice la citometría de flujo en la suspensión de la célula en el paso 2.6 para determinar la expresión de CAR en la superficie. Incluir linfocitos T no transfectados como control negativo.<ol><li>Utilice las puertas FSC/SSC y FSC-A/FSC-H para examinar células individuales vivas. Recopila 1 × 104 eventos individuales en vivo para cada muestra. Conecte las células positivas para EGFP (un marcador constitutivo transportado en el vector lentiviral como indicador de células T transducidas con éxito) y luego, las células positivas para ficoeritrina (PE) (células que expresan CAR) para medir la positividad de PE y la intensidad media de fluorescencia (MFI).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análisis de la dependencia del oxígeno de la expresión de CAR en células Jurkat T modificadas con CAR mediante Western blot
<ol><li>Coloque las células Jurkat T transducidas por CAR de la sección 1 en dos placas de 48 pocillos a una densidad de 5 × 105 células por pocillo (volumen de cultivo de 500 μL) en medio RPMI1640 con 10 % de FBS.</li>
	<li>Para una placa, agregue CoCl2 a los pocillos experimentales hasta una concentración final de 0 μM, 50 μM o 200 μM. A continuación, coloque la placa en una incubadora humidificada con 5% deCO2 a 37 °C (condición normóxica). Para la otra placa, no agregue CoCl2 y colóquela en una cámara de incubadora móvil de CO2/O2/N2 con el nivel de O2 preestablecido al 1% (condición hipóxica) antes de transferirla a la misma incubadora.</li>
	<li>Después de 24 h de incubación, transfiera las suspensiones celulares a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar los tubos a 500 × g durante 5 min. Retire y deseche completamente los sobrenadantes primero con una pipeta de 1 mL, luego con una pipeta de 100 μL y vuelva a suspender los gránulos celulares en 50 μL de tampón de muestra SDS-PAGE 1x.</li>
	<li>Calentar las muestras en un baño de agua hirviendo durante 10 min. Coloque inmediatamente el tubo en hielo durante 30 s, luego centrifugue a 16.000 × g durante 30 s.</li>
	<li>Cargue 30 μL de las muestras aclaradas en cada ranura de un gel SDS PAGE de 10 pocillos al 10% con un grosor de 1,5 mm. Haga funcionar el gel a 80 V durante 30 minutos, luego aumente el voltaje a 100 V y deje funcionar durante 1,5 h.</li>
	<li>Al final de la electroforesis, transfiera las proteínas del gel a una membrana de PVDF utilizando el método de transferencia húmeda estándar, con la corriente y la duración establecidas en 400 mA y 1 h, respectivamente.</li>
	<li>Bloquee la membrana en el tampón de bloqueo (5% de leche (p/v) en PBST (PBS+0,05% Tween-20)) durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, corte la pieza entre 30 kD y 40 kD para la detección del control de carga GAPDH y la pieza entre 50 kD y 70k D para la detección de las moléculas CAR.</li>
	<li>Incubar las piezas de 30-40 kD y 50-70 kD con un anticuerpo anti-GAPDH de ratón (dilución 1:2.000) y un anticuerpo anti-Flag de ratón (dilución 1:2.000), respectivamente, en 3 mL de tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 2 h o a 4 °C durante la noche.</li>
	<li>Lave las membranas con PBST a temperatura ambiente en un balancín de plataforma durante 3 x 5 min.</li>
	<li>Incubar las membranas con anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con HRP (dilución 1:5.000) en 3 mL de tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h; luego lave la membrana con PBST durante 5 x 10 min.</li>
	<li>Desarrolle las membranas mediante la incubación de las mismas con un sustrato HRP y, a continuación, visualice las bandas de proteínas detectadas mediante un analizador de imágenes luminiscentes.</li>
</ol>4. Evaluación in vitro de la dependencia de oxígeno de la citotoxicidad mediada por células CAR-T sensibles a la hipoxia
<ol><li>En el día 0, siembra 1 × 104 células diana (células SKOV3-Luc) por pocillo experimental en 200 μL de DMEM que contenían 10% de FBS en dos placas de cultivo de tejidos negras de fondo plano de 96 pocillos.</li>
	<li>El día 1, retire con cuidado 100 μL del sobrenadante de la parte superior de cada pocillo. Agregue células CAR-T o células T no transducidas en proporciones efectora-objetivo de 1:1, 2:1 y 4:1 en 100 μL de medio DMEM que contenga 10% de FBS.</li>
	<li>Coloque una placa en una atmósfera de 21% de O2 y la otra en una atmósfera de 1% de O2 utilizando una cámara de incubación móvil de CO2/O2/N2 , como se describe en el paso 2.1. NOTA: Si no se dispone de una cámara incubadora móvil de CO2/O2/N2 , se puede utilizar la adición de CoCl2al medio de cultivo para imitar una condición hipóxica.</li>
	<li>El día 2, después de 24 h de co-cultivo, transfiera cuidadosamente todo el sobrenadante (aproximadamente 150-200 μL) a una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U utilizando una pipeta. Almacenar a -20 °C para su posterior detección de citocinas, siguiendo los procedimientos descritos en la sección 5.</li>
	<li>Agregue 60 μL de tampón de lisis pasiva 1x a cada pocillo experimental de las placas negras de fondo plano de 96 pocillos del paso 4.4. A continuación, coloque las placas en un agitador y agite durante 30 minutos para garantizar una lisis celular eficaz.</li>
	<li>Agregue 60 μL de sustrato de luciferasa de luciferasa de luciérnaga a cada pocillo experimental y mida la actividad de luciferasa inmediatamente usando un lector de microplacas.</li>
	<li>Calcule la citotoxicidad normalizada (%) utilizando la ecuación (1): Citotoxicidad normalizada (%) = 100 - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66697/66697eq01.jpg" style="margin: auto;"> ×100 (1)</li>
</ol>5. Detección de la secreción de IL-2 e IFN-γ por células CAR-T sensibles a la hipoxia
<ol><li>El día 0, prepare una dilución 1:250 de IL-2 o IFN-γ anticuerpo de captura en Coating Buffer. Agregue 100 μL del anticuerpo diluido a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos e incube la placa a 4 °C durante la noche. NOTA: El tampón de recubrimiento se fabrica disolviendo 7,13 g de NaHCO3 y 1,59 g de Na2CO3 en 1 L de agua destilada y ajustando el pH a 9,5.</li>
	<li>El día 1, retire el anticuerpo de captura no adsorbido volteando vigorosamente la placa boca abajo, luego lave los pocillos 3 veces con 200 μL de tampón de lavado (PBS que contiene 0.05% Tween 20).</li>
	<li>Añada 200 μL de diluyente de ensayo (PBS que contenga un 10% de FBS) a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Deseche la solución volteando vigorosamente el plato boca abajo; luego, lave los pocillos 3 veces con 200 μL de tampón de lavado.</li>
	<li>Descongele las muestras/placas de sobrenadante congeladas del paso 4.4 a temperatura ambiente. Una vez que estén completamente descongelados, diluya las muestras y los patrones con el diluyente de ensayo. Añada 100 μL de muestras diluidas o patrones a cada pocillo de la placa ELISA recubierta e incube a temperatura ambiente durante 2 h. NOTA: Para la detección de IL-2, se recomienda una dilución de 10 veces, mientras que para la detección de IFN-γ, se prefiere una dilución de 50 veces.</li>
	<li>Retire las muestras y los patrones volteando vigorosamente la placa al revés, luego lave los pocillos 5 veces con 200 μL de tampón de lavado por pocillo.</li>
	<li>Prepare una solución de detección funcional diluyendo el anticuerpo de detección de IL-2 o el anticuerpo de detección de IFN-γ/estreptavidina-HRP (SAv-HRP) en una proporción de 1:250 en el diluyente de ensayo. Añada 100 μL de la solución de detección de trabajo a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante 1 h agitando suavemente.</li>
	<li>Deseche la solución y lave los pocillos 7 veces con 200 μL de tampón de lavado.</li>
	<li>Agregue 100 μL de reactivo de sustrato a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Añada 50 μL de solución de parada (1 M H2SO4) a cada pocillo. Lea inmediatamente la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Validación funcional de células CAR-T sensibles a la hipoxia para tumores selectivos

<ol><li>Boardman, A. P., Salles, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+in+large+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma.</a> Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).</li>
<li>Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T%3A+What+is+next%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">CAR-T: What is next.</a> Cancers. 15 (3), 663(2023).</li>
<li>Barsan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+utilisation+and+outcomes+across+refractory%2C+first+relapse+and+multiply+relapsed+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+A+retrospective+analysis+of+real-world+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22eClinicalMedicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns.</a> eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+virus+delivery+of+dual+CAR+targets+of+CD19+and+BCMA+as+well+as+immunomodulators+to+enhance+therapeutic+efficacy+in+solid+tumors+combined+with+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy.</a> Front Oncol. 12, 1037934(2022).</li>
<li>Liu, C., Qi, T., Milner, J. J., Lu, Y., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speed+and+location+both+matter%3A+Antigen+stimulus+dynamics+controls+CAR-T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Speed and location both matter: Antigen stimulus dynamics controls CAR-T cell response.</a> Front Immunol. 12, 748768(2021).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+anti-solid+tumor+efficacy+of+CAR-T+cells+by+inhibiting+adenosine+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).</li>
<li>Derenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+strategies+to+enhance+CAR+T+cell+persistence+for+patients+with+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors.</a> Front Immunol. 10, 218(2019).</li>
<li>Fu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+techniques+for+enhancing+CAR+T+cell+therapy+against+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Delivery techniques for enhancing CAR T cell therapy against solid tumors.</a> Advanced Functional Materials. 31 (44), 2009489(2021).</li>
<li>Johnson, A., Townsend, M., O'Neill, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+immunosuppression%3A+A+roadblock+to+CAR+T-cell+advancement+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment immunosuppression: A roadblock to CAR T-cell advancement in solid tumors.</a> Cells. 11 (22), 3626(2022).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+tumor+immune+microenvironment+and+its+optimization+from+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy.</a> Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+tumor+physical+microenvironment+for+fueling+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Modulating tumor physical microenvironment for fueling CAR-T cell therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 185, 114301(2022).</li>
<li>Martinez, M., Moon, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+for+solid+tumors%3A+New+strategies+for+finding%2C+infiltrating%2C+and+surviving+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment.</a> Front Immunol. 10, 128(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunosuppressive+microenvironment+and+immunotherapy+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunosuppressive microenvironment and immunotherapy in human glioblastoma.</a> Front Immunol. 13, 1003651(2022).</li>
<li>Tie, Y., Tang, F., Wei, Y. Q., Wei, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+cells+in+cancer%3A+Mechanisms+and+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive cells in cancer: Mechanisms and potential therapeutic targets.</a> J Hematol Oncol. 15 (1), 61(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+CAR+T+cells+for+enhanced+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Engineering CAR T cells for enhanced efficacy and safety.</a> APL Bioeng. 6 (1), 011502(2022).</li>
<li>Al-Haideri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+combination+therapy%3A+The+next+revolution+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">cell combination therapy: The next revolution in cancer treatment.</a> Cancer Cell Int. 22 (1), 365(2022).</li>
<li>Fuca, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+chimeric+antigen+receptor+T-cell+efficacy+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancing chimeric antigen receptor T-cell efficacy in solid tumors.</a> Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+-+assessment+and+management+of+toxicities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities.</a> Nat Rev Clin Oncol. 15 (1), 47-62 (2018).</li>
<li>Mi, J., Ye, Q., Min, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+nanotechnology+development+to+overcome+current+roadblocks+in+CAR-T+therapy+for+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in nanotechnology development to overcome current roadblocks in CAR-T therapy for solid tumors.</a> Front Immunol. 13, 849759(2022).</li>
<li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy%3A+Current+limitations+and+potential+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+J%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).</li>
<li>Yu, S., Yi, M., Qin, S., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+Safety+strategies+to+overcome+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Next generation chimeric antigen receptor T cells: Safety strategies to overcome toxicity.</a> Mol Cancer. 18 (1), 125(2019).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+Early+successes+in+blood+cancer+and+challenges+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: Early successes in blood cancer and challenges in solid tumors.</a> Acta Pharm Sin B. 11 (5), 1129-1147 (2021).</li>
<li>Van Der Schans, J. J., Van De Donk, N., Mutis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+to+overcome+current+challenges+in+multiple+myeloma+CAR+T-cell+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Dual targeting to overcome current challenges in multiple myeloma CAR T-cell treatment.</a> Front Oncol. 10, 1362(2020).</li>
<li>Andrea, A. E., Chiron, A., Bessoles, S., Hacein-Bey-Abina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+next-generation+car-t+cells+for+better+toxicity+management%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Engineering next-generation car-t cells for better toxicity management.</a> Int J Mol Sci. 21 (22), 8620(2020).</li>
<li>Flugel, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+on-target%2C+off-tumour+toxicity+of+CAR+T+cell+therapy+for+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours.</a> Nat Rev Clin Oncol. 20 (1), 49-62 (2023).</li>
<li>Rababah, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+therapy+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells therapy in solid tumors.</a> Clin Transl Oncol. 25 (8), 2279-2296 (2023).</li>
<li>Masoud, G. N., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hif-1alpha+pathway%3A+Role%2C+regulation+and+intervention+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">Hif-1alpha pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy.</a> Acta Pharm Sin B. 5 (5), 378-389 (2015).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+hif-1+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting hif-1 for cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 3 (10), 721-732 (2003).</li>
<li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia--a+key+regulatory+factor+in+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth.</a> Nat Rev Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).</li>
<li>Juillerat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+sensitive+self-decision+making+engineered+CAR+T-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell.</a> Sci Rep. 7, 39833(2017).</li>
<li>Liao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+T+cells+with+hypoxia-inducible+chimeric+antigen+receptor+%28HiCAR%29+for+selective+tumor+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering T cells with hypoxia-inducible chimeric antigen receptor (HiCAR) for selective tumor killing.</a> Biomark Res. 8 (1), 56(2020).</li>
<li>Ivan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hif%CE%B1+targeted+for+vhl-mediated+destruction+by+proline+hydroxylation%3A+Implications+for+o2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hifα targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for o2 sensing.</a> Science. 292 (5516), 464-468 (2001).</li>
<li>Wang, G. L., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 270 (3), 1230-1237 (1995).</li>
<li>D'alonzo, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+noninvasive+preclinical+tumor+hypoxia+imaging+methods%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo noninvasive preclinical tumor hypoxia imaging methods: A review.</a> Int J Radiat Biol. 97 (5), 593-631 (2021).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+car-t+cells+by+hypoxia-inducible+transcription+amplification+%28hita%29+system+significantly+enhances+systemic+safety+and+retains+antitumor+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Conditioned car-t cells by hypoxia-inducible transcription amplification (hita) system significantly enhances systemic safety and retains antitumor efficacy.</a> J Immunother Cancer. 9 (10), e002755(2021).</li>
<li>Barsoum, I. B., Smallwood, C. A., Siemens, D. R., Graham, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+hypoxia-mediated+escape+from+adaptive+immunity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells.</a> Cancer Res. 74 (3), 665-674 (2014).</li>
<li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+metabolism%3A+Cancer%27s+achilles%27+heel%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel.</a> Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 1,5 mL</td><td>QSP</td><td>509-GRD-Q</td><td>Supernadantes y células Protocolo Cellection Paso 2,3,4</td></tr><tr><td>10% ExpressCast PAGE</td><td>NCM biotech</td><td>P2012</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>NCM biotech</td><td>20220812</td><td>Protocolo de cultivo celular Paso 4</td></tr><tr><td>Pipeta de 10 mL</td><td>Yueyibio</td><td>YB-25H</td><td>Pipetting Protocolo Paso 1</td></tr><tr><td>Tampón de electroforesis 10xTRIS-Glycine-SDS</td><td>Epizyme</td><td>3673020</td><td>Immunoblotting Protocolo Paso 3</td></tr><tr><td>15 mL Tubo de centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>Supernadantes y células cellection Protocol Paso 1</td></tr><tr><td>25 cm2 EasYFlask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td>Protocolo de cultivo celular Paso 3,4</td></tr><tr><td>4x Protein SDS PAGE Tampón de carga</td><td>Takara</td><td>9173</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos</td><td>Protocolo de cultivo de células T</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td> Paso 1</tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos negras de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>Protocolo de ensayo de citotoxicidad Paso 4</td></tr><tr><td>Placas ELISA de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3590</td><td>Protocolo ELISA Paso 5</td></tr><tr><td>Agitador de placas de 96 pocillos</td><td>QILINBEIER</td><td>MH-2</td><td>Protocolo Shake Paso 4</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos con fondo en U de 96 pocillos Thermo</td><td>Scientific</td><td>268200</td><td>Supernadantes Protocolo cellection Paso 4,5</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>Carbinol</td><td>Sinopharm</td><td>10010061</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>Incubadora de dióxido de carbono</td><td>Thermo Scientific</td><td>360</td><td>Protocolo de cultivo celular Paso 1,2,3,4</td></tr><tr><td>Placa de recuento de células</td><td>Hausser scientific</td><td>1492</td><td>Protocolo de recuento de células Paso 1,3,4</td></tr><tr><td>CELLection Pan Mouse IgG Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>11531D</td><td>Mouse IgG perlas magnéticas Protocolo Paso 1</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002432</td><td>Cultivo celular Protocolo Paso 1,3,4</td></tr><tr><td>Sistema de imagen en gel de quimioluminiscencia</td><td>BIO-RAD</td><td>12003154</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de cobalto (0,5 M)</td><td>bioleaper</td><td>BR4000203</td><td>Condición hipóxica Protocolo Paso 2,3,4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-103- Protocolo de</td><td>cultivo de células CV Paso 4</td></tr><tr><td>Balanza electrónica</td><td>Sartorius</td><td>PRACTUM612-1CN</td><td>Protocolo de peso Paso 5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td>Protocolo de cultivo celular Paso 3,4</td></tr><tr><td>GAPDH Ratón mAb</td><td>ABclonal</td><td>AC002</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis en gel</td><td>BIO-RAD</td><td>1645070</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>Lectores de microplacas GloMax</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td>Medición de la actividad de la luciferasa Protocolo Paso 4</td></tr><tr><td>IgG (H+L) anti-ratón</td> de <td>cabra Yeasen</td><td>P1126151</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>Centrífuga de microcongelación de alta velocidad</td><td>eppendorf</td><td>5810&nbsp; R</td><td>Protocolo de cultivo de células Paso 1</td></tr><tr><td>IFN-& Conjunto de ELISA</td><td>BD</td><td>555142</td><td>protocolo ELISA paso 5 Artículos: IFN-y gamma humano recombinante; Estándar liofilizado, anticuerpo de detección biotina anti-IFN-humano y gamma; , Captura de anticuerpos anti-humanos purificados IFN-&gamma;, Reactivo enzimático Estreptavidina-rábano picante peroxidasa conjugado (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>Conjunto de ELISA IL-2 humano</td><td>BD</td><td>555190</td><td>ELISA Protocolo Paso 5 Artículos: Estándar liofilizado de IL-2 humano recombinante, Anticuerpo de detección Biotina anti-IL-2 humana , Anticuerpo de captura Anti-IL-2 humano purificado, Reactivo enzimático Conjugado de peroxidasa estreptavidina-rábano picante (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>R& D systems</td><td>P40933</td><td>Protocolo de cultivo de células T Paso 1</td></tr><tr><td>IL-21</td><td>Novoproteína</td><td>GMP-CC45</td><td>Protocolo de cultivo Paso 1</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R& Sistemas</td><td>D P13232</td><td>Protocolo de cultivo de células T Paso 1</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Protocolo de cultivo celular Paso 1,3,4</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Protocolo de construcción CAR-Jurkat Paso 3</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>Protocolo de citometría de flujo </td><td>LSRFortessa</td> Paso 2</tr><tr><td>Sistema</td> <td>de ensayo de luciferasaEnsayo indicador de</td> luciferasa Promega <td>E1501</td><td> Protocolo Paso 4 Artículos: Tampón de lisis pasiva, sustrato de luciferasa luciferasa de luciérnaga</td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>BioTek</td><td>HTX</td><td>ELISA Protocolo Paso 5</td></tr><tr><td>móvil CO2/O2/N2 Cámara de incubadora</td> China <td>Innovation Instrument Co., Ltd.</td><td>Smartor118</td><td>Protocolo de condición hipóxica Paso 2, 3, 4</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Hexa Etiqueta de histidina</td><td>Sigma</td><td>SAB2702218</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>Tampón de transferencia rápida NcmBlot</td><td>NCM biotech</td><td>WB4600</td><td>Immunoblotting</td></tr><tr><td>NcmECL Ultra</td><td>NCM biotech</td><td>P10300</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3 Artículos: NcmECL Ultra Luminol/Reactivo Potenciador (A) ,NcmECL Reactivo de Peróxido Ultra Estabilizado (B)&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas planas de 48 pocillos recubiertas de NovoNectin</td><td>Construcción</td><td>de células CAR-T GMP-CH38</td><td> Paso 1</td></tr><tr><td>Juego de comprimidos OPD (diclorhidrato de o-fenilendiamina)</td><td>Sigma</td><td>P9187</td><td>Protocolo de reactivo de sustrato Paso 5 Artículos: Tableta de OPD (lámina de plata),Tableta de peróxido de hidrógeno urea (lámina de oro)</td></tr><tr><td>Conjugado con PE anti-DYKDDDDK</td><td>Biolegend</td><td>637310</td><td>Protocolo de citometría de flujo Paso 2</td></tr><tr><td>Sulfato de protamina</td><td>Sigma</td><td>P3369-1OG</td><td>Protocolo de infección por lentivirus Paso 1 Marcador</td></tr> de <tr><td>proteína 10 Kda-250 KDa</td><td>Epizyme</td><td>WJ102</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>&nbsp; Cultivo de células T 566685 CD3 BD de ratón humano <[> de ratón NA/LE purificadas</td><td></td><td></td><td> Paso 1</td></tr><tr>Protocolo de cultivo de células<td>T 555725 CD28 BD BD de ratón NA/LE purificadas</td><td></td><td></td><td>Paso 1 Protocolo de cultivo de células </td></tr><tr><td>membrana de PVDF</td><td>Millipore</td><td>168627</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>Protocolo RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRC</td><td>Cell culture Paso 3</td></tr><tr><td>Leche desnatada en polvo</td><td>Yeasen</td><td>S9129060</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>SKOV3-Luc</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Ensayo de citotoxicidad Protocolo Paso 4</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>NCM biotech</td><td>C125C1</td><td>Protocolo de cultivo celular Paso 4</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sinopharm</td><td>30189328</td><td>Protocolo Immunoblotting Paso 3</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>keelrein</td><td>NB014467</td><td>Heating Protocol Paso 1</td></tr><tr><td>X-VIVO 15&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td>Medio de cultivo de linfocitos sin suero Protocolo Paso 1</td></tr></tbody></table>

generación y verificación funcional de células t receptoras de antígenos quiméricos sensibles a la hipoxia

Generation and Functional Verification of Hypoxia-Sensitive Chimeric Antigen Receptor-T Cells

La fusión del dominio ODD de HIF-1α con la fracción CAR representa una estrategia primaria para generar un CAR sensible a la hipoxia. El CAR sensible a la hipoxia dirigido a HER2 analizado en este estudio, denominado HER2-BBz-ODD, se construyó utilizando esta estrategia mediante la integración de la secuencia ODD en su HER2-BBz convencional (Figura 1A). En este estudio, utilizamos la transducción lentiviral para expresar HER2-BBz-ODD CAR o HER2-BBz CAR y, posteriormente, examinamos su sensibilidad al oxígeno en dos tipos de células: PBMC humanas y células T Jurkat.
El primer examen es la expresión de CAR en condiciones hipóxicas frente a condiciones normóxicas, que se llevó a cabo tanto en células T derivadas de PBMC transducidas con CAR por citometría de flujo como en células T Jurkat transducidas por CAR mediante Western blot. En el contexto de las células T derivadas de PBMC transducidas por CAR, observamos que CAR2-BBz-ODD CAR tenía una expresión significativamente mayor por debajo del 1% deO2 que por debajo del 21% deO2 en términos del porcentaje de células CAR positivas y la intensidad de fluorescencia media (MFI) (Figura 1B). El análisis de inmunotransferencia de las células T Jurkat transducidas por CAR también confirmó la inducción dependiente de la hipoxia de HER2-BBz-ODD.
Vale la pena señalar que, en este contexto, la condición hipóxica se puede imitar convenientemente agregando CoCl2, un inductor químico de la hipoxia, al medio de cultivo. Como se ilustra en la Figura 1C, los resultados de la inmunotransferencia demostraron que la exposición a 50 o 200 μM deCoCl2 recapituló el efecto de la exposición al 1% deO2, induciendo marcadamente la expresión del CAR HER2-BBz-ODD, pero no la del CAR HER2-BBz. La caracterización funcional de la CAR sensible a la hipoxia se llevó a cabo con células CAR-T derivadas de PBMC. En el estudio, se utilizó una línea celular SKOV-3 portadora de luciferasa de luciferasa de luciérnaga como línea celular objetivo. Esta configuración nos permitió medir la actividad de la luciferasa asociada a las células diana como un proxy para evaluar la citotoxicidad mediada por células CAR-T cocultivadas.
Como se muestra en la Figura 1D, las mediciones indicaron que las células CAR-T HER2-BBz matan eficazmente a las células objetivo, independientemente de si la atmósfera era normóxica o hipóxica. Por el contrario, las células CAR-T HER2-BBz-ODD mostraron una citotoxicidad significativamente más débil en condiciones normóxicas para las tres relaciones E:T examinadas. Sin embargo, su citotoxicidad aumentó significativamente cuando se expusieron a condiciones hipóxicas. Los niveles sobrenadantes de IL-2 e IFN-γ también se midieron mediante ELISA después de cocultivar células CAR-T con células diana durante 24 h. Para ambas citocinas, se observó una mayor secreción por debajo del 1% deO2 en comparación con el 21% deO2 para las células CAR-T HER2-BBz-ODD, lo que es consistente con los datos de citotoxicidad. Por el contrario, las células CAR-T HER2-BBz mostraron una menor secreción de las dos citocinas por debajo del 1% deO2 en comparación con el 21% deO2, lo que indica un impacto adverso de la hipoxia en la actividad celular (Figura 1E). Tomados en conjunto, estos resultados validaron de manera convincente la naturaleza sensible a la hipoxia de HER2-BBz-ODD CAR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66697/66697fig01.jpg"> Figura 1: Construcción y caracterización de células CAR-T sensibles a la hipoxia. (A) Representación esquemática de los diseños de un CAR sensible a la hipoxia, HER2-BBz-ODD, y su contraparte convencional, HER2-BBz. Ambos CAR constan de un péptido señal CD8α N-terminal, una etiqueta FLAG, un scFv humano dirigido a HER2, un dominio transmembrana y bisagra CD8, y una porción intracelular compuesta por un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización CD3ξ, un IRES y un EGFP. HER2-BBz-ODD difiere de HER2-BBz en la fusión de un dominio ODD con el C-terminal del dominio de señalización CD3ξ, lo que permite su expresión hipóxica dependiente al promover su degradación dependiente de ubiquitina en condiciones normóxicas. (B,C) Evaluaciones de la expresión dependiente de oxígeno de HER2-BBz-ODD CAR. (B) Se realizó una evaluación con células CAR-T derivadas de PBMC humanas después de cultivar por debajo del 1% o 21% deO2 durante 24, 48 o 72 h mediante citometría de flujo. (C) La otra evaluación fue con células Jurkat T transducidas por CAR, donde los lisados celulares se recolectaron 24 h después de cultivar por debajo del 21% de O2, 50 o 200 μM de CoCl2, o 1% de O2 y se analizó la expresión de CAR mediante Western blot, con células transducidas por CAR HER2-BBz incluidas como control. (D,E) Citotoxicidad in vitro y secreción de citocinas de células CAR-T en diferentes condiciones de oxígeno. (D) Las células CAR-T se cocultivaron con células SKOV3 que expresan luciferasa de luciferasa de luciérnaga en proporciones E:T indicadas por debajo del 1% o 21% deO2. Después de 24 h de co-cultivo, la eficiencia de la eliminación de células diana se determinó midiendo el cambio en la actividad de luciferasa de luciérnaga asociada a la célula en relación con la de las células T no transducidas. (E) Los sobrenadantes se recolectaron para la detección de IL-2 e IFN-γ secretados. Los resultados se muestran como la media ± SEM (n = 3 donantes sanos) (****p &lt; 0,0001). Abreviaturas: scFv = variable de fragmento de cadena simple; CAR = receptor quimérico de antígenos. Los paneles C y D son una adaptación de Liao et al.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66697/66697fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Generación y verificación funcional de células T receptoras de antígenos quiméricos sensibles a la hipoxia

Extensive studies have proven the promise of chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy in treating hematological malignancies. However, treating ...

generation-functional-verification-hypoxia-sensitive-chimeric-antigen

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video muestra una técnica para fabricar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) ex vivo. Las células T humanas se incuban con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, junto con un medio suplementado con interleucina-2 (IL-2), lo que conduce a la activación y proliferación de las células T. Se introducen vectores lentivirales transgénicos, lo que permite que el ARN transgénico se integre en el genoma del huésped y exprese el transgén. Esto da como...

Una técnica ex vivo para fabricar linfocitos T receptores de antígenos quiméricos

Este video muestra una técnica para la generación ex vivo de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de antígeno tumoral. Los vectores retrovirales portadores de ARN transgénico se mezclan con células de bazo en un medio suplementado con interleucina-2 para promover la supervivencia y proliferación de las células T. A continuación, la mezcla se transfiere a una placa recubierta con fragmentos de fibronectina humana recombinante y se centrifuga para facilitar la fusión del...

Una técnica ex vivo para generar células T receptoras de antígenos quiméricos específicos de tumores

Describimos un sistema de ensayo cuantitativo de citolisis in vitro en tiempo real para evaluar la potencia de las células T del receptor de antígeno quimérico dirigidas a células tumorales líquidas y sólidas. Este protocolo se puede ampliar para evaluar otras células efector inmune, así como tratamientos combinados.

Un ensayo de potencia en tiempo real para células T receptores de antígeno quimérico dirigido a células cancerosas sólidas y hematológicas

Este protocolo describe la metodología para el seguimiento no invasivo de células T genéticamente modificadas para expresar receptores de antígenos quiméricos in vivo con una plataforma clínicamente disponible.

Imágenes dinámicas de células T receptoras de antígeno quimérico con [18F]Tomografía por emisión de positrones tetrafluoroborato/Tomografía computarizada

Este protocolo describe el proceso de transducción de células T humanas primarias con un gen de interés, lo que garantiza la compatibilidad con los estándares de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP).

Un procedimiento conforme a las GMP para la generación de células T modificadas genéticamente

En este artículo se detalla el proceso de fabricación de linfocitos T receptores de antígenos quiméricos para uso clínico, concretamente utilizando un procesador celular automatizado capaz de realizar la transducción viral y el cultivo de linfocitos T. Proporcionamos recomendaciones y describimos los escollos que deben tenerse en cuenta durante el desarrollo del proceso y la implementación de un ensayo clínico de fase inicial.

Fabricación de células T con receptor de antígeno quimérico en un procesador celular automatizado

Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.

Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Este protocolo describe un procedimiento detallado para generar células T con receptor de antígeno quimérico transitorio (CAR) utilizando ARNm no integrador para la inmunoterapia contra el cáncer y proporciona métodos confiables para evaluar las células CAR-T y su función citotóxica.

Un enfoque no viral para generar células T receptoras de antígenos quiméricos transitorios mediante ARNm para la inmunoterapia contra el cáncer

Aneuploide conduce a inestabilidad genómica, que eventualmente produce células ciclo celular detenido con los karyotypes complejos. Este artículo proporciona un método simple y conveniente para aislar células aneuploides con los karyotypes complejos que dejan de dividirse.

Generación y el aislamiento de células de ciclo celular detenido con los Karyotypes complejos

Aprende a generar células T CAR sensibles a la hipoxia mediante lentivirus y verifica su citotoxicidad selectiva en tumores sólidos. Este protocolo mejora la seguridad y eficacia en inmunoterapia oncológica.

Generación y verificación funcional de células T receptoras de antígenos quiméricos sensibles a la hipoxia

Explorar más videos