Name: Diagnóstico basado en CRISPR en el punto de atención con reactivos premezclados y liofilizados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprende a desarrollar diagnósticos CRISPR en el punto de atención utilizando reactivos liofilizados premezclados. Este método combina amplificación isotérmica y detección CRISPR para identificar patógenos infecciosos con alta sensibilidad.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo de diagnóstico molecular optimizado basado en CRISPR para su uso en el punto de atención

<ol><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a%2FC2c2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li>
<li>Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics.</a> Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).</li>
<li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+classification+of+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and classification of CRISPR-Cas systems.</a> Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Arizti-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Cas13-based+assays+for+the+fast+identification+of+SARS-CoV-2+and+its+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants.</a> Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).</li>
<li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+Cas13-based+assay+with+point-of-care+attributes+for+simultaneous+COVID-19+diagnosis+and+variant+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance.</a> CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+validation+of+a+Cas13-based+assay+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA.</a> Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13%2C+Cas12a%2C+and+Csm6%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li>
<li>Lee, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+CRISPR-based+diagnostic+for+field-applicable+detection+of+Plasmodium+species+in+symptomatic+and+asymptomatic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).</li>
<li>Myhrvold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-deployable+viral+diagnostics+using+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13.</a> Science. 360 (6387), 444-448 (2018).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+detection+with+CRISPR%2FCas+system+from+applications+to+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges.</a> Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13a-based+detection+for+bovine+viral+diarrhea+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus.</a> Front Vet Sci. 8, 603919(2021).</li>
<li>Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHERLOCK%3A+nucleic+acid+detection+with+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.</a> Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).</li>
<li>Selvam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-LAMP+CRISPR-Cas12%2F13-based+SARS-CoV-2+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods.</a> Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).</li>
<li>Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+visually+readable+loop-mediated+isothermal+reverse+transcriptase+nucleic+acid+amplification+test+for+detection+Ebola+Zaire+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA.</a> J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).</li>
<li>Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+diagnostic+with+CRISPR%2FCas%3A+Beyond+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).</li>
<li>Twistamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Twistamp%C2%AE+assay+design+manual%22">Twistamp® assay design manual</a>. , (2023).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+isothermal+amplification+assay+for+viral+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An enhanced isothermal amplification assay for viral detection.</a> Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).</li>
<li>Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%3A+Challenges+and+toward+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACSSynth+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications.</a> ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).</li>
<li>Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+of+DNA-free+RNA+for+use+in+vaccine+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies.</a> Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+strand-displacement+DNA+amplification+by+a+contactless+electrochemical+microsystem+using+interdigitated+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes.</a> Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).</li>
<li>Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+molecular+enhancers+of+the+isothermal+exponential+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction.</a> Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+test+kit+for+visual+loop-mediated+isothermal+amplification+of+Salmonella+in+spiked+ready-to-eat+fruits+and+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables.</a> J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).</li>
<li>Curti, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+lyophilized+CRISPR-Cas12+assay+for+a+ensitive%2C+specific%2C+and+rapid+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Viruses. 13 (3), 420(2021).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+with+SHERLOCK+one-pot+testing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing.</a> N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).</li>
</ol>

Los diagnósticos basados en CRISPR para la detección de biomarcadores de ácidos nucleicos se informaron por primera vez en 2017 1,2,3,4 y, desde entonces, se han demostrado como diagnósticos de próxima generación con pruebas aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), particularmente para la detección del ARN del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2), en varios países 5,6,7,8. Más allá de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), se ha demostrado que las tecnologías son efectivas para detectar diversos virus y bacterias 9,10,11,12,13, mutaciones y deleciones de enfermedades genéticas, y pueden diseñarse para detectar biomarcadores de proteínas y moléculas pequeñas 2,12. Los diagnósticos basados en CRISPR a menudo combinan métodos de amplificación isotérmica, como la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) o la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)14,15, con la detección basada en CRISPR utilizando enzimas asociadas a CRISPR (Cas) guiadas por ARN con actividad endonucleasa "colateral" después del reconocimiento de objetivos3. El doble uso de la amplificación isotérmica y la detección basada en CRISPR confiere varios atributos deseables a las tecnologías, en particular una alta precisión diagnóstica cercana a la de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de referencia, y la capacidad de multiplexar y detectar pequeñas diferencias de secuencia, incluidos los polimorfismos de un solo nucleótido 1,9.
Sin embargo, las versiones más precisas de los diagnósticos basados en CRISPR contienen múltiples componentes y pasos, y pueden ser complicadas de realizar con personas no expertas o en el punto de atención (POC). Para abordar este desafío de extender el uso de diagnósticos basados en CRISPR de alta precisión a entornos POC, hemos desarrollado protocolos para preparar reacciones de detección basadas en CRISPR y amplificación isotérmica premezcladas, liofilizadas, basadas en recombinasa y CRISPR, que son fáciles de usar y almacenar7. Estos protocolos deben complementar los excelentes protocolos existentes sobre diagnósticos basados en CRISPR14, que contienen información adicional sobre la producción de componentes bioquímicos necesarios para el diagnóstico basado en CRISPR7, las directrices de diseño1 y las formulaciones que utilizan técnicas alternativas de amplificación isotérmica 2,14,15,16 y enzimas Cas12. En última instancia, esperamos que los diagnósticos basados en CRISPR puedan ayudar a realizar una detección nucleica rápida, económica y sensible en entornos donde se requieren análisis portátiles y sin instrumentos 1,9,17.
Utilizamos principalmente la combinación de RPA y detección basada en Cas13 en nuestros protocolos. RPA funciona a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente (37-42 °C) y, por lo tanto, tiene bajos requisitos de energía y equipo. Otras reacciones de amplificación isotérmica requieren temperaturas más altas (LAMP, 60-65 °C; amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), 60 °C; reacción de amplificación exponencial (EXPAR), 55 °C; y amplificación dependiente de helicasa (HDA), 65 °C)2. El diseño de los cebadores RPA tampoco es complejo, a diferencia de los cebadores LAMP, y puede extenderse a la amplificación multiplexada 7,9,14. A pesar de que la multiplexación más allá de dos objetivos con RPA es difícil en la práctica, existen directrices claras sobre cómo diseñar cebadores de RPA multiplexados para minimizar la interferencia18.
Si bien la contaminación de arrastre sigue siendo un gran problema en el flujo de trabajo de dos pasos, los amplicones generados de RPA son de tamaño pequeño y es menos probable que causen contaminación de arrastre en comparación con los amplicones concateméricos grandes de LAMP14. Los cebadores RPA se pueden diseñar de acuerdo con las pautas estándar14: generalmente tienen una longitud de 25-35 nucleótidos con temperaturas de fusión de 54 a 67 °C. El tamaño del amplicón debe ser inferior a 200 pares de bases. La enzima de transcriptasa inversa (RT) se puede agregar a RPA para permitir la amplificación a partir de ARN, y en la transcripción inversa-RPA (RT-RPA), otra enzima, la ribonucleasa H (RNasa H), generalmente se agrega en pequeñas cantidades para ayudar a resolver el híbrido de ARN: ADN resultante y promover la reacción de amplificación 5,19. Para permitir la transcripción de T7 para la detección basada en Cas13, el promotor de la ARN polimerasa T7 se puede colocar en el extremo 5' del cebador RPA directo.
Una vez que se generan amplicones a partir de RPA, se pueden detectar con enzimas Cas programadas con crRNA. Entre las diversas enzimas Cas que se pueden utilizar para la detección de amplicones, preferimos las variantes de Cas13 dirigidas al ARN debido a su alta actividad de escisión1 y a sus preferencias de escisión de polinucleótidos bien caracterizadas 7,9, la última de las cuales puede utilizarse para la detección multiplexada. La secuencia de crRNA para Cas13 está diseñada para ser complementaria (complemento inverso) al sitio diana en el ARN producido con secuencias espaciadoras y de repetición directa (DR). La secuencia de crRNA y los cebadores de RPA no deben superponerse, para evitar la detección no deseada basada en Cas de productos de amplificación fuera del objetivo, lo que aumenta los falsos positivos y de fondo14.
La detección basada en Cas se basa en diferentes modalidades de detección para monitorear la escisión de las moléculas de ácido nucleico indicador (reporteros de ARN para reacciones basadas en Cas13)1,2,14. Las diferentes modalidades de detección incluyen colorimetría, lecturas electroquímicas, fluorescencia, lecturas de secuenciación y tiras de flujo lateral2. Nos centramos en la lectura de fluorescencia dada una variedad de fluoróforos y reporteros como la cianina 5 (Cy5), la rodamina X (ROX) y la carboxifluoresceína (FAM), que pueden excitarse eficazmente utilizando una sola fuente de luz LED azul, y su fluorescencia analizada por un lector de microplacas o un termociclador en tiempo real 7,14. Además, la lectura de fluorescencia es fácil de configurar y permite un monitoreo continuo, lo que permite la cuantificación en tiempo real. La preamplificación multiplexada de RPA y la detección multiplexada basada en Cas13 utilizando enzimas Cas pueden combinarse con lecturas de fluorescencia multicolor para la detección simultánea de múltiples objetivos genéticos 2,7.
En nuestros protocolos, primero amplificamos isotérmicamente el ARN con RT-RPA añadiendo la muestra de ARN a la forma liofilizada del reactivo RT-RPA (Figura 1). Durante la RT-RPA, el promotor T7 se añade al amplicón de ADN bicatenario generado. A partir de entonces, los productos de RPA se transfieren a la detección basada en Cas13 liofilizada, que también contiene ARN polimerasa T7. Esta reacción de detección convertirá los amplicones de ADN en ARN (a través de la ARN polimerasa T7), que se puede detectar fácilmente con Cas13 programado con crRNA. El Cas13 activado por el objetivo escindirá las moléculas reporteras para producir una señal de fluorescencia detectable 2,7,14. Si bien los protocolos aquí se refieren a la detección por Leptotrichia wadei (LwaCas13a), pueden extenderse a la detección simultánea y multiplexada de hasta cuatro objetivos utilizando enzimas ortogonales Cas13 y Cas12 7,9. Las reacciones de detección basadas en RPA y Cas también pueden combinarse en un solo tubo, aunque con una pérdida de sensibilidad14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig01v2.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo de detección basado en CRISPR. El flujo de trabajo ilustra la detección de dos genes diana. En primer lugar, las regiones de interés dentro del objetivo de ADN se amplifican isotérmicamente con RPA; la reacción se puede realizar con transcripción inversa (RT-RPA) al detectar dianas de ARN. A partir de entonces, la transcripción de T7 convierte los amplicones de dsDNA en ARN, que a su vez son reconocidos por complejos Cas13-crRNA capaces de provocar actividad de ARNasa colateral tras la unión al objetivo. La escisión de los reporteros de fluorescencia apagados produce señales de fluorescencia que se pueden monitorear con un lector de microplacas, visualizar mediante un transiluminador LED o usar con un termociclador en tiempo real. Abreviaturas: CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; RT = transcripción inversa; RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; Cas = proteína asociada a CRISPR; LED = diodo emisor de luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Las características clave de los protocolos presentados aquí son las formulaciones de premezcla para la liofilización. La premezcla simplifica el uso de la reacción y mejora la reproducibilidad, pero muchos componentes dentro de la detección basada en RPA y Cas, particularmente la transcripción inversa y algunos cofactores lábiles como el ATP, no son estables en la solución. Por lo tanto, formulamos las soluciones premezcladas de manera que puedan liofilizarse para su almacenamiento a largo plazo y facilitar su transporte e implementación 1,9,20. Los reactivos premezclados liofilizados también ayudan a mejorar la sensibilidad de detección, ya que se puede añadir un mayor volumen de muestra (y, por tanto, una mayor entrada de ADN/ARN) para reconstituir la reacción10. En nuestras formulaciones, utilizamos principalmente trehalosa21 como crioprotector en reacciones de detección basadas en RPA liofilizado y Cas7. Además de la conservación de reactivos, la trehalosa también promueve las reacciones a través del aumento de la estabilización de la enzima 16,22,23,24 y la disminución de las temperaturas de fusión del dsDNA23. Las exploraciones de otros estabilizadores 5,7,21,25,26 más allá de la trehalosa pueden producir formulaciones aún más óptimas para diferentes escenarios de uso.

<table><tbody><tr><td><Fuerte>Material</fuerte>Solución de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>betaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Agua tratada con DEPC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Merck</td><td>3870-25GM</td><td></td></tr><tr><td>EpiScript transcriptasa inversa</td><td>Lucigen ERT12925K</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gly-Gly-Gly& nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-50239-1G</td><td></td></tr><tr><td>LwaCas13a</td><td>Producción interna</td><td></td> Nombre de la <td>cepa:Leptotrichia wadei, Abreviatura: Lwa, Nombre de la proteína: LwaCas13a</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de magnesio, 1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>NxGenT7 ARN polimerasa</td><td>Lucigen</td><td>30223-2</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Solución de acetato de potasio, 5M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95843-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de solución de riobnucleótidos</td><td>NEB</td><td>N0466L</td><td></td></tr><tr><td>RNasa H</td><td>NEB</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>TCI</td><td>TCI-S0111-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trehalosa Dihidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-90210-50G</td><td></td></tr><tr><td>Solución de clorhidrato de Trizma, 1M, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Kit básico</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td>BluPAD Transiluminador de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>luz Azul/Blanco LED Dual</td><td>Bio-Helix</td><td>BP001CU</td><td></td></tr><tr><td>Baño Seco Doble Bloque</td><td>ELITE</td><td>4-2-EL-02-220</td><td>Modelo: EL-02</td></tr><tr><td>Microplaca de fluorescencia Lector</td><td>Tecan</td><td></td><td>30050303 Modelo: Infinite 200 Pro</td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>LABCONCO</td><td>794001030</td><td>FreeZone Triad Liofilizador de sobremesa</td></tr><tr>Microplaca <td>Greiner</td><td>GDE0784076</td> F-Bottom<td>de 384 pocillos</td><td>, pequeño volumen, Hibase, encuadernación médica, negro</td></tr><tr><td>Termociclador en tiempo real (sistema de PCR en tiempo real CFX Connect)</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5201</td><td>Modelo: Módulo</td></tr> <tr><td>óptico CFX Connect<Oligonucleótido >fuerte</></td><td></td><td></td><td></td> gen strongs</tr> <tr><td>avance RPA cebador</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA</td></tr><tr><td>s-gene RPA inverso cebador</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG</td></tr><tr><td>n-gen forward RPA</td><td>primer IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG</td></tr><tr><td>n-gen RPA inverso cebador</td><td>IDT</td><td></td><td>CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA para el gen s</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA para el gen n</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAGAGAGAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC</td></tr><tr><td>FAM-polyU-IABkFQ reportero</td><td>IDT</td><td></td><td>56-FAM/rUrUrUrU/3IABkFQ</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_F RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_R RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA</td></tr><tr><td>synT7crRNA13a_ O_hannah&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC</td></tr></tbody></table>

diagnóstico basado en crispr en el punto de atención con reactivos premezclados y liofilizados

Point-of-care CRISPR-based Diagnostics with Premixed and Freeze-dried Reagents

Destacamos la cinética de la generación de señales de fluorescencia FAM a partir de la detección combinada de los genes s y n del SARS-CoV-2, y cómo se utilizó la información para determinar las condiciones óptimas para las formulaciones de reacción liofilizadas y premezcladas. En todos los casos, incluimos muestras con valores de Ct dentro del límite de detección determinado (LoD) (Ct ~31-33), así como aquellas con Ct en el LoD (Ct ~35-37)7, para permitir la diferenciación de protocolos con mejor sensibilidad.
En el caso de la RT-RPA liofilizada y premezclada, encontramos que la inclusión de KOAc en la reacción premezclada afectó negativamente a la sensibilidad de la reacción (Figura 2A). Por lo tanto, omitimos KOAc de la reacción premezclada y lo añadimos con el iniciador de la reacción, Mg(OAc)2, una vez que se había agregado la muestra de ARN. También utilizamos ensayos similares para determinar la concentración óptima de trehalosa crioprotectora (Figura 2B) y los efectos de la triglicina7 en la reacción RT-RPA liofilizada (Figura 2C). Por lo tanto, se prepararon reacciones óptimas de RT-RPA premezcladas y liofilizadas con trehalosa al 6%, sin KOAc (pero se añadió posteriormente después de la muestra de ARN) y se suplementaron con triglicina, como se describe en la sección 1 del protocolo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig02.jpg"> Figura 2: Optimización de reacciones RT-RPA liofilizadas y premezcladas. La reacción RT-RPA se preparó utilizando cebadores dirigidos al gen n del SAR-CoV-2. El Mg(OAc)2 se excluyó de todas las reacciones premezcladas. Se evaluaron los efectos de (A) KOAc, (B) trehalosa y (C) triglicina añadidos a las reacciones premezcladas. El monitoreo de la reacción a través de la fluorescencia FAM generada se llevó a cabo utilizando un termociclador en tiempo real o un lector de microplacas de fluorescencia. Se muestran los datos individuales de las mediciones por triplicado. Abreviaturas: RT = transcripción inversa; RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas = proteína asociada a CRISPR; SAR-CoV-2 = Coronavirus 2 del Síndrome Respiratorio Agudo Severo; Ct = umbral de ciclo; FAM = carboxifluoresceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En el caso de las reacciones liofilizadas y premezcladas basadas en Cas13a, verificamos la importancia de contar con el crioprotector correcto: la trehalosa al 6% o la sacarosa19 al 2% funcionó bien, mientras que la sacarosa más baja al 1% o al 5% p/v PEG20000 no preservó la eficiencia de la reacción después de la liofilización (Figura 3). El MgCl2 se omitió en todas las reacciones y se añadió en la etapa de rehidratación. La reacción óptima de detección basada en Cas13 liofilizado se preparó con trehalosa al 6%, como se muestra en la sección 2 del protocolo.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig03.jpg"> Figura 3: Optimización de reacciones de detección basadas en Cas13 liofilizadas y premezcladas. La reacción de detección se realizó a 37 °C utilizando el producto RPA del gen n del SARS-CoV-2. Las pruebas se realizaron antes y después de la liofilización. El MgCl2 se excluyó de todas las reacciones premezcladas. Se evaluaron las capacidades de (A) trehalosa, (B) PEG20000 y (C) sacarosa para preservar la eficiencia de la reacción después de la liofilización. El monitoreo de la reacción a través de la fluorescencia FAM generada se llevó a cabo utilizando un termociclador en tiempo real. Se muestran los datos individuales de las mediciones por triplicado para las condiciones "después de la liofilización" y una réplica de las condiciones "antes de la liofilización". La figura 3A,B fue tomada de Patchsung et al.7. Abreviaturas: RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; SAR-CoV-2 = coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo; FAM = carboxifluoresceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los reactivos liofilizados y premezclados para reacciones basadas en RT-RPA y Cas13 son estables a -20 °C durante al menos 8 meses [Figura 4].
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig06.jpg"> Figura 4: Ensayos de estabilidad de reactivos RPA y CRISPR-Cas13a liofilizados, premezclados a -20 °C. Prueba de estabilidad a los (A) 30 días, (B) 45 días, (C) 3 meses, (D) 5 meses, (E) 8 meses. Se muestran los datos individuales de las mediciones por triplicado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En la Figura 5 se muestra el LoD de las reacciones basadas en RT-RPA y Cas13 liofilizadas para la detección de los genes s y n del SARS-CoV-2. La cinética de la generación de señales se puede mejorar con la detección de genes duales en comparación con cuando solo se detecta un gen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig04.jpg"> Figura 5: Sensibilidad analítica de la detección de un solo gen frente a la detección de dos genes. (A) El LoD de RT-RPA singleplex liofilizado y la detección basada en Cas dirigida al gen s de SAR-CoV-2. (B) El LoD de RT-RPA singleplex liofilizado y detección basada en Cas dirigida al gen n de SAR-CoV-2. (C) El LoD de RT-RPA multiplexado liofilizado y la detección dual basada en Cas dirigida a los genes s y n . La LoD se determinó utilizando ARN del SARS-CoV-2 diluido en serie, cuyos valores de Ct se determinaron mediante un ensayo RT-qPCR dirigido al gen n . Se muestran los datos individuales de 3-6 mediciones repetidas. Abreviaturas: LoD = límite de detección; RT = transcripción inversa; RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas = proteína asociada a CRISPR; SAR-CoV-2 = Coronavirus 2 del Síndrome Respiratorio Agudo Severo; Ct = umbral de ciclo; qPCR = reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Más allá de la detección de virus, presentamos un prototipo de una herramienta de genotipado POC basada en el diagnóstico CRISPR, para ayudar a identificar especies de serpientes venenosas endémicas de Tailandia (Figura 6). La identificación más rápida y precisa de las especies de serpientes a través de muestras de ADN recogidas de heridas por mordeduras puede ayudar en la administración rápida de antídotos, mejorando las posibilidades de supervivencia del paciente. Nos enfocamos en regiones dentro del gen del citocromo b mitocondrial (cytb) de ocho especies de serpientes, incluida Ophiophagus hannah (cobra real) (Figura 6A), y demostramos que la detección de sustitutos de ADN sintético del gen O. hannah cytb puede alcanzar el nivel attomolar de sensibilidad (Figura 6B, C).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig05.jpg"> Figura 6: Un prototipo de detección basada en CRISPR para identificar especies de serpientes a partir del envenenamiento por mordeduras de serpiente. (A) Diseño de cebadores RPA y lwaCas13a crRNA para la detección del gen cytb de Ophiophagus hannah. El promotor T7 (voladizo T7) se colocó en el extremo de 5' del cebador RPA delantero. (B) Cinética de la generación de señales FAM durante 60 minutos y (C) fluorescencia FAM de punto final a partir de la detección mediada por LwaCas13a de entradas sintéticas de dsDNA correspondientes a los segmentos del gen cytb de O. hannah. Se utilizaron diferentes concentraciones de entrada (0, 10-9, 10-12, 10-15 y 10-18 M). Los datos son la media ± s.d. a partir de mediciones triplicadas. Abreviaturas: RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas = proteína asociada a CRISPR; FAM = carboxifluoresceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="5">Liofilización de reactivos de detección premezclados CRISPR-Cas13a</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Paso</td>
			<td>Tasa de rampa</td>
			<td>Temperatura del estante</td>
			<td rowspan="2">Tiempo (hh:mm)</td>
			<td>Vacío</td>
		</tr><tr><td>(°C/min)</td>
			<td>(°C)</td>
			<td>(mbar)</td>
		</tr><tr><td>Congelar 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>apagado</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Seco 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>apagado</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Seco 2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>01:00</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Seco 3</td>
			<td>3</td>
			<td>20</td>
			<td>∞</td>
			<td>0</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Configuración del liofilizador de los reactivos de detección RT-RPA y CRISPR-Cas13a premezclados. Abreviaturas: RT = transcripción inversa; RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas = proteína asociada a CRISPR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Parámetro</td>
			<td>Ajuste</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Temperatura</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Ciclo cinético</td>
			<td>Tiempo de duración</td>
			<td>02:00 (mm:ss)</td>
		</tr><tr><td>Tiempo de intervalo</td>
			<td>02:30 (mm:ss)</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Tembloroso</td>
			<td>Tiempo de duración</td>
			<td>1 seg</td>
		</tr><tr><td>Modo</td>
			<td>Lineal</td>
		</tr><tr><td>Amplitud</td>
			<td>1 milímetro</td>
		</tr><tr><td>Intensidad de fluorescencia</td>
			<td>Longitud de onda de excitación</td>
			<td>488 nm</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Longitud de onda de emisión</td>
			<td>520 nm</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Modo</td>
			<td>Arriba</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Posición Z</td>
			<td>24470</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Ganar</td>
			<td>71</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Tiempo de integración</td>
			<td>20 μs</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Número de destellos</td>
			<td>25</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Programa lector de microplacas de fluorescencia para la detección de ácidos nucleicos.

Diagnóstico basado en CRISPR en el punto de atención con reactivos premezclados y liofilizados

Molecular diagnostics by Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-based detection have high diagnostic accuracy and attributes ...

point-care-crispr-based-diagnostics-with-premixed-freeze-dried

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

ampliPHOX tecnología de detección colorimétrica se presenta como una alternativa económica a la detección por fluorescencia de microarrays. Sobre la base de fotopolimerización, ampliPHOX produce manchas de polímero sólido visible a simple vista en tan sólo unos minutos. Resultados son imágenes e interpretado de forma automática con un paquete de software simple pero poderosa.

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