Diagnóstico basado en CRISPR en el punto de atención con reactivos premezclados y liofilizados
August 16th, 2024
Aquí, presentamos la preparación paso a paso de la amplificación isotérmica premezclada basada en recombinasa liofilizada y reacciones basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), que se pueden utilizar para la detección de biomarcadores de ácidos nucleicos de patógenos de enfermedades infecciosas u otros marcadores genéticos de interés.
Desarrollamos pruebas en el punto de atención para detectar estos materiales de enfermedades infecciosas. Esta prueba utiliza la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos y la detección basada en CRISPR. Con una alta precisión osmótica similar a la PCR, pueden detectar pequeñas diferencias de secuencia, incluido el polimorfismo de un solo nucleótido, y pueden ser múltiples.
CRISPR, las reacciones osmóticas contienen múltiples componentes y pasos y son difíciles de realizar en el punto de atención. Al estar basados en CRISPR, los osmóticos son muy sensibles, por lo que existe el riesgo de contaminación por arrastre que puede dar lugar a resultados falsos. Afortunadamente, este problema se puede mitigar si simplificamos los procedimientos de las reacciones.
Ofrecemos un método fácil de usar para detectar nuestros patógenos de enfermedades y marcadores genéticos utilizando amplificación isotérmica de recombinasa y reactivos basados en CRISPR. Estos reactivos son fáciles de almacenar y usar. También ofrecemos consejos para solucionar problemas comunes al usar estos métodos y reactivos, lo que facilita su uso por parte de las personas.
El protocolo aquí utiliza reactivos CRISPR, que facilitan el transporte y el almacenamiento. Los reactivos liofilizados se pueden rehidratar fácilmente en los puntos de uso y conservan una alta eficiencia de amplificación y detección. Esperamos aplicar tecnologías de diagnóstico CRISPR para detectar enfermedades infecciosas endémicas y emergentes.
Si esta prueba se puede realizar de forma rutinaria y correcta en el punto de atención, eso podría informar sobre las opciones de tratamiento antiviral y antibiótico, lo que podría salvar vidas, reducir el uso excesivo de medicamentos y el desarrollo de resistencia.
Visión general
Este artículo presenta un método para desarrollar pruebas de atención primaria que utilizan amplificación isotérmica de ácidos nucleicos y detección basada en CRISPR para identificar material genético de enfermedades infecciosas. El enfoque busca mejorar la sensibilidad y precisión mientras aborda desafíos como los riesgos de contaminación.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Diagnóstico de enfermedades infecciosas
- Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos
- Tecnología CRISPR
Antecedentes
- Las pruebas de atención primaria son cruciales para el diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas.
- La amplificación isotérmica permite una detección eficiente de ácidos nucleicos.
- La tecnología CRISPR ofrece alta sensibilidad para la identificación de material genético.
- Los riesgos de contaminación pueden conducir a resultados falsos en ensayos sensibles.
Propósito del estudio
- Desarrollar un procedimiento simplificado para reacciones basadas en CRISPR.
- Mejorar la precisión de la detección de pequeñas variaciones genéticas.
- Mitigación de riesgos de contaminación en entornos de atención primaria.
Métodos utilizados
- Preparación de reactivos premezclados y liofilizados para amplificación isotérmica.
- Implementación de métodos de detección basados en CRISPR.
- Evaluación de la sensibilidad y especificidad en la detección de biomarcadores de ácidos nucleicos.
- Optimización de las condiciones de reacción para reducir los riesgos de contaminación.
Principales resultados
- El método desarrollado demostró alta sensibilidad para detectar marcadores genéticos.
- Los riesgos de contaminación se redujeron significativamente mediante la simplificación de los procedimientos.
- Los resultados fueron comparables a los métodos de PCR tradicionales.
- El enfoque es adecuado para aplicaciones de atención primaria.
Conclusiones
- Este estudio presenta un método viable para la detección rápida de patógenos de enfermedades infecciosas.
- Los ensayos basados en CRISPR pueden simplificarse eficazmente para uso práctico.
- El trabajo futuro puede centrarse en mejorar aún más la robustez de las pruebas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Premixed and freeze-dried CRISPR-based diagnostic reagents enable rapid, accurate detection of infectious disease genetic markers at the point of care, addressing operational bottlenecks in decentralized testing. This approach reduces manual handling complexity and contamination risk, supporting scalable deployment in resource-limited and field settings. The method enhances predictive confidence for early intervention and informs therapeutic decision-making in real time.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid interrogation of pathogen genetic markers for target validation in infectious disease research.
- Supports biological de-risking by providing high-sensitivity detection of single nucleotide polymorphisms.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing between closely related pathogen strains.
Screening & Assay Development
- Delivers ready-to-use, validated reagent systems for streamlined assay development workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization through premixed, lyophilized formats.
- Enables scalable screening of clinical or environmental samples with minimal instrumentation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling detection of disease-relevant nucleic acid signatures.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing robust, field-deployable diagnostics.
- Reduces risk in advancing diagnostic candidates by demonstrating stability and efficiency of reagents.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through translational research, supporting workflows from target identification to preclinical validation of diagnostic platforms.
- Discovery Biology: Provides high-confidence detection of genetic targets for hypothesis testing and mechanistic studies.
- Screening: Offers standardized, quantitative outputs for comparing sample conditions and assay performance.
- Analytics: Enables sensitive fluorescence-based readouts for robust data analysis and decision support.
- Translational Research: Bridges laboratory and field applications, supporting biomarker-driven diagnostic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable reagent platform adaptable to diverse pathogen targets and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in pathogen detection.
- Operational Value: Simplifies workflows, enhances reproducibility, and supports cold-chain independent logistics.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for diagnostic candidates and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of diagnostic assets for emerging and endemic diseases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid amplification and CRISPR-based assay design.
- Needs access to lyophilization equipment and fluorescence microplate readers for full workflow execution.
- Demands cross-team standardization of reagent preparation and handling protocols.
- Adaptable to various sample types but may require optimization for specific pathogens.
- Stability and efficiency validated for at least eight months at -20°C, supporting extended deployment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:19
Preparation of Lyophilized Reverse Transcriptase‐Recombinase Polymerase Amplification (RT‐RPA) Reactions
5:02
Preparation of Lyophilized CRISPR‐Cas13a Premixed Detection Reagents for Nucleic Acid Biomarkers Detection
7:45
RT‐RPA Nucleic Acid Amplification and CRISPR‐Cas13 Nucleic Acid Detection
