Diagnóstico basado en CRISPR en el punto de atención con reactivos premezclados y liofilizados
16 de agosto de 2024
Aquí, presentamos la preparación paso a paso de la amplificación isotérmica premezclada basada en recombinasa liofilizada y reacciones basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), que se pueden utilizar para la detección de biomarcadores de ácidos nucleicos de patógenos de enfermedades infecciosas u otros marcadores genéticos de interés.
Desarrollamos pruebas en el punto de atención para detectar estos materiales de enfermedades infecciosas. Esta prueba utiliza la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos y la detección basada en CRISPR. Con una alta precisión osmótica similar a la PCR, pueden detectar pequeñas diferencias de secuencia, incluido el polimorfismo de un solo nucleótido, y pueden ser múltiples.
CRISPR, las reacciones osmóticas contienen múltiples componentes y pasos y son difíciles de realizar en el punto de atención. Al estar basados en CRISPR, los osmóticos son muy sensibles, por lo que existe el riesgo de contaminación por arrastre que puede dar lugar a resultados falsos. Afortunadamente, este problema se puede mitigar si simplificamos los procedimientos de las reacciones.
Ofrecemos un método fácil de usar para detectar nuestros patógenos de enfermedades y marcadores genéticos utilizando amplificación isotérmica de recombinasa y reactivos basados en CRISPR. Estos reactivos son fáciles de almacenar y usar. También ofrecemos consejos para solucionar problemas comunes al usar estos métodos y reactivos, lo que facilita su uso por parte de las personas.
El protocolo aquí utiliza reactivos CRISPR, que facilitan el transporte y el almacenamiento. Los reactivos liofilizados se pueden rehidratar fácilmente en los puntos de uso y conservan una alta eficiencia de amplificación y detección. Esperamos aplicar tecnologías de diagnóstico CRISPR para detectar enfermedades infecciosas endémicas y emergentes.
Si esta prueba se puede realizar de forma rutinaria y correcta en el punto de atención, eso podría informar sobre las opciones de tratamiento antiviral y antibiótico, lo que podría salvar vidas, reducir el uso excesivo de medicamentos y el desarrollo de resistencia.
Descripción general
Este artículo presenta un método para desarrollar pruebas de diagnóstico inmediato que utilicen la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos y la detección basada en CRISPR para identificar material genético de enfermedades infecciosas. El enfoque busca mejorar la sensibilidad y precisión, abordando al mismo tiempo desafíos como los riesgos de contaminación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Diagnóstico de enfermedades infecciosas
- Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos
- Tecnología CRISPR
Antecedentes
- Las pruebas de diagnóstico en el lugar de atención son cruciales para el diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas.
- La amplificación isotérmica permite la detección eficiente de ácidos nucleicos.
- La tecnología CRISPR ofrece alta sensibilidad para la identificación de material genético.
- Los riesgos de contaminación pueden provocar resultados falsos en ensayos sensibles.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un procedimiento simplificado para reacciones basadas en CRISPR.
- Mejorar la precisión en la detección de pequeñas variaciones genéticas.
- Reducir los riesgos de contaminación en entornos de atención primaria.
Métodos Utilizados
- Preparación de reactivos liofilizados y premezclados para amplificación isotérmica.
- Implementación de métodos de detección basados en CRISPR.
- Evaluación de la sensibilidad y especificidad en la detección de biomarcadores de ácidos nucleicos.
- Optimización de las condiciones de reacción para reducir los riesgos de contaminación.
Resultados principales
- El método desarrollado demostró una alta sensibilidad para la detección de marcadores genéticos.
- Los riesgos de contaminación se redujeron significativamente mediante la simplificación del procedimiento.
- Los resultados fueron comparables con los métodos tradicionales de PCR.
- El enfoque es adecuado para aplicaciones en el punto de atención.
Conclusiones
- Este estudio presenta un método viable para la detección rápida de patógenos de enfermedades infecciosas.
- Los ensayos basados en CRISPR pueden simplificarse eficazmente para su uso práctico.
- Trabajos futuros podrían centrarse en mejorar aún más la robustez de las pruebas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los reactivos diagnósticos basados en CRISPR premezclados y liofilizados permiten la detección rápida y precisa de marcadores genéticos de enfermedades infecciosas en el lugar de atención, abordando cuellos de botella operativos en las pruebas descentralizadas. Este enfoque reduce la complejidad del manejo manual y el riesgo de contaminación, facilitando una implementación escalable en entornos con recursos limitados y en campo. El método mejora la confianza predictiva para la intervención temprana e informa en tiempo real la toma de decisiones terapéuticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación rápida de marcadores genéticos de patógenos para la validación de objetivos en la investigación de enfermedades infecciosas.
- Apoya la desactivación de riesgos biológicos mediante la detección de alta sensibilidad de polimorfismos de un solo nucleótido.
- Facilita la selección de carteras al distinguir entre cepas de patógenos estrechamente relacionadas.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Proporciona sistemas de reactivos validados y listos para usar para flujos de trabajo optimizados en el desarrollo de ensayos.
- Mejora la reproducibilidad y la estandarización de los ensayos mediante formatos liofilizados y premezclados.
- Permite la realización de cribados a escala de muestras clínicas o ambientales con mínima instrumentación.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con estrategias traslacionales de biomarcadores al permitir la detección de firmas de ácidos nucleicos relevantes para la enfermedad.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al proporcionar diagnósticos robustos y desplegables en campo.
- Reduce el riesgo en el avance de candidatos diagnósticos al demostrar la estabilidad y eficiencia de los reactivos.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
Este método integra desde el descubrimiento inicial hasta la investigación traslacional, apoyando flujos de trabajo desde la identificación del blanco hasta la validación preclínica de plataformas diagnósticas.
- Biología del Descubrimiento: Proporciona detección de alta confianza de dianas genéticas para pruebas de hipótesis y estudios mecanicistas.
- Selección: Ofrece salidas cuantitativas estandarizadas para comparar condiciones de muestras y el rendimiento de ensayos.
- Análisis: Permite lecturas sensibles basadas en fluorescencia para un análisis de datos robusto y apoyo en la toma de decisiones.
- Investigación Traducional: Conecta aplicaciones de laboratorio y de campo, apoyando el desarrollo de diagnósticos basados en biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de reactivos reutilizables adaptable a diversas dianas patógenas y tipos de muestras.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad en la detección de patógenos.
- Valor operativo: Simplifica los flujos de trabajo, mejora la reproducibilidad y apoya la logística independiente de la cadena de frío.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de avance o descarte de candidatos diagnósticos y reduce el riesgo en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de los activos diagnósticos para enfermedades emergentes y endémicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en amplificación de ácidos nucleicos y diseño de ensayos basados en CRISPR.
- Necesita acceso a equipos de liofilización y lectores de microplacas con fluorescencia para la ejecución completa del flujo de trabajo.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación y manejo de reactivos.
- Adaptable a diversos tipos de muestras, aunque puede requerir optimización para patógenos específicos.
- Estabilidad y eficiencia validadas durante al menos ocho meses a -20°C, lo que permite un despliegue prolongado.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
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Introduction
2:19
Preparation of Lyophilized Reverse Transcriptase‐Recombinase Polymerase Amplification (RT‐RPA) Reactions
5:02
Preparation of Lyophilized CRISPR‐Cas13a Premixed Detection Reagents for Nucleic Acid Biomarkers Detection
7:45
RT‐RPA Nucleic Acid Amplification and CRISPR‐Cas13 Nucleic Acid Detection
