Name: Cultivo a largo plazo de cortes organotípicos de médula espinal de ratón como plataforma para validar el trasplante de células en lesiones de la médula espinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprende a cultivar cortes organotípicos de médula espinal de ratón a largo plazo para validar trasplantes de células madre neuronales. Este método ex vivo mejora la supervivencia, integración y maduración celular en investigación de lesiones medulares.

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El estudio contó con el apoyo de la Fundación Wings for Life (WFL-IT-20/21), el Plan Nacional de Recuperación y Resiliencia (NRRP) de la Unión Europea de Próxima Generación de la UE-misión 4 componente 2, inversión n. 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8), y el Marina Romoli Onlus. Este manuscrito refleja únicamente los puntos de vista y opiniones de los autores, ni la Unión Europea ni la Comisión Europea pueden ser consideradas responsables de los mismos. Los datos y metadatos están disponibles en Zenodo 10.5281/zenodo.10433147. Las imágenes se generaron con Biorender https://www.biorender.com/.

Injerto a largo plazo de células h-SC-NES en cultivos organotípicos de la médula espinal

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Todavía no existe un tratamiento eficaz para los pacientes con LME, se han ensayado diferentes enfoques y uno de los más prometedores se basa en una estrategia regenerativa: el reemplazo celular. Actualmente, los avances en el campo de la medicina regenerativa exigen nuevas plataformas para probar la eficacia y seguridad de los trasplantes de células, solos o en combinación con otros enfoques. Su validación preclínica es esencial para llevar a cabo estudios clínicos posteriores. Los cultivos organotípicos SC son una plataforma útil para estudiar diferentes aspectos de la neurodegeneración, la regeneración neuronal y el neurodesarrollo, y para investigar la eficacia de nuevos enfoques terapéuticos23. En particular, las características específicas de los cultivos organotípicos, como el mantenimiento de la arquitectura histológica original y la composición celular y del microambiente, son ventajosas para desentrañar la dinámica del trasplante, como el injerto celular, la integración, la diferenciación y la maduración.
De acuerdo con los protocolos publicados, los cortes organotípicos SC se pueden mantener en cultivo durante aproximadamente 2-3 semanas en condiciones saludables, lo que limita su uso para las investigaciones a largo plazo y el cribado funcional requerido para los esquemas de prueba de terapia celular. Explorar procesos importantes como la diferenciación y la maduración hacia el destino correcto de las células trasplantadas dentro del tejido SC requiere un seguimiento a largo plazo. Estos procesos celulares son críticos durante los trasplantes comunes en modelos animales. La disponibilidad de un sistema ex vivo que imite muchas de las características presentes in vivo sería útil en la fase de cribado preclínico.
Por esta razón, en este trabajo proponemos un método óptimo de cultivo organotípico de SC a largo plazo (≥30 días) que permite mantener cortes de SC viables hasta por 90 días, triplicando su marco de tiempo de cultivo habitual. Además, mostramos un injerto estable de células h-SC-NES dentro de cortes de SC y el mantenimiento del cultivo de trasplante hasta por 30 días. Monitorizamos el injerto celular a lo largo del tiempo mediante la observación de la expresión de GFP para verificar la supervivencia celular hasta DPT 30. Después de 30 DPT, se evaluó la tasa de apoptosis celular. En la literatura, se ha descrito la evaluación de la apoptosis de células h-SC-NES trasplantadas en cortes de SC a 7 DPT40. Aquí, ampliamos el análisis de apoptosis celular en DPT 30 para comparar la tasa apoptótica con respecto al punto de tiempo anterior (DPT 7). Descubrimos que nuestros datos están en línea con la literatura, lo que sugiere que las células h-SC-NES trasplantadas sobreviven también en un momento posterior si se mantienen en la condición de cultivo optimizada en nuestro trabajo. Esta plataforma ex vivo mejorada a largo plazo, por sí sola y en la configuración de trasplante, ayudará a los investigadores en el cribado preclínico de trasplantes basados en células madre para la LME. Esto les permitirá identificar la mejor célula candidata para futuros estudios in vivo que promuevan el éxito de los trasplantes. Además, después del cribado inicial, los cortes organotípicos de SC también podrían utilizarse en paralelo a los estudios in vivo para confirmar y corroborar la dinámica y los comportamientos celulares a largo plazo observados en modelos animales o para apoyar estudios mecanicistas.
Nuestro protocolo describe en detalle cómo generar este modelo organotípico a largo plazo, pero también se deben discutir algunos pasos críticos. En cuanto a la generación de los cultivos organotípicos SC, existen algunos desafíos durante la cirugía y las primeras etapas del cultivo. Un procedimiento quirúrgico bien realizado es esencial para generar cortes que mantengan la histoarquitectura original. Si el SC se arruina durante el aislamiento, los cortes pueden perder su estructura anatómica típica y el daño tisular puede inducir un daño proinflamatorio excesivo que conduce a condiciones insalubres y a la muerte celular. La fase más desafiante durante la cirugía es la extracción del SC de la columna vertebral y la extirpación de las meninges del SC aislado. El éxito de estos pasos depende de la experiencia del operador; Por lo tanto, se recomienda un período de entrenamiento antes de comenzar con los experimentos.
El corte coronal del SC a través de un picador también es una fase desafiante. El SC aislado debe colocarse en la plataforma de corte exactamente perpendicular a la cuchilla. El operador también debe colocar la cuchilla perpendicularmente a la plataforma de corte. Estas precauciones son necesarias para garantizar la generación de cortes reproducibles entre el mismo experimento y experimentos diferentes. Otra cuestión importante es que el tiempo para la cirugía es limitado: todo el procedimiento de generación de cortes debe durar ~30 minutos. Si el operador dedica más tiempo a la cirugía y al corte, el tejido SC se verá afectado y esto puede perjudicar el éxito del cultivo y los siguientes pasos del experimento.
Una vez que las rodajas se colocan en la membrana de cultivo, es importante alimentarlas correctamente. El GDNF es necesario para mantener la recuperación y la supervivencia de los tejidos. El corte con una picadora es traumático para el tejido y, por esta razón, las rodajas se colocan poco después del corte en un medio de disección helado para limpiar el exceso de moléculas proinflamatorias y promotoras de la muerte. A continuación, se colocan cortes en las membranas de cultivo (insertos de cultivo celular) con medio fresco modificado con GDNF para promover una recuperación más rápida y la adhesión del corte a la membrana. El GDNF debe añadirse al medio todos los días durante la primera semana de cultivo debido a su corta vida media50,51. Observamos que los cortes necesitan la presencia continua de GDNF durante los primeros días de cultivo para promover la recuperación y viabilidad del tejido. En cualquier caso, dado que la presencia de GDNF es importante durante todo el período de cultivo, se desaconseja encarecidamente interrumpir la administración de GDNF en otros momentos.
Durante la primera semana en cultivo, también es importante revisar macroscópicamente las rodajas a ojo y al microscopio. El tejido translúcido y la transparencia de los bordes son signos de una correcta adhesión de las rodajas a la membrana y de tejido viable. El tejido necrótico aparecerá extremadamente blanco a primera vista macroscópica y las áreas necróticas aparecerán gris oscuro en el microscopio. Después de algunas semanas en cultivo, la morfología del tejido puede cambiar: los movimientos celulares y la adhesión del tejido a la membrana pueden influir en este proceso. Observamos, por ejemplo, la pérdida de la luz central en algunos cortes llenos de células y la pérdida de la morfología del asta dorsal y ventral. Esto sucede principalmente con rebanadas más pequeñas, mientras que la mayoría de ellas mantendrán una estructura anatómica cercana a la original. Los cortes suelen generarse a partir de las regiones lumbar o torácica porque de esta manera pueden tener el tamaño adecuado para mantener su histoarquitectura original a lo largo del tiempo: si son demasiado pequeños, pierden su arquitectura mientras que, si son demasiado grandes, la región central puede sufrir una necrosis. Así, utilizamos la región lumbar de las crías de ratón para generar rodajas con el tamaño adecuado para un cultivo óptimo a largo plazo pero, en principio, se pueden considerar otros segmentos. Además, optamos por utilizar la región lumbar, porque las regiones ventral y dorsal son más distinguibles entre sí. Además, esta región presenta áreas de tejido con un mayor porcentaje de neuronas motoras y sustancia gris, que son sitios de interés para las terapias de reemplazo celular en la LM. En cuanto al trasplante de células en los cortes, el problema principal está relacionado con la rotura de la punta de la microaguja de vidrio. Si el orificio para el paso de las células es demasiado grande, puede causar daño al tejido SC durante la microinyección. Si es demasiado pequeño, el apilamiento de células puede obstruir la aguja, dificultando el proceso de trasplante. El procedimiento de trasplante debe completarse dentro de 1 hora para minimizar el sufrimiento y la muerte celular.
El protocolo propuesto proporciona una herramienta óptima y versátil para diferentes tipos de investigaciones. Aquí, aplicamos nuestra plataforma a largo plazo para validar el trasplante de células h-SC-NES en las primeras etapas de diferenciación dentro del tejido SC de ratón durante 30 días. La principal novedad del enfoque propuesto es la optimización del protocolo de co-cultivo. Los componentes de la GM mantienen la supervivencia neuronal a largo plazo de las células SC y de las células h-SC-NES trasplantadas. En efecto, la transgénico, al ser un medio libre de suero, sostiene la diferenciación de las células trasplantadas hacia el destino neuronal con respecto al medio utilizado previamente para el cultivo de cortes organotípicos47.
En cuanto a los modelos propuestos para la LME, los experimentos se suelen realizar en ratones adultos. Hasta el momento, las diferencias más importantes entre el SC neonatal y el adulto están relacionadas con el mayor potencial regenerativo encontrado en el neonatal con respecto a los ratones adultos52. Sin embargo, tales diferencias no tienen ningún impacto en el tipo de protocolo que estamos proponiendo, ya que aquí nos centramos en la respuesta de las células injertadas al entorno del tejido huésped más que en las capacidades de regeneración de las neuronas residentes. Otra diferencia entre ratones neonatos y adultos después de una lesión de la médula espinal está relacionada con la formación de la cicatriz glial que se produce en los adultos. Este aspecto no se tiene en cuenta en el modelo propuesto, que no considera los complejos procesos fisiopatológicos derivados de lesiones primarias y secundarias.
En cuanto a las aplicaciones, la plataforma también podría utilizarse para investigar la integración entre las células trasplantadas con circuitos residentes presentes en el modelo organotípico SC. Las herramientas de ingeniería genética ya se utilizaban en el SNC para evaluar la conectividad sináptica y podrían ser explotadas en este sentido 53,54,55. En particular, la integración podría investigarse y validarse evaluando la formación de sinapsis entre las células injertadas y el tejido SC ex vivo. Estos cultivos organotípicos a largo plazo también podrían aprovecharse para probar agentes neuroprotectores y neuroregenerativos o nuevas moléculas/materiales o para estudiar trastornos neurodegenerativos que involucren al SC. Para estudiar trastornos neurodegenerativos específicos, es necesario adaptar el protocolo para cultivar cortes de SC generados a partir de modelos relevantes, como ratones transgénicos portadores de mutaciones asociadas a patologías específicas, en la etapa relevante para la patología (es decir, neonatal, juvenil, adulto). En conclusión, nuestro protocolo y los cultivos organotípicos en general, al ser explantes de un órgano específico, presentan características que cierran la brecha entre los cultivos celulares 2D y los modelos in vivo, confirmándolos como una herramienta invaluable tanto para la investigación básica como para las pruebas preclínicas.

La lesión traumática de la médula espinal (LME) tiene consecuencias físicas, psicológicas y económicas devastadoras para los pacientesy los cuidadores. Se han realizado muchos intentos para promover la regeneración axonal en la LM con diferentes enfoques 2,3,4 y se demostraron algunos efectos beneficiosos mediante la formación de relés neuronales entre las neuronas proximales y distales en el sitio de la lesión mediante terapias de reemplazo celular. El interés por las terapias celulares sigue creciendo5 ya que las células trasplantadas pueden desempeñar muchas funciones, como el apoyo trófico, la modulación inmunitaria, la regeneración de circuitos neuronales perdidos mediante la inducción de la plasticidad, el reemplazo celular y la remielinización de axones6.
Recientemente, el principal esfuerzo en este campo se centró en las células madre/progenitoras neurales humanas (NSCs/NPCs)7. Varios estudios sugieren que las NSCs/NPCs modulan la respuesta de los astrocitos8, promueven la secreción de factores proregenerativos 9,10 y reemplazan las células neuronales faltantes en la LME11,12. Sin embargo, los estudios que apoyan la diferenciación de las células trasplantadas en neuronas funcionales son todavía escasos. Además, la supervivencia y diferenciación de las células trasplantadas en la médula espinal (CS) lesionada es baja13, posiblemente porque las células trasplantadas tardan varias semanas, incluso meses, en diferenciarse in vivo. Además, los estudios actuales no han dilucidado completamente muchos aspectos bioquímicos, moleculares, celulares y funcionales de las terapias de reemplazo celular. En este contexto, se requieren modelos simples, rápidos y rentables para estudiar los mecanismos del injerto celular, la capacidad de las células injertadas para proliferar, diferenciarse en tipos específicos o subpoblaciones de células y formar sinapsis con las neuronas residentes.
La integración de los estudios histológicos en el registro electrofisiológico y el perfil del transcriptoma y el proteoma es necesaria para una comprensión completa de la cascada molecular que ocurre después del trasplante de células. Sin duda, esto acelerará el diseño y la validación de nuevas terapias de reemplazo celular en modelos preclínicos y estudios clínicos. De hecho, hasta la fecha, el uso de roedores, animales grandes y primates no humanos ha sido valioso para dilucidar muchos procesos celulares después del trasplante14. Sin embargo, debido al alto costo, el alto impacto ético, así como la complejidad del organismo, su uso a menudo no es sencillo o no es adecuado para desentrañar los procesos bioquímicos y moleculares. Además, pueden presentar muchas desventajas correlacionadas con las diferencias biológicas, tanto entre especies (metabolismo) como dentro de las especies (sexo, edad).  Estos factores, junto con factores externos como situaciones estresantes, podrían alterar el resultado de un experimento y su predictibilidad en términos de traslación terapéutica a humanos 15,16,17.
Por lo tanto, muchos grupos emplean cultivos celulares in vitro 2D y cortes organotípicos ex vivo (cultivos ex vivo) además de modelos animales. El cultivo celular 2D es el sistema más utilizado para estudiar procesos biológicos específicos a nivel de célula única y/o población celular. Sin embargo, los cultivos celulares monocapa no reflejan la complejidad que se encuentra en un organismo completo. La falta de estructuras tisulares y del ambiente fisiológico no permite que los sistemas de cultivo 2D emulen completamente los aspectos estructurales, morfológicos y funcionales clave del tejido investigado 18,19,20.Los cultivos organotípicos pueden superar algunos de estos problemas. Los modelos organotípicos se basan en la explantación de un fragmento de un tejido u órgano y su mantenimiento ex vivo durante un período limitado21,22. En particular, se generan rodajas del tejido explantado con un grosor preciso que permite que los nutrientes lleguen fácilmente a casi todas las células de las rodajas. Pueden generarse a partir de varias regiones del sistema nervioso central, como el hipocampo, el hipotálamo, el cerebelo, el tálamo, la corteza cerebral, la sustancia negra y el cuerpo estriado, y la médula espinal23. Los cultivos organotípicos conservan la arquitectura de los tejidos, la distribución espacial de las células, la diversidad celular y el entorno (es decir, la composición de la matriz extracelular) del órgano de origen. Además, conservan la actividad neuronal original, las conexiones entre células y, en particular, los circuitos de corta distancia después del explante.
Estos aspectos proporcionan algunas ventajas para los cultivos ex vivo con respecto tanto a los cultivos monocapa como a los modelos animales. Conservan las características tisulares clave que se encuentran in vivo, pero con la reducción de los costos y la posibilidad de realizar diferentes tipos de experimentos moleculares, celulares y funcionales con una regulación precisa de los parámetros ambientales del cultivo 24,25,26,27,28,29. Los cortes organotípicos también pueden aprovecharse para desarrollar modelos para diferentes trastornos neurológicos, asemejándose a las características histopatológicas clave de condiciones específicas30. Además, la retención del entorno original del tejido multicelular los convierte en plataformas adecuadas para el cribado de fármacos y para el ensayo de moléculas y materiales neuroprotectores y neuro-regenerativos.
En este trabajo, proponemos el uso de cultivos organotípicos de SC como modelo para optimizar los trasplantes de NSC. Esto no es baladí, ya que se requieren unas condiciones óptimas de cultivo para garantizar la supervivencia tanto del huésped (tejido SC) como del trasplante (NSCs) durante semanas. Diferentes grupos de investigación injertaron en cultivos organotípicos, derivados del cerebro y derivados del SC, varios tipos de células. La mayoría de los trabajos mostraron el trasplante de células madre mesenquimales 31,32,33, células de envoltura olfativa 34 o NSCs 35,36,37,38,39,40 y evaluaron las interacciones de las células injertadas con las células huésped, la supervivencia de todo el sistema y si las células trasplantadas se diferenciaban en neuronas o células similares a las neuronas dentro del entorno tisular ex vivo 32,33,41. Algunos de ellos evaluaron el potencial regenerativo de las células después del trasplante, observando su crecimiento axonal dentro del tejido 37,40,41, la capacidad mielinizante de los precursores injertados de oligodendrocitos 42, la migración de las células injertadas al tejido huésped43, y si las células trasplantadas liberaban factores que empujaban hacia un ambiente proregenerativo31. Una limitación de los estudios actuales es que no exploran el injerto a largo plazo.
Teniendo en cuenta que las NSC parecen requerir varias semanas para diferenciarse in vivo44,45, este estudio se centra en cómo generar y mantener a largo plazo (≥30 días) cortes de SC de ratón durante un máximo de 90 días. Se encontró que los cortes conservan su estructura anatómica original y mantienen una tasa de apoptótica baja y estable a lo largo del tiempo y una alta viabilidad celular. Observamos la expresión difusa de los marcadores neuronales RNA binding fox-1 homólogo 3 (RBFOX3) y la cadena ligera de neurofilamentos (NFL), mostrando este último una tendencia creciente de brote axonal alrededor de las rodajas a lo largo del tiempo, lo que atestigua su estado saludable. Además, trasplantamos con éxito a las células madre neuroepiteliales humanas derivadas de SC (H-SC-NES) que expresan GFP en las primeras etapas de la diferenciación neuronal. El injerto NSC se mantuvo durante 30 días después del trasplante y las células mostraron expresión de GFP durante todo el período en cultivo. También se encontró que la tasa apoptótica de células al día post-trasplante (DPT) 30 estaba en línea con el valor de la tasa apoptótica observada en DPT 7 en las mismas células40. Las células parecían injertarse en el entorno del tejido y sobrevivían hasta varias semanas.
En resumen, nuestros datos demuestran que es posible mantener en cultivo cortes organotípicos SC durante 3 meses sin comprometer su citoarquitectura original y el entorno tisular. Y lo que es más importante, pueden aprovecharse para probar terapias celulares antes de proceder a un experimento in vivo , reduciendo así los costes y el tiempo experimental. Aquí, ilustramos en detalle todos los pasos para generar cortes organotípicos SC de ratón y cómo mantenerlos a largo plazo (≥30 días). Además, explicamos en profundidad cómo realizar el trasplante de NPC en las rodajas y cómo mantenerlas para el análisis posterior.

<table><tbody><tr><td>Caspasa-3 anti-escindido,&nbsp; (ASP175) (5A1E) (Conejo)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>9661S</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-GFP (Ratón) - monoclonal</td><td>Sigma/Merck</td><td>G6539</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-Núcleos humanos (Ratón) - monoclonal, clon 235-1&nbsp;</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1281</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-Núcleos Humanos (Conejo)</td><td>NeoBiotechnologies</td><td>RBM5-346-P1</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NeuN (RBFOX3) (Conejo) - policlonal</td><td>Sigma/Merck</td><td>ABN78</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL (Ratón)</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1615</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anti-NFL H-Phospho (Conejo) -policlonal</td><td>Biologend</td><td>840801</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Aqua</td><td>Polymount Poly-sciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Gibco</td><td>PHC7074</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas Leica</td><td></td><td>118364227</td><td></td></tr><tr><td>Agua graduada para cultivo celular</td><td>Sigma/Merck</td><td>W3500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de cola de rata</td><td>Sigma/Merck</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal - Microscopio confocal A1 (Eclipse Ti)</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa</td><td>Sigma/Merck</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de disección</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma/Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma/Merck</td><td>gf144</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Vástago</td><td>03-0002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Sigma/Merck</td><td>SRP3200</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio, 3.5"&nbsp;</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Cabra-anti Ratón IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Cabra-anti Ratón IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21236</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra-anti Conejo IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Cabra-anti conejo IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21244</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Graph Pad-Prisma</td><td>Dotmatics Software para</td><td></td><td>análisis estadístico</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Caballo Suero</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma/Merck</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma/Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Preparación lentiviral</td><td>Addgene</td><td>17446-LV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO kit de ensayo de viabilidad/citotoxicidad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L32250</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de microcargador</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>para cargar células en la aguja para trasplante</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR</td><td>631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de cultivo celular Millicell</td><td>Sigma/Merck</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio</td><td>VWR&nbsp;</td><td>ECN 631-1572</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (35 mm)</td><td>VWR</td><td>734-2317</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma/Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta pasteur de plástico</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Bomba neumática PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>Microinyector para trasplante</td></tr><tr><td>Poly-L-lisina</td><td>Sigma/Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí n.º 10 Acero inoxidable estéril</td><td>VWR International</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Muelle Tijeras</td><td>World Precision Instruments</td><td>501235</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico para imágenes y adquisición</td><td>Nikon&nbsp;</td>Microscopio estereoscópico <td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>para cirugía</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas-Dumont #5-inox</td><td></td><td>Tijeras Vannas</td> 501985 <td></td>World</tr><tr>Precision Instruments<td>, 8,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas vertical</td><td>Instrumento de obturador</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 R</td><td>& Sistemas D</td><td>1254/50</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo a largo plazo de cortes organotípicos de médula espinal de ratón como plataforma para validar el trasplante de células en lesiones de la médula espinal

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

Todavía faltan curas resolutivas para las lesiones de la médula espinal (LME), debido a la compleja fisiopatología. Uno de los enfoques regenerativos más prometedores se basa en el trasplante de células madre para reemplazar el tejido perdido y promover la recuperación funcional. Este enfoque debería explorarse más a fondo in vitro y ex vivo para determinar su seguridad y eficacia antes de proceder a los ensayos con animales, que son más caros y requieren mucho tiempo. En este trabajo, mostramos el establecimiento de una plataforma a largo plazo basada en cortes organotípicos de médula espinal (SC) de ratón trasplantados con células madre neurales humanas para probar terapias de reemplazo celular para las LME.
Los cultivos organotípicos SC estándar se mantienen durante unas 2 o 3 semanas in vitro. Aquí, describimos un protocolo optimizado para el mantenimiento a largo plazo (≥30 días) durante un máximo de 90 días. El medio utilizado para el cultivo a largo plazo de cortes de SC también se optimizó para el trasplante de células madre neurales al modelo organotípico. Las células madre neuroepiteliales humanas derivadas de SC (h-SC-NES) que portaban un indicador de proteína fluorescente verde (GFP) se trasplantaron a cortes de SC de ratón. Treinta días después del trasplante, las células aún muestran expresión de GFP y una tasa apoptótica baja, lo que sugiere que el ambiente optimizado mantuvo su supervivencia e integración dentro del tejido. Este protocolo representa una referencia sólida para probar de manera eficiente las terapias de reemplazo celular en el tejido SC. Esta plataforma permitirá a los investigadores realizar un precribado ex vivo de diferentes terapias de trasplante de células, lo que les ayudará a elegir la estrategia más adecuada antes de proceder a los experimentos in vivo .

Los métodos descritos permiten el establecimiento de cortes organotípicos SC de ratones en estadio P3 y su mantenimiento en cultivo durante un tiempo prolongado en condiciones saludables. Además, mostramos un protocolo para el trasplante de células en las rodajas y para co-cultivarlas durante un máximo de 30 días (Figura 1). En primer lugar, mostramos la optimización de las condiciones de cultivo y un protocolo adecuado para el cultivo prolongado de las lonchas de SC con células trasplantadas (Figura 2A). Los cortes se generan y mantienen desde el DEV 0 hasta el DEV 2 en el OM, que originalmente se propuso como un medio óptimo para el mantenimiento de los segmentos SC47. Sin embargo, debido a la presencia de proteínas séricas, este medio podría ser subóptimo para mantener la diferenciación y maduración neuronal de las células precursoras neurales trasplantadas. De hecho, en DEV 3, probamos el cambio de OM a GM, una formulación que contiene Neurobasal plus B27, que apoya la supervivencia neuronal, y sin suero, que inhibe la correcta diferenciación neuronal, promoviendo en cambio un destino glial48,49.
La Figura 2B muestra los resultados obtenidos al cambiar el medio en DEV 3 de OM a GM, en comparación con los cortes de SC que no recibieron el interruptor (los cortes de control se cultivaron en OM). Utilizamos la distribución de la señal de la NFL dentro de los cortes como marcador de la integridad neuronal (Figura 2B,C). Los cortes en DEV 7 fueron saludables en ambas condiciones de cultivo, mostrando la distribución difusa de neurofilamento (NFL, en verde) dentro de ellos. En el DEV 10, los cortes cultivados en GM parecieron ser más saludables con respecto a los cortes de control cultivados en MO, como se documentó en la distribución de tinción de la NFL. También estimamos el área NFL+ (% NFL+ Area/DAPI+ Area) de los cortes que se muestran en las imágenes representativas de la Figura 2B. El área estimada de NFL+ está representada en los histogramas de la Figura 2C, lo que confirma que la señal de la NFL se distribuye de forma difusa en los segmentos de DEV 7 en ambas condiciones. Sin embargo, en el DEV 10, el área estimada cubierta por la tinción de la NFL disminuye para la condición de cultivo de OM.
Estos datos sugieren que el cambio a la GM en DEV 3 es bien tolerado para el cultivo prolongado de cortes de SC (DEV 10). Como siguiente paso, probamos GM en puntos de tiempo más prolongados: DEV 30, DEV 60 y DEV 90. Como se muestra en la Figura 3A,B, las rodajas se mantuvieron sanas en cultivo hasta DEV 90. La tinción de NFL se encontró ampliamente presente en los cortes en cada punto de tiempo, con brotes difusos alrededor de los cortes de neuritas que partían de la región central. De hecho, estimamos el área NFL+ de los cortes que se muestran en la Figura 3A y aumentó con el tiempo, como se muestra en los histogramas de la Figura 3B. También observamos positividad para el marcador neuronal RBFOX3, proporcionando otra línea de evidencia de la diferenciación neuronal de los cortes. En cada punto de tiempo, también verificamos la tasa de apoptosis evaluando en diferentes cortes el número de células positivas a aCASP3 (Figura 4A,B). El análisis se realizó como se describe en la sección 10.2 del protocolo. Se encontró que la tasa de apoptótica (% de células aCASP3+/número total de células DAPI+) era muy baja en cada punto de tiempo (0,85 ± 0,52%, 0,71 ± 0,27%, 0,66 ± 0,45% para DEV 30, 60 y 90, respectivamente) sin diferencias significativas entre los tres puntos de tiempo considerados (valor p &gt; 0,05, Figura 4B). Estos datos sugieren que la tasa de apoptótica asociada a aCASP3 se mantiene estable en el tiempo y, junto con la amplia distribución de NFL en los cortes (Figura 4A), confirman la supervivencia de los cortes en cada punto de tiempo.
En apoyo de los datos anteriores, también realizamos un ensayo vivo/muerto para evaluar la viabilidad de los cortes en los tres puntos de tiempo diferentes. Utilizamos calceína (tinción verde) para marcar las células viables y metabólicamente activas y Sytox (tinción cian) para evaluar la muerte celular. Como se muestra en los histogramas de la Figura 4C, el porcentaje de células metabólicamente activas aumenta ligeramente de DEV 30 a DEV 90 (93,17 ± 5,21%, 96,43 ± 3,02%, 96,33 ± 3,10% para DEV 30, 60 y 90, respectivamente), estabilizándose entre los dos últimos puntos de tiempo (valor p de DEV 30 vs DEV 60 = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 valor p = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 valor p = 0,99). Se encontraron bajos niveles de muerte celular que disminuyeron con el tiempo (6,83 ± 5,21%, 3,57 ± 3,02%, 3,66 ± 3,10% para los DEV 30, 60 y 90, respectivamente) y se encontró una diferencia significativa entre los puntos de tiempo DEV 30 y posteriores, DEV 60 y DEV 90 (valor p de DEV 30 vs DEV 60 = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 valor p = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 valor p = 0,99). Estos datos, en asociación con la tasa de apoptosis, confirman la supervivencia del corte a lo largo del tiempo y respaldan la efectividad del protocolo de cultivo a largo plazo realizado.
Una vez que se estableció la factibilidad del cultivo prolongado de las rodajas de SC, desafiamos el sistema mediante el trasplante de células h-SC-NES en las primeras etapas de la diferenciación neuronal. Probamos las células h-SC-NES porque han mostrado resultados prometedores para el tratamiento de la LME12. El procedimiento de trasplante de células h-SC-NES en cortes de SC de ratón se describe en la sección 6 del protocolo. Los cortes de SC y las células h-SC-NES trasplantadas se mantuvieron hasta DPT 30. Las células se injertaron en DIV 10 de diferenciación (etapa precursora neural) en cortes organotípicos de DEV 4, como se muestra en el esquema de protocolo de la Figura 5A. Las células trasplantadas se monitorizaron para determinar la expresión de GFP en cultivo durante un máximo de 30 días. La Figura 5B muestra imágenes representativas en vivo, en diferentes DPT, de un corte de SC con células GFP+ trasplantadas. La expresión estable de GFP a lo largo del tiempo (Figura 5B y Figura 6A) sugiere que las células sobrevivieron en el tejido SC en las condiciones de cultivo previamente optimizadas. También se comprobó la tasa de apoptótica de las células trasplantadas, tal y como se describe en la sección 10.2 del protocolo. Se encontró que la tasa apoptótica (% de células aCASP3+ /número total de células Hu-Nu+ ) era muy baja (0,44 ± 0,34%) después de 30 DPT (Figura 6B). Además, se encontró que la tasa apoptótica en DPT 30 estaba en línea con la encontrada para el mismo tipo de células en DPT 7, como se informó anteriormente40, lo que documenta que los cultivos se estabilizan con el tiempo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo del protocolo. Esquema representativo que muestra el flujo de trabajo general del protocolo realizado. (A) A la izquierda, un esquema que resume la generación de cortes SC de ratón a partir de SC aislados de cachorros de ratón en P3 y el cultivo a largo plazo de cortes organotípicos SC. (B) A la derecha, un esquema que resume el trasplante de células h-SC-NES que expresan GFP en cortes organotípicos SC de ratón. Las células injertadas se mantienen durante 30 días después del trasplante. Abreviaturas: h-SC-NES = tronco neuroepitelial derivado de la médula espinal humana; GFP = proteína verde fluorescente; DEV = día ex vivo; DPT = día después del trasplante; NFL = cadena ligera de neurofilamento; RBFOX3= ARN de unión a fox-1 homólogo 3; aCASP3 = Caspasa-3 activa; SC= médula espinal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> Figura 2: Optimización de las condiciones de cultivo a largo plazo. (A) Esquema representativo del protocolo para la prueba de OM y GM. La MO se mantiene hasta DEV 7-10 para el grupo control. El medio se cambia al GM en DEV 3 para las lonchas tratadas; luego, se fijan en DEV 7-10 para su comparación con los controles. (B) Imágenes representativas comparando cortes organotípicos de SC de ratón en DEV 7 y 10 cultivados en diferentes condiciones. Las rodajas se tiñen para el neurofilamento marcador del citoesqueleto (NFL, verde). La amplia distribución de la tinción de NFL en cortes cultivados con GM sugiere una supervivencia y diferenciación general. Los núcleos se contratiñen con DAPI. Barra de escala = 500 μm. (C) Histogramas representativos de la estimación del área cubierta por NFL en los cortes que se muestran en la Figura 1B. En DEV 10, el área de superficie de la NFL disminuye en la condición de cultivo OM. Abreviaturas: DEV = día ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = cadena ligera de neurofilamento.; MO = medio organotípico; GM = medio de injerto; SC = médula espinal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> Figura 3: Cortes organotípicos SC de ratón cultivados a largo plazo. (A) Los cortes se mantienen en cultivo hasta DEV 90. El ensayo de inmunofluorescencia revela una amplia distribución del marcador citoesquelético neurofilamento (NFL, verde) y el marcador neuronal nuclear RBFOX3 (rojo), lo que atestigua su estado de salud e identidad neuronal después del cultivo a largo plazo. Cabe destacar que los axones de NFL+ brotan difusamente alrededor de las rodajas con el tiempo. Los núcleos se contratiñen con DAPI. Barra de escala = 500 μm. (B) Histogramas representativos de la estimación del área y el tiempo NFL+ y el área RBFOX3+ de los cortes que se muestran en el panel A. El área de neuritas de la NFL+ aumenta con el tiempo. Abreviaturas: DEV = día ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = cadena ligera de neurofilamento; SC = médula espinal; RBFOX3= ARN de unión a fox-1 homólogo 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> Figura 4: Evaluación de la viabilidad celular en los cortes de SC a lo largo del tiempo. (A) Imágenes representativas de cortes organotípicos en DEV 60 teñidos para aCASP3 (rojo) y NFL (verde). Barra de escala = 100 μm. NFL muestra un patrón difuso. Las células raras son positivas para el marcador apoptótico aCASP3 (Recuadros: 1-2-3). (B) Análisis de la tasa de apoptosis en cortes en diferentes momentos temporales. Media ± DE, N (réplicas) = 6 cortes, n (células totales) &gt; 1,000 para cada corte, prueba de Kruskal-Wallis, comparación múltiple, valor p &gt; 0.05. La tasa apoptótica es estable en el tiempo. En los recuadros 1-2-3 del panel A, es posible observar detalles de células positivas para aCASP3 (tinción roja, flechas blancas). Pequeños puntos rojos etiquetan los restos celulares y los núcleos picnóticos. Barra de escala = 50 μm. (C) Imágenes representativas de ensayos vivos/muertos realizados en cortes de SC en DEV 90: las células metabólicamente activas se marcan en verde con calceína, mientras que las células muertas y dañadas se marcan en azul claro (cian) con Sytox. Los dos histogramas muestran el porcentaje de células positivas para Calceína (a la izquierda) y Sytox (a la derecha) en el número total de células. Para ambos promedios ± DE, N (réplicas) = 6 cortes, n (celdas totales) &gt; 1,000 para cada corte, prueba de Kruskal-Wallis, comparación múltiple, valor p de DEV 30 vs DEV 60 = 0.018; DEV 30 vs DEV 90 valor p = 0,027; El valor p de DEV 60 frente a DEV 90 &gt; 0,99. Abreviaturas: DEV = día ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = cadena ligera de neurofilamento; SC = médula espinal; aCASP3 = caspasa-3 activa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> Figura 5: Trasplante de células h-SC-NES en cortes organotípicos de ratón. (A) Esquema representativo del protocolo de trasplante. Las células se trasplantan como precursores neurales en DIV 10 de diferenciación en cortes organotípicos de DEV 4. (B) Imágenes representativas de cortes organotípicos de ratón trasplantados con células h-SC-NES que expresan GFP a lo largo del tiempo hasta DPT 30. Las células se transducen con un vector lentiviral portador del gen GFP . La expresión de GFP a lo largo del tiempo confirma su viabilidad y adaptación al entorno de corte. Barra de escala = 500 μm. Abreviaturas: DIV = primer día en prediferenciación; h-SC-NES = tronco neuroepitelial derivado de la médula espinal humana; GFP = proteína verde fluorescente; DEV = día ex vivo; MO = medio organotípico; GM = medio de injerto; DPT = días después del trasplante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> Figura 6: Evaluación de la tasa de apoptosis de las células h-SC-NES trasplantadas después de 30 días desde el trasplante. (A) Imagen representativa de un corte organotípico de ratón trasplantado con células h-SC-NES que expresan GFP. Las células se transducen con un vector lentiviral portador del gen GFP para monitorearlas en las rodajas después del trasplante. La expresión de GFP a lo largo del tiempo confirma su viabilidad y adaptación al entorno de corte. El punto de tiempo que se muestra es DPT 30; Las células se tiñen para núcleos humanos (cian) y aCASP3 (rojo). Barra de escala = 150 μm. (B) A la izquierda, gráfico circular representativo del análisis de apoptosis de células trasplantadas en cortes a DPT 30 (N (réplicas) = 5 cortes, n (células) = 5.000), y a la derecha, un recuadro de células Hu-Nu+ y un detalle de una célula positiva a aCASP3 (flecha blanca). Barra de escala = 75 μm. Pequeños puntos rojos etiquetan los restos celulares y los núcleos picnóticos. Abreviaturas: h-SC-NES = tronco neuroepitelial derivado de la médula espinal humana; GFP = proteína verde fluorescente; DPT = día después del trasplante; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; NFL = cadena ligera de neurofilamento; aCASP3 = caspasa-3 activa; Hu-Nu = núcleos humanos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Composición de las soluciones utilizadas en este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

En este artículo, proporcionamos un método reproducible para generar y mantener cortes organotípicos de la médula espinal a largo plazo trasplantados con células madre neurales como modelo ex vivo para probar terapias de reemplazo celular.

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Cultivo a largo plazo de cortes organotípicos de médula espinal de ratón como plataforma para validar el trasplante de células en lesiones de la médula espinal (Video) | JoVE Journal

Cultivo a largo plazo de cortes organotípicos de médula espinal de ratón como plataforma para validar el trasplante de células en lesiones de la médula espinal

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