Name: Electroporación in vivo combinada y reinervación a corto plazo del músculo esquelético elevador del auris largo craneal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: Aprende electroporación in vivo y denervación del músculo LAL en ratones CF-1 para estudiar la regeneración de la unión neuromuscular. Este protocolo permite analizar proteínas musculares y su impacto en la estabilidad de receptores postsinápticos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Electroporación y lesión nerviosa en el músculo elevador del auris largo del ratón

<ol><li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The functional organization of motor nerve terminals.</a> Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).</li>
<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+Coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: Coordinating partners with multiple functions.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Zelada, D., Bermedo-Garcia, F., Collao, N., Henriquez, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+function+recovery%3A+Deciphering+a+regenerative+niche+at+the+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">Motor function recovery: Deciphering a regenerative niche at the neuromuscular synapse.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 96 (2), 752-766 (2021).</li>
<li>Kobayashi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+duration+of+muscle+denervation+on+functional+recovery+in+the+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model.</a> Muscle Nerve. 20 (7), 858-866 (1997).</li>
<li>Bermedo-Garcia, F., Zelada, D., Martinez, E., Tabares, L., Henriquez, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+the+murine+neuromuscular+synapse+relies+on+long-lasting+morphological+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of the murine neuromuscular synapse relies on long-lasting morphological adaptations.</a> BMC Biol. 20 (1), 158(2022).</li>
<li>Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+the+mouse+levator+auris+longus+muscle%3A+A+convenient+preparation+to+study+muscle+and+nerve+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: A convenient preparation to study muscle and nerve plasticity.</a> J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20 (11), 740-743 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease%3A+Amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 36 (2), 133-156 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-and+postsynaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre-and postsynaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).</li>
<li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J Vis Exp. (55), e3124(2011).</li>
<li>Zelada, D., Barrantes, F. J., Henríquez, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+causes+differential+effects+on+postsynaptic+stability+in+normal+and+denervated+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Lithium causes differential effects on postsynaptic stability in normal and denervated neuromuscular synapses.</a> Sci Rep. 11 (1), 17285(2021).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, Pt 4 1081-1101 (2012).</li>
<li>Mcmahon, J. M., Signori, E., Wells, K. E., Fazio, V. M., Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+electrotransfer+of+plasmid+into+skeletal+muscle+by+pretreatment+with+hyaluronidase%3A+Increased+expression+with+reduced+muscle+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: Increased expression with reduced muscle damage.</a> Gene Ther. 8 (16), 1264-1270 (2001).</li>
<li>Difranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transfection+of+mammalian+skeletal+muscles+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation.</a> J Vis Exp. (32), e1520(2009).</li>
<li>Ojeda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+levator+auris+longus+muscle%3A+An+amenable+model+system+to+study+the+role+of+postsynaptic+proteins+to+the+maintenance+and+regeneration+of+the+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mouse levator auris longus muscle: An amenable model system to study the role of postsynaptic proteins to the maintenance and regeneration of the neuromuscular synapse.</a> Front Cell Neurosci. 14, 225(2020).</li>
<li>Olmstead, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facial+nerve+axotomy+in+mice%3A+A+model+to+study+motoneuron+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury.</a> J Vis Exp. (96), e52382(2015).</li>
<li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury%3A+A+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Exp Neurol. 207 (1), 64-74 (2007).</li>
<li>Lloyd, M., Wolfensohn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+use+of+distress+scoring+systems+in+the+application+of+humane+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Humane+Endpoints+in+Animal+Experiments+for+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Practical use of distress scoring systems in the application of humane endpoints.</a> Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research. , 48-53 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+Red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. Red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Perez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p75%28ntr%29+neurotrophin+receptor+is+required+to+organize+the+mature+neuromuscular+synapse+by+regulating+synaptic+vesicle+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">The p75(ntr) neurotrophin receptor is required to organize the mature neuromuscular synapse by regulating synaptic vesicle availability.</a> Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 147(2019).</li>
<li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> J Anat. 237 (5), 827-836 (2020).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+anatomy+of+the+human+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction.</a> Cell Rep. 21 (9), 2348-2356 (2017).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biol. 6 (12), 160240(2016).</li>
<li>Ma, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+axonal+growth+promotes+motor+recovery+after+peripheral+nerve+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice.</a> J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).</li>
<li>Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+motor+recovery+after+prolonged+denervation+of+the+neuromuscular+junction+is+not+due+to+regenerative+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lack of motor recovery after prolonged denervation of the neuromuscular junction is not due to regenerative failure.</a> Eur J Neurosci. 43 (3), 451-462 (2016).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li>
<li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry A. 93 (5), 556-562 (2018).</li>
<li>Morris, L. M., Klanke, C. A., Lang, S. A., Lim, F. Y., Crombleholme, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tdtomato+and+EGFP+identification+in+histological+sections%3A+Insight+and+alternatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Tdtomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives.</a> Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).</li>
<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+A+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).</li>
<li>Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+electroporation+as+a+plasmid+delivery+system+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle.</a> Int J Mol Sci. 20 (11), 2776(2019).</li>
<li>Pérez-García, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+musk+activity+delays+denervation+and+improves+motor+function+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Increasing musk activity delays denervation and improves motor function in ALS mice.</a> Cell Rep. 2 (3), 497-502 (2012).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>#5/45 Pinzas Dumont&nbsp;</td><td>Herramientas de Bellas Ciencias&nbsp;</td><td>11251-35</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>anti 2H3</td><td>DSHB</td><td></td><td>Diluido 1 : 300</td></tr><tr><td>anti S100 Listo para usar</td><td>Dako</td><td>IR504</td><td>Diluido 1 : 5</td></tr><tr><td>anti SV2</td><td>DSHB</td><td></td><td>Diluido 1 : 50</td></tr><tr><td>Gluconato de clorhexidina 2%</td><td>DifenPharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección con luz fría</td><td>Motic</td><td>Modelo SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Diluido 1 : 100</td></tr><tr><td>Pinzas de #5SF Dumont</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11252-00</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>Dumont Mini Pinzas &ndash; Estilo 5</td><td>Herramientas de Ciencia Fina &nbsp;</td><td>11200-14</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>Electroporador ECM 830</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrodos tipo aguja de oro&nbsp;</td><td>Genetrodes, BTX</td><td>45-0114</td><td></td></tr><tr><td>jeringa Hamilton recta de 10 mm&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia inhalatoria</td><td>SciVerma Scientific</td><td>M3000</td> Isoflurano de Mesa <td></td></tr><tr><td></td><td>Baxter</td><td>218-082</td><td></td></tr><tr><td>Ratones</td><td>Instituto de Salud Pública - Chile</td><td></td><td>Ratones CF-1 adultos (3-6 meses de edad), de ambos sexos (30-45 g)&nbsp;</td></tr><tr><td>Cuchillas de afeitar</td><td>Schick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture Glicosorb 5/0</td><td>TAGUM</td><td>GS0812. J</td><td>Hilo de ácido poliglicólico absorbible&nbsp;</td></tr><tr><td>tdPlásmido de tomate</td><td>Addgene</td><td>54642</td><td>tdPlásmido de tomate bajo el control del promotor de CMV</td></tr><tr><td>Clorhidrato de tramadol al 5% (Triamcol)</td><td>Drag Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>91500-09</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>WGA Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>W7024</td><td>Diluir</td></tr><tr><td>&alpha;-BTX Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>B13422</td><td>Diluido 1 : 500</td></tr></tbody></table>

electroporación in vivo combinada y reinervación a corto plazo del músculo esquelético elevador del auris largo craneal

Combined In Vivo Electroporation and Short&#45;Term Reinnervation of the Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle

El alto rendimiento cuántico de fluorescencia de la proteína tdTomato20 la convierte en un trazador apropiado para la eficiencia de la electroporación. Por lo tanto, se evaluó la expresión de la proteína tdTomato en músculos LAL por electroporación in vivo (Figura 1). Los músculos LAL se diseccionaron 21 días después de la electroporación. Las preparaciones de montaje completo muestran la banda caudal delgada (cLAL, polígono cian) del músculo LAL con sus dos regiones de inervación, y la banda rostral gruesa (rLAL, polígono amarillo) con sus cinco regiones de inervación 8,10 (Figura 1B). De acuerdo con el sitio de inyección de ADN y la posición de los electrodos, una alta proporción de fibras musculares, específicamente de la porción rLAN, fueron positivas para la expresión de tdTomato (Figura 1B). Se realizaron criosecciones transversales como se describe16 para evaluar la eficiencia del procedimiento (Figura 1C). La cuantificación muestra un 66,70% ± 5,95% de fibras positivas para la expresión de tdTomato (Figura 1D). Luego, para evaluar el daño de las fibras musculares, se marcó la membrana muscular con WGA y los núcleos con DAPI (Figura 1C) para identificar la presencia de núcleos centrales (puntas de flecha) como signo de ciclos de daño/regeneración. No se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de fibras con núcleo central entre los músculos control y los músculos LAL electroporados (Figura 1E).
El aplastamiento de la rama auricular posterior del nervio facial denerva el músculo LAL6 (Figura 2A). Los músculos LAL de ratones control y de ratones 5 días, 10 días y 60 días después de la lesión nerviosa fueron disecados, fijados y teñidos utilizando los métodos descritos anteriormente16,21. En resumen, el anticuerpo SV2 marca las vesículas sinápticas y se utiliza junto con el anticuerpo 2H3 contra los neurofilamentos para revelar todo el dominio presináptico 6,16,22,23,24. El anticuerpo S100B se utilizó para teñir las células de Schwann, mientras que α-BTX detectó AChRs postsinápticas. La microscopía confocal mostró una denervación completa de la NMJ 5 días después de la lesión nerviosa (Figura 2B). Los dominios postsinápticos parecen reinervarse 10 días después de la lesión nerviosa (Figura 2B). Después de 60 días (Figura 2B), los NMJs regenerados mostraron un fenotipo similar al control.
Por último, se probó el uso combinado de los protocolos de electroporación in vivo y trituración del nervio facial. Para ello, se electroporaron los músculos LAL con un vector que expresa la proteína tdTomato, y 3 días después, se realizó la lesión nerviosa. Después de 9 días, el músculo LAL se diseccionó, fijó y tiñó para revelar los dominios presinápticos y postsinápticos NMJ (Figura 3A). Se puede observar la expresión de la proteína tdTomato en las fibras musculares, junto con NMJs denervados (punta de flecha verde) y reinervados (flechas amarillas) (Figura 3B). La cuantificación reveló que el 58,37% ± el 4,63% de las fibras son positivas para la expresión de tdTomato (Figura 3C, barra izquierda), mientras que el 47,00% ± 10,69% de los dominios postsinápticos están reinervados (Figura 3C, barra derecha).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig01.jpg"> Figura 1: Transferencia génica eficiente in vivo mediada por electroporación de músculos LAL. Un plásmido que codifica para la proteína tdTomato se expresó en músculos LAL mediante electroporación in vivo de ratones adultos. La solución de ADN se inyectó debajo de la fascia muscular rLAL, y se colocaron electrodos tipo aguja de oro sobre el músculo para administrar cinco pulsos de 100 V/cm2 con una duración de 20 ms a 1 Hz (A). Los músculos montados enteros se diseccionaron 21 días después de la electroporación y se tiñeron para AChR con α-BTX (blanco). Se observaron fibras electroporadas que expresan tdTomate (rojo) en el músculo rLAL (B). El músculo rLAL se seccionó transversalmente y se tiñó con WGA (amarillo) y DAPI (cian) (C) para detectar la membrana muscular y los núcleos, respectivamente. La eficiencia del procedimiento se cuantificó como el porcentaje de fibras que expresan tdTomato (rojo en C) a partir de fibras totales mediante tinción WGA (D). Se cuantificó la proporción de núcleos centrales (puntas de flecha) como parámetro de daño/regeneración de fibras musculares (E). Los estadísticos representan la media ± SEM de N: tres animales por grupo (control y electroporados). Barra de escala = 1 mm (B), 50 μm (C). ns = no significativo; Prueba T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig02.jpg"> Figura 2: Regeneración a corto plazo de la NMJ mediante un protocolo de lesión por aplastamiento del nervio. Para una lesión específica por aplastamiento del nervio, la rama auricular posterior del nervio facial (cian) se puede exponer de manera eficiente mediante la identificación de algunos indicadores anatómicos: la vena auricular posterior, el vientre del músculo digástrico y el canal auditivo cartilaginoso (A). Imágenes representativas de microscopía confocal de NMJ del músculo LAL obtenidas de control o disecadas 5 días, 10 días y 60 días después del aplastamiento nervioso de ratones adultos. Las NMJ se identificaron marcando axones y terminales motores (SV2 para las vesículas sinápticas más 2H3 para los neurofilamentos; cian), células de Schwann (anti-S100 B; amarillo) y AChRs (α-BTX; magenta) (B). Los paneles inferiores muestran los canales de los axones del motor (paneles izquierdos) y AChR (paneles derechos) por separado. Se dibujaron formas grises para delimitar la posición de los dominios postsinápticos y evaluar el estado de inervación. Barras de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig03.jpg"> Figura 3: Protocolos combinados de electroporación in vivo y lesión por aplastamiento nervioso. El músculo LAL fue electroporado con un plásmido que codifica para la proteína tdTomato (rojo). La rama auricular posterior del nervio facial fue aplastada 3 días después de la electroporación. Después de 9 días, se diseccionó el músculo LAL (A) y se identificaron los componentes pre y postsinápticos mediante el marcaje de axones motores y terminales (SV2 más anticuerpos 2H3, cian) y AChRs (α-BTX; magenta) (B). Se indica un NMJ denervado (punta de flecha verde) y un NMJ reinervado (flecha amarilla). Cuantificación de la proporción de fibras positivas para la expresión de la proteína tdTomato (barra izquierda), y la proporción de dominios postsinápticos contactados por un axón motor regenerado (barra derecha) (C). Los resultados representan la media ± SEM de N: 3 ratones por grupo. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Electroporación in vivo combinada y reinervación a corto plazo del músculo esquelético elevador del auris largo craneal

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many ...

combined-vivo-electroporation-short-term-reinnervation-cranial

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describen los procedimientos para la administración repetida de los inhibidores de la señalización de receptores muscarínicos a la largo del músculo elevador del auris (LAL) del músculo de los ratones adultos jóvenes y de inmunotinción posterior de sus uniones neuromusculares (NMJs) en wholemounts. El músculo LAL tiene ventajas únicas para...

La administración subcutánea de antagonistas muscarínicos y Triple-inmunotinción del músculo largo del elevador del Auris en ratones

Cartílagos craneofaciales en estrecho contacto con otros tejidos, y son difíciles de manipular en animales vivos. Estamos utilizando electroporación para ofrecer herramientas moleculares durante el crecimiento del esqueleto craneofacial sin pasar por los primeros efectos de embriones. Este enfoque nos permite analizar de manera eficiente las moléculas...

Electroporación de mesénquima craneofacial

Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento de las neuronas olfatorias primarias. Esta propiedad específica se puede utilizar para el trasplante celular. Se presenta aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de OECs en un modelo de lesión del nervio laríngeo.

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

El uso del nervio masetérico como nervio donante representa una alternativa de una sola etapa al criterio estándar de procedimiento de dos etapas de injerto de nervio facial cruzado y transferencia de músculo libre en la parálisis facial. Proporcionamos una descripción detallada para realizar de manera segura esta técnica con una transferencia de músculo gracilis y discutimos las indicaciones y limitaciones.

De una etapa dinámica Reanimación de la Sonrisa en Irreversible Parálisis facial por Free transferencia muscular funcional

El protocolo descrito en este artículo utiliza el músculo levator auris longus (LAL) de ratón para grabar espontánea y nervio postsynaptic potenciales evocados (abrazadera de la corriente) y corrientes (abrazadera de tensión) en la Unión neuromuscular. Uso de esta técnica puede proporcionar ideas claves en los mecanismos de transmisión sináptica en condiciones normales y la enfermedad.

Del levator Auris Longus Preparación para examen de la transmisión Neuromuscular mamífero bajo condiciones de fijación de voltaje

Modelos animales de implantes cocleares pueden avanzar el conocimiento de los fundamentos tecnológicos de tratamiento de la pérdida permanente de audición neurosensorial con estimulación eléctrica. Este estudio presenta un protocolo quirúrgico de implantación coclear de una matriz de electrodos en ratones, así como la evaluación funcional con respuesta auditiva del médula oblonga y agudo ensordecedor.

Cirugía de implante coclear y eléctricamente evocada médula oblonga auditivo respuesta grabaciones en ratones C57BL/6

La electroporación es un enfoque efectivo para entregar genes de interés en las células. Al aplicar este enfoque en vivo en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal de ratón adulto (DRG), se describe un modelo para el estudio de la regeneración del axón en vivo.

Investigadora de axón mamífero de regeneración: En Vivo electroporación de ganglio de raíz Dorsal de ratón adulto

Este protocolo describe un enfoque reproducible para la cirugía del nervio facial en el modelo de rata, incluyendo descripciones de varios patrones inducibles de lesión.

Cirugía de nervios faciales en el modelo de rata para estudiar la inhibición y regeneración axonal

Aquí se presenta un protocolo para la fabricación de un sistema implantable para la grabación cronológica in vivo de potenciales electromiográficos evocados y espontáneos. El sistema se aplica a la investigación de la reinnervación de los músculos laríngeos después de la lesión nerviosa.

Un sistema implantable para la electromiografía crónica in vivo

Las lesiones por pérdida muscular volumétrica (VML) superan la capacidad regenerativa endógena, lo que resulta en déficits funcionales permanentes. La investigación actual de VML se centra principalmente en los músculos de las extremidades y el tronco. Para extender los estudios mecanicistas de la VML a los músculos craneofaciales, este artículo describe un método in vivo para la evaluación longitudinal de la función del músculo masetero antes y después de la lesión de la VML.

Evaluación funcional in vivo del músculo masetero de ratas después de la creación quirúrgica de una lesión de pérdida muscular volumétrica (VML)

Aprende electroporación in vivo y denervación del músculo LAL en ratones CF-1 para estudiar la regeneración de la unión neuromuscular. Este protocolo permite analizar proteínas musculares y su impacto en la estabilidad de receptores postsinápticos.

Electroporación in vivo combinada y reinervación a corto plazo del músculo esquelético elevador del auris largo craneal

Explorar más videos