Name: Imágenes con lámina de luz para revelar la estructura cardíaca en corazones de roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende a personalizar un sistema de microscopía de lámina de luz para imaginar estructuras miocárdicas en corazones intactos de roedores con resolución isotrópica. Este método permite estudiar la morfogénesis y remodelación cardíaca sin cortes físicos.

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Expresamos nuestra gratitud al grupo del Dr. Eric Olson en UT Southwestern Medical Center por compartir generosamente los modelos animales. Agradecemos todos los comentarios constructivos proporcionados por los miembros de la incubadora D en UT Dallas. Este trabajo fue apoyado por NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) y el programa UT Dallas STARS (Y.D.).

Los protocolos y experimentos con animales han sido aprobados y llevados a cabo bajo la supervisión del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas en Dallas (IACUC # 21-03). En este estudio se utilizaron ratones C57BL6, incluidos neonatos en el día postnatal 1 (P1) y adultos de 8 semanas de edad. No se observaron diferencias entre machos y hembras. Toda la adquisición de datos y el post-procesamiento de imágenes se llevaron a cabo utilizando software de código abierto o plataformas con licencias de investigación o educativas. Los recursos están disponibles a través de los autores previa solicitud razonable.
1. Preparación de la muestra y limpieza de tejidos (6 - 10 días)
<ol><li>Prepare todas las soluciones químicas en la Tabla de Materiales requeridas para el método de limpieza de tejidos antes de iniciar el procedimiento de limpieza de tejidos. NOTA: Realice todos los procedimientos en una campana extractora mientras usa el equipo de protección personal adecuado, especialmente cuando manipule productos químicos tóxicos.</li>
	<li>Eutanasiar a los animales con CO2 colocándolos en una cámara de CO2 en los puntos de tiempo deseados, como P1 y 8 semanas, para la recolección de corazón completo y sumergir el corazón recién aislado a temperatura ambiente (RT) en KCl 0,2 M para detenerlo en la diástole16.</li>
	<li>Fije el corazón sumergiéndolo en paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x con una suave agitación en un balancín durante la noche para preservar la anatomía cardíaca a 4 °C, ver Tabla 1. PRECAUCIÓN: El PFA es un producto químico tóxico y debe realizarse bajo una campana extractora.</li>
	<li>Lava el corazón con 1x PBS en RT durante 30 min, 3x. NOTA: Opcional: Incruste el corazón en gel de agarosa para crear un ensamblaje de corazón para el sistema LSM personalizado en el paso 2 como se describe a continuación.<ol><li>Prepare la solución de agarosa al 1% disolviendo agarosa en PBS y caliente la mezcla en el microondas hasta la disolución completa. Vierta la solución en un molde para crear una capa inferior hasta que la solución se enfríe a 40 °C.</li>
		<li>Coloca el corazón en el molde y rellena el molde con gel de agarosa hasta que se solidifique. Elimine cualquier burbuja en el gel de agarosa para minimizar los artefactos en las imágenes. NOTA: La inclusión de la muestra reduce el riesgo de daño potencial a la anatomía del corazón durante el montaje. PRECAUCIÓN: Utilice agarosa de bajo punto de fusión y evite colocar el corazón directamente en agarosa calentada para mitigar el riesgo de exponer la muestra a temperaturas elevadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Deshidratar el corazón utilizando gradientes de metanol mezclado con agua desionizada (Figura 1B), procesando a través de concentraciones secuenciales de 20%, 40%, 60%, 80% y 100% como se describe en la Tabla 1. Repita con metanol 100% fresco 1x para asegurar una deshidratación completa. Deshidratar corazones de ratón neonatos durante 1 h en cada mezcla de metanol con agitación. Ajuste el tiempo de incubación a 2 h para corazones de ratón de 8 semanas y corazones de rata. PRECAUCIÓN: El metanol es un producto químico volátil, irritante e inflamable.</li>
	<li>Reemplace y enfríe el corazón con metanol fresco 100% durante 10 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Reemplace la solución y blanquee el corazón con peróxido de hidrógeno al 5% (H2O2) en metanol, utilizando una proporción de volumen de 1:5 (30%H2O2 a 100% metanol) durante la noche a 4 °C para eliminar los pigmentos. NOTA: La eliminación de pigmentos permite minimizar la absorción de fotones, lo que mejora la calidad de la imagen con menos artefactos.</li>
	<li>Reemplace la solución e incube el corazón en metanol al 100% durante 1 h en RT.</li>
	<li>Desapidar el corazón con la solución que contiene 66% de diclorometano (DCM) y 33% de metanol durante 3 h con agitación. Asegúrese de que el corazón se hunda hasta el fondo del vial al final de este paso. De lo contrario, renueve la solución (66% DCM / 33% metanol) y extienda el tiempo de incubación (por ejemplo, 1 hora más) para lograr una delipidación completa. Transfiera el corazón a una solución fresca rápidamente para evitar la desecación, ya que la DCM es altamente volátil. PRECAUCIÓN: Utilice polipropileno o cristalería para el experimento, ya que el DCM no es compatible con el poliestireno.</li>
	<li>Utilice éter dibencílico (DBE) para la coincidencia del índice de refracción (RI = 1,56). En el caso de los corazones de ratón neonatos, el proceso de coincidencia del índice de refracción tarda 2 días, mientras que en el caso de los corazones de ratón de 8 semanas de edad, tarda 5 días con un leve temblor. Reemplácelo con DBE fresco y extienda el tiempo de incubación hasta que el corazón logre una transparencia completa. PRECAUCIÓN: El DBE es peligroso. Evite cualquier contacto con la piel.</li>
</ol>2. Montaje de la muestra (1 día)
NOTA: En caso de que se utilice un sistema LSM comercial, siga su protocolo específico proporcionado por la compañía para reparar el corazón y omita los pasos 2.1 - 2.9.
<ol><li>Personalice una cámara y un soporte resistentes a la solución de adaptación del índice de refracción (por ejemplo, DBE en el enfoque iDISCO adaptado) utilizando una impresora 3D y materiales Onyx (Figura 2A)16.</li>
	<li>Coloque un imán en la parte inferior de la cámara para facilitar una conexión rápida y una localización precisa bajo el sistema LSM (Figura 2B).</li>
	<li>Fije cubreobjetos de 25 mm x 50 mm x 0,17 mm a la cámara con pegamento de silicona transparente y verifique la integridad impermeable de la cámara llenándola con DBE y comprobando si hay fugas después de 1 día.</li>
	<li>Personalice un soporte de abrazadera con una impresora 3D y coloque un imán para montar el conjunto del corazón dentro de la cámara (Figura 2C) o inserte una aguja en el gel de agarosa para montar el conjunto del corazón.</li>
	<li>Llevar a cabo el desarrollo de un sistema LSM interno utilizando una lente cilíndrica y láseres de estado sólido bombeados por diodo de onda continua (DPSS) como se informó anteriormente16,22. Utilice la longitud de onda de excitación de 532 nm para capturar la autofluorescencia del miocardio (Figura 2D).</li>
	<li>Monte la cámara en una plataforma de 6 dimensiones y ubique la posición óptima donde la cámara sea perpendicular a la dirección de propagación del láser.</li>
	<li>Utilice un soporte de abrazadera magnética para colocar la muestra en el centro de la cámara y conecte el soporte a una etapa motorizada de 4 dimensiones (X, Y, Z y guiñada; Figura 2D).</li>
	<li>Sumerja el conjunto del corazón en la cámara llena de DBE utilizando la platina motorizada y determine el rango de escaneo a lo largo del eje de detección (dirección Z).</li>
	<li>Determine la velocidad de escaneo (Vz) del motor a lo largo de la dirección Z en función del tamaño del paso (S) y el tiempo de adquisición de una imagen (T) utilizando la siguiente ecuación: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: La relación entre el tamaño del paso y la resolución axial del sistema de imágenes se adhiere al teorema de muestreo de Nyquist-Shannon. Por ejemplo, el tamaño del paso se fijó en 1 μm, dado que la resolución axial era de 2,91 μm, como se indicó en el informe anterior16.</li>
	<li>Para verificar la resolución espacial y minimizar los posibles problemas de opacidad a diferentes profundidades, mida la función de dispersión puntual (PSF) del sistema mediante la obtención de imágenes de perlas fluorescentes con un diámetro de 0,53 μm diluidas en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% con una concentración de 1:1,5 x 105. Calcule la PSF en toda la muestra midiendo el ancho completo a la mitad del máximo (FWHM)16.</li>
</ol>3. Costura de imágenes (4-8 h)
<ol><li>Calcule el número de fichas necesarias para cubrir todo el corazón del ratón, teniendo en cuenta el campo de visión limitado. Para cada baldosa, las dimensiones corresponden al campo de visión del sistema LSM. Por ejemplo, un corazón de ratón neonatal con una medida de sección transversal de 3 x 3,6mm2 necesita 2 x 2 mosaicos para la cobertura en el LSM personalizado (Figura 3A). Por el contrario, un corazón de ratón de 8 semanas de edad que mide 5 x 8mm2 requiere 3 x 4 baldosas para cubrir toda la estructura cardíaca (Figura 3B). NOTA: La unión de imágenes es necesaria si el LSM convencional tiene un campo de visión limitado para obtener imágenes de todo el corazón.</li>
	<li>Capture imágenes del corazón a partir de la ficha 1, es decir, la ficha de la esquina superior izquierda del corazón (Figura 3A-B).</li>
	<li>Capture secuencialmente imágenes de las baldosas restantes con una superposición del 10% entre baldosas consecutivas hasta que se cubra todo el corazón, como se ilustra en la Figura 3C.</li>
	<li>Descargue e instale el software de código abierto Fiji23 . Descargue e instale el complemento de Fiji, BigStitcher24.</li>
	<li>Vaya al menú Ayuda, seleccione Actualizar, elija Administrar sitio de actualización y opte por BigStitcher. A continuación, haga clic en Cerrar, seguido de Aplicar cambios. Al completar la descarga del complemento, reinicie el software Fiji.</li>
	<li>Abra el complemento BigStitcher e importe todos los mosaicos necesarios a través del directorio de archivos de imagen. Guarde el conjunto de datos como un archivo HDF5.</li>
	<li>Organice las fichas eligiendo Mover ficha por cuadrícula normal, seleccione el patrón que se utiliza para mover el corazón y seleccione una superposición del 10% entre cada ficha. Cose las baldosas con la opción Asistente de costura.</li>
	<li>Exporte los datos unidos mediante Image Fusion para generar un archivo tiff.</li>
</ol>4. Deconvolución multivista (5 días)
<ol><li>Utilice perlas fluorescentes para el registro de imágenes de la reconstrucción multivista a lo largo del corazón (Figura 3D).<ol><li>Prepare la resina25 mezclando éter diglicidílico de bisfenol-A (D.E.R. 332), isoforona diamina, 5-amino-1,3,3-trimetilciclohexanemetilamina (IPDA) y éter diglicidílico de polipropilenglicol (D.E.R 736) en una proporción de volumen de 4:1:1.</li>
		<li>Centrifugar 10 μL de perlas de fluorescencia a 161 x g durante 5 min y añadir 20 μL de metanol para sustituir la solución de almacenamiento de las perlas. Repítelo 3 veces.</li>
		<li>Prepare una solución de 10 ml con una concentración de perlas de 1:1 x 105 mezclando la solución de perlas a base de metanol con la resina preparada en el paso 4.1.1.</li>
		<li>Desgasifique la solución en una cámara de vacío durante 3 h para eliminar las bolsas de aire y las burbujas.</li>
		<li>Vierta la solución en un molde de silicona o una pajita de plástico y espere de 2 a 3 días hasta que se solidifique. Después de 1 día antes de que la resina se solidifique, coloque el tubo de vidrio dentro del molde y espere hasta que el tubo se adhiera a la resina. Retire la resina del molde con el tubo de vidrio (Figura 3D).</li>
		<li>Coloque el corazón en el tubo de vidrio, llénelo con DBE y monte el tubo de vidrio en la cámara llena de DBE.</li>
	</ol></li>
	<li>Capture imágenes secuenciales del corazón del ratón junto con las cuentas de la sección iluminada escaneando el conjunto del corazón a través del eje de detección (eje Z; Figura 3E-F). NOTA: Implemente la unión de imágenes en el paso 3 para generar pilas individuales de imágenes si el tamaño del corazón supera el campo de visión.</li>
	<li>Gire el corazón del mouse 60° a lo largo del eje Y para capturar las pilas posteriores desde múltiples ángulos, es decir, 0°, 60°, 120°, 180°, 240° y 300° (Figura 3E-F).</li>
	<li>Abra el complemento BigStitcher e importe todas las imágenes a través del directorio de archivos de imagen. Guarde el conjunto de datos como un archivo HDF5.</li>
	<li>Elija Detectar puntos de interés y seleccione manualmente las cuentas de interés para el registro.</li>
	<li>Seleccione Modelo de transformación afín para el registro. Elija la función de dispersión de puntos y asigne PSF a todas las vistas.</li>
	<li>Haga clic en Deconvolución multivista y elija el tipo de iteración como Bayesiano eficiente. Defina Número de iteraciones como 10 y ejecútelo26.</li>
	<li>Haga clic en Image Fusion para exportar un archivo tiff . NOTA: Se puede encontrar información más detallada sobre la deconvolución multivista en otros informes o protocolos 24,27,28.</li>
</ol>5. Herrajes del sistema de lámina de luz de barrido axial (1 día)
<ol><li>Instale una lente eléctrica sintonizable (ETL) en el plano de Fourier de la lente cilíndrica (CL)27 (Figura 2D) para escanear el rayo láser axialmente14. Asegúrese de que la interfaz líquida en ETL sea horizontal para evitar la distorsión del frente de onda causada por la gravedad. Alinee el ETL con precisión para minimizar el descentramiento del haz y las aberraciones ópticas de orden superior30.</li>
	<li>Instale una tarjeta DAQ en la estación de trabajo y conecte un cable BNC a la tarjeta DAQ para sincronizar la exposición de la cámara y el escaneo ETL.</li>
	<li>Abra la carcasa del controlador ETL y retire la cubierta (Figura 4).</li>
	<li>Suelde el cable de señal del cable BNC al pin de entrada analógica B, como se indica en la parte inferior de la placa PCB (Figura 4).</li>
	<li>Suelde el cable de tierra del cable BNC al pin GND; después de eso, conecte el otro extremo del cable BNC a AO (salida analógica) en la tarjeta DAQ (Figura 4).</li>
	<li>Conecte el controlador ETL al puerto USB de la estación de trabajo, conecte el controlador al ETL mediante un cable hirose e instale el software del controlador del controlador de lentes.</li>
	<li>Cambie el modo de operación en el software del controlador del controlador de lente a analógico para controlar el ETL con un disparador generado desde la tarjeta DAQ.</li>
	<li>En el software de la cámara sCMOS, cambie el modo de captura a Externo (hoja de luz). Asegúrese de que la dirección de escaneo de píxeles activos sea perpendicular a la dirección de escaneo láser para ayudar a la sincronización.</li>
	<li>Conecte el puerto de disparo externo en la parte posterior de la cámara sCMOS al AO de la tarjeta DAQ mediante un cable BNC (Figura 4).</li>
</ol>6. Sincronización del sistema de lámina de luz de barrido axial (7 días)
<ol><li>Defina el tiempo de exposición en función de la relación señal-fondo (SBR) aceptable que, para el estudio propuesto, es de al menos 10. Aumente el tiempo de exposición si el SBR es inferior a 10. NOTA: El tiempo de exposición que oscila entre 10 y 50 ms proporciona un SBR aceptable en este proyecto.</li>
	<li>Defina el tiempo de adquisición de una imagen (T) y el intervalo de línea (L) en función del tiempo de exposición (E) para la cámara y la frecuencia ETL (f) utilizando las siguientes ecuaciones: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq02.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66707/66707eq03.jpg" style="margin: auto;"> Donde P indica el número de columnas de píxeles en el sensor de la cámara. Los parámetros representativos para la referencia son f = 1 Hz, P = 2048, E = 10 ms y L = 243 μs, respectivamente.</li>
	<li>En el programa Trigger Generator.vi de LabVIEW, genera disparadores cuadrados y triangulares para la sincronización (Figura 5). NOTA: El programa personalizado de LabVIEW está disponible a través de los autores previa solicitud razonable.</li>
	<li>Monte perlas fluorescentes diluidas en gel de agarosa16 de bajo punto de fusión al 1% con una concentración de 1:1 x 103 para ubicar la posición de la cintura del haz en la imagen (Figura 6A).</li>
	<li>En el programa, identifique los puntos de inicio y finalización del rayo láser bajo el campo de visión cambiando el voltaje a lo largo de la dirección de escaneo.</li>
	<li>Para sincronizar la cámara sCMOS y ETL, escanee el rayo láser a lo largo del eje X y los píxeles activos a lo largo del eje Y para generar una imagen 2D (Figura 6B). Las perlas más brillantes y nítidas a lo largo de la diagonal de la imagen indican la sincronización precisa entre el sCMOS y el ETL. NOTA: La sincronización de la velocidad de escaneo de la activación de píxeles ETL y sCMOS es fundamental para la calidad de la imagen. En la Figura 6C-F se resumen varios errores asincrónicos comunes.</li>
	<li>Después de determinar los parámetros de sincronización óptimos para la sincronización, gire la cámara sCMOS 90° alrededor del eje Z para alinear la dirección del píxel activo con la dirección del escaneo láser.</li>
	<li>Repita el paso 2.10 y mida el FWHM de la PSF. Utilice el mismo método que se indicó en el informe anterior16, con las resoluciones lateral y axial promediadas de ASLM como 2,18 μm y 2,88 μm, respectivamente (Figura 7). NOTA: La iluminación y la resolución uniformes en todo el campo de visión son factibles en condiciones ideales (Figura 7A-B). El funcionamiento asíncrono del ETL con la cámara sCMOS, así como la desalineación de la iluminación y la detección, pueden dar lugar a una resolución espacial no uniforme (Figura 7C-D).</li>
	<li>Para las imágenes cardíacas, después de alinear el sistema y determinar los parámetros óptimos para la sincronización del sistema, continúe con los pasos 2.6 a 2.9.</li>
</ol>

Microscopía de lámina de luz y limpieza de tejidos para obtener imágenes cardíacas completas

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

El avance de los métodos de imagen, computación y limpieza de tejidos ha brindado una oportunidad sin precedentes para investigar exhaustivamente la estructura y función cardíaca. Esto tiene un gran potencial para profundizar nuestra comprensión de la morfogénesis y la patogénesis cardíaca utilizando un modelo de corazón de roedor intacto. A diferencia de los estudios in vivo del corazón del pez cebra que utilizan un enfoque similar 40,41,42,43, la integración de técnicas avanzadas de LSM y métodos de limpieza de tejidos nos permite superar los desafíos entre la resolución espacial y la profundidad de penetración al obtener imágenes del modelo de roedor 9,44. Las técnicas de limpieza de tejidos hacen que los corazones sean ópticamente transparentes mediante la eliminación de lípidos y otros elementos que dispersan la luz, lo que permite una penetración más profunda de las imágenes45. Cuando se combina con LSM, podemos obtener imágenes del miocardio. Esta combinación mejora la profundidad de la imagen y permite la observación de la intrincada microestructura miocárdica. Si bien se han establecido numerosos métodos de aclaramiento18, adaptamos el iDISCO20 para hacer rápidamente transparente el corazón intacto en comparación con otros métodos de aclaramiento de tejidos15, lo que lo hace fácilmente disponible para la obtención de imágenes de autofluorescencia desde el miocardio. Para el marcaje de fluorescencia específico, los protocolos originales iDISCO y Adipo-Clear46 se pueden combinar con la inmunotinción en este sistema de imagen personalizado, a pesar de la incubación más larga. Mientras tanto, se prefieren los métodos que preservan la fluorescencia endógena y requieren un tiempo de procesamiento más corto para el estudio propuesto. A diferencia de otros métodos, esta plataforma ofrece las siguientes ventajas. En primer lugar, utilizamos un protocolo iDISCO adaptado para la limpieza de tejidos, lo que permite una rápida transparencia del corazón en menos de 1 semana mientras conservamos la autofluorescencia del miocardio. En segundo lugar, incorporamos métodos computacionales como la unión de imágenes y la deconvolución multivista en este sistema de lámina de luz establecido para imágenes cardíacas. Por último, diseñamos y sincronizamos el sistema ASLM para mejorar la resolución axial a través de un gran campo de visión, lo que permite la obtención de imágenes multiescala y el análisis de la compactación y trabeculación miocárdica a una resolución casi isotrópica.
Para capturar imágenes cardíacas del modelo de roedores, hemos proporcionado cuatro enfoques basados en LSM: i) el método convencional para fines de cribado19, ii) costura de imágenes, iii) deconvolución multivista y iv) exploración ASLM. Teniendo en cuenta la variación en el tamaño del corazón entre los diferentes modelos, buscamos abordar la compensación fundamental en la resolución espacial, la velocidad de adquisición y el campo de visión. Si bien la unión de imágenes permite el campo de visión grande con una resolución espacial comprometida, la combinación con la deconvolución multivista o ASLM proporciona una resolución casi isotrópica en todo el campo de visión extendido para cubrir todo el corazón del ratón adulto. Además, la integración de estos métodos mejora la calidad de la imagen y el contraste en el tejido profundo, lo que permite una reconstrucción digital completa de modelos 3D de microestructuras, como la trabeculación miocárdica y la compactación dentro de los ventrículos. Sin embargo, la avalancha de conjuntos de datos, el extenso costo de procesamiento computacional, la necesidad de un registro preciso de imágenes y el potencial de artefactos en la deconvolución multivista y la unión de imágenes obstaculizan sus amplias aplicaciones. Si bien ASLM es una alternativa emergente, la complejidad de la sincronización del sistema, las estrategias de escaneo láser y la dependencia de la transparencia de los tejidos plantean desafíos que pueden afectar la robustez del sistema y aumentar el riesgo de fotodaño al corazón.
En conjunto, esta metodología, que incluye imágenes de LSM y limpieza de tejidos, proporciona un punto de partida para explorar la estructura cardíaca desde recién nacidos hasta adultos. Tiene el potencial de localizar la distribución de linajes cardíacos especializados y sus funciones durante el desarrollo cardíaco47. Con el desarrollo de análisis computacionales adaptados a aplicaciones cardíacas 6,48,49,50,51,52,53 , este marco puede extenderse para investigar los procesos de remodelación cardíaca, particularmente en respuesta al infarto de miocardio. En última instancia, esta estrategia holística tiene el potencial de desentrañar el mecanismo subyacente de la morfogénesis cardíaca y avanzar en el desarrollo de intervenciones terapéuticas.

La insuficiencia cardíaca sigue siendo la principal causa de mortalidad en todo el mundo, principalmente debido a la falta de capacidad regenerativa de los cardiomiocitos maduros1. La intrincada arquitectura del corazón desempeña un papel crucial en su función y proporciona información sobre los procesos de desarrollo. Una comprensión profunda de la estructura cardíaca es esencial para dilucidar los procesos fundamentales de la morfogénesis y la remodelación cardíaca en respuesta al infarto de miocardio. Avances recientes han demostrado que los ratones neonatos pueden restaurar la función cardíaca después de una lesión, mientras que los ratones adultos carecen dedicha capacidad regenerativa. Esto establece una base para investigar las señales asociadas con anomalías estructurales y funcionales en modelos de ratón. Los métodos de imagen tradicionales, como la microscopía confocal, tienen limitaciones técnicas, incluida la profundidad de penetración restringida, el esquema de escaneo de punto lento y el daño fotográfico por la exposición prolongada a la luz láser. Esto dificulta la obtención de imágenes tridimensionales (3D) completas del corazón intacto. En este contexto, la microscopía de lámina óptica (LSM) surge como una solución poderosa, que ofrece las ventajas de la obtención de imágenes de alta velocidad, la reducción del daño fotográfico y las capacidades excepcionales de corte óptico 3,4,5. Las características únicas de la LSM lo posicionan como un método prometedor para superar las limitaciones de las técnicas convencionales, proporcionando conocimientos sin precedentes sobre el desarrollo cardíaco y los procesos de remodelación 6,7,8.
En este protocolo, introducimos una estrategia de imagen que combina LSM avanzado con enfoques de limpieza de tejidos adaptados9, lo que permite la obtención de imágenes de corazones de ratón completos sin la necesidad de un etiquetado específico y un corte mecánico. Además, proponemos que las imágenes convencionales de LSM se pueden mejorar a través de técnicas de deconvolución multivista10 o microscopía de lámina de luz de barrido axial (ASLM) 11,12,13,14,15 para mejorar la resolución axial. Además, la integración de la unión de imágenes con cualquiera de estos métodos puede superar eficazmente el equilibrio entre la resolución espacial y el campo de visión (FOV), avanzando así en la obtención de imágenes de corazones de ratón adultos. La incorporación de numerosos enfoques de limpieza de tejidos, incluidos los métodos hidrofóbicos, hidrófilos y basados en hidrogel, permite una penetración más profunda de la luz para capturar la morfología de todo el corazón 16,17,18,19.
Si bien los múltiples métodos de eliminación son compatibles con los sistemas LSM actuales, el objetivo es minimizar la dispersión de fotones y mejorar la penetración de la luz en los tejidos, como el corazón, reemplazando los lípidos con un medio que coincida estrechamente con su índice de refracción. iDISCO fue elegido como el representativo20,21 y adaptado para la obtención de imágenes de autofluorescencia en este protocolo debido a su rápido procesamiento y alta transparencia (Figura 1A). En conjunto, la integración del enfoque avanzado de LSM con las técnicas de limpieza de tejidos ofrece un marco prometedor para desentrañar la intrincada anatomía cardíaca en corazones de roedores, con un potencial significativo para avanzar en nuestra comprensión de la morfogénesis y la patogénesis cardíacas.

<table><tbody><tr><td><fuerte>1% Agarosa</fuerte></td>Agarosa de bajo punto de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fusión Thermo</td><td>Fisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Agua desionizada</td><td>-</td><td>-<</td><td></td></tr><tr><td>fuerte>Productos químicos para la limpieza de tejidos&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-Amino-1,3,3-trimetilciclohexanemetilamina, mezcla de cis y trans</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118184</td><td></td></tr><tr><td>D.E.R.&comercio; 332</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31185</td><td></td></tr><tr><td>D.E.R.&comercio; 736</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31191</td><td></td></tr><tr><td>Éter dibencílico (DBE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Perlas fluorescentes</td><td>Spherotech</td><td>FP-0556-2</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216736</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>47392</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79383</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Software y algoritmos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amira</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2021.2</td><td></td></tr><tr><td>BigStitcher</td><td>H&ouml; rl et al.22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>Schindelin et al.20</td><td>1.54f</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>4.6.1.2</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>2017 SP1</td><td></td></tr><tr><td>Key components of the customized light-sheet system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuerpo con zoom de 0,63 - 6,3X</td><td>Olympus</td><td>MVX-ZB10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo de iluminación 10X</td><td>Nikon MRH00105</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X objetivo de detección</td><td>Olympus</td><td>MV PLAPO 1X/0.25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Láser DPSS de 473 nm Tecnologías</td> de <td>brillo láser</td><td>LRS-0473-PFM-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>Láser DPSS de 532 nm</td><td>Tecnologías de brillo láser</td><td>LRS-0532-PFM-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>589 y delgado; Láser DPSS</td><td>nm Laserglow Technologies</td><td>LRS-0589-GFF-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>Conector BNC</td><td>National Instrument</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>Lente cilíndrica</td><td>Thorlabs</td><td>ACY254-050-A</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de motor de CC, 4 ejes</td><td>Physik Instrumente</td><td>C-884.4DC</td><td></td></tr><tr><td>ETL</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Cable ETL</td><td>Optotune</td><td>CAB-6-300</td><td></td></tr><tr><td>ETL Controlador de lente</td><td>Optotune</td><td>EL-E-4i</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Chroma</td><td>ET525/30</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Chroma</td><td>ET585-40</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Chroma</td><td>ET645-75</td><td></td></tr><tr><td>Rueda de filtros&nbsp;</td><td>Instrumento de obturación</td><td>LAMBDA 10-B</td><td></td></tr><tr><td>Platina de traslación motorizada</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-406.20DG10</td><td></td></tr><tr><td>Platina de traslación motorizada</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-406.40DG10</td><td></td></tr><tr><td>Platina de traslación motorizada</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-403.4PD</td><td></td></tr><tr><td>NI E/S multifunción</td><td>National Instrument</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td>Cámara sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>Motor paso a paso</td><td>Pololu</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Lente</td><td>de tubo Olympus</td><td>MVX-TLU</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes con lámina de luz para revelar la estructura cardíaca en corazones de roedores

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

La microscopía de lámina óptica (LSM) desempeña un papel fundamental en la comprensión de la intrincada estructura tridimensional (3D) del corazón, proporcionando información crucial sobre la fisiología cardíaca fundamental y las respuestas patológicas. A continuación, profundizamos en el desarrollo e implementación de la técnica LSM para dilucidar la microarquitectura del corazón en modelos de ratón. La metodología integra un sistema LSM personalizado con técnicas de limpieza de tejidos, mitigando la dispersión de la luz dentro de los tejidos cardíacos para la obtención de imágenes volumétricas. La combinación de LSM convencional con costura de imágenes y enfoques de deconvolución multivista permite la captura de todo el corazón. Para abordar la compensación inherente entre la resolución axial y el campo de visión (FOV), introducimos un método de microscopía de lámina de luz de barrido axial (ASLM) para minimizar la luz desenfocada e iluminar uniformemente el corazón en toda la dirección de propagación. Mientras tanto, los métodos de limpieza de tejidos, como iDISCO, mejoran la penetración de la luz, lo que facilita la visualización de estructuras profundas y garantiza un examen exhaustivo del miocardio en todo el corazón. La combinación de los métodos de LSM y limpieza de tejidos propuestos presenta una plataforma prometedora para los investigadores en la resolución de estructuras cardíacas en corazones de roedores, con un gran potencial para la comprensión de la morfogénesis y la remodelación cardíaca.

Se ha demostrado que la LSM fomenta los estudios cardíacos 31,32,33,34,35,36,37 debido al riesgo mínimo de daño fotográfico, alta resolución espacial y seccionamiento óptico en comparación con otros métodos de imagen óptica como las técnicas de campo claro y escaneo puntual 6,8,38,39,40 . Por lo tanto, para comprender mejor la arquitectura miocárdica 3D, hemos establecido el protocolo basado en enfoques primarios que incluyen el aclarado iDISCO adaptado, la unión de imágenes, la deconvolución multivista y ASLM. Si bien presentamos los resultados utilizando modelos de ratones, es importante tener en cuenta que los modelos de ratas y otros roedores también son adecuados para los métodos propuestos. El protocolo de limpieza de tejidos adaptado permite hacer transparente el corazón de ratón P1 en 4 días y el corazón de ratón de 8 semanas de edad en 7 días (Figura 1B). Este paso sirve como punto de partida para minimizar la absorción y dispersión de fotones en el corazón intacto. La deconvolución multivista permite mejorar la resolución axial mediante la fusión de imágenes de múltiples perspectivas en un solo modelo. Después de registrar secuencialmente imágenes de 6 vistas del mismo corazón, el método de deconvolución multivista logra una resolución casi isotrópica con un lateral de 4,68 μm y un axial de 5,06 μm, después de 15 h de cálculo (Figura 8A). Para obviar la complejidad computacional, personalizamos aún más un ASLM basado en ETL para obtener imágenes de corazones de ratones neonatos a adultos. Este método nos permite escanear el miocardio con un rayo láser muy enfocado, minimizando el fondo desenfocado y mejorando el contraste de la imagen en comparación con los métodos convencionales de LSM (Figura 8B). Con el diseño actual de ASLM, las resoluciones lateral y axial promediadas del sistema alcanzan 2,18 μm y 2,88 μm, respectivamente, lo que permite una exploración en profundidad de la trabeculación miocárdica en los ventrículos. Además, la unión de imágenes se puede utilizar de forma independiente o en combinación con la deconvolución multivista o ASLM para expandir el campo de visión para tamaños de muestra más grandes. La integración de la sutura con ASLM nos permite cubrir todo el corazón del ratón de 8 semanas con una resolución uniforme (Figura 8C), proporcionando una solución eficaz para investigar la sección transversal de todo el corazón.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig01.jpg"> Figura 1: Proceso de limpieza de tejidos. (A) El método hidrofóbico implica la deshidratación de tejidos, la extracción de lípidos y la coincidencia del índice de refracción utilizando éter dibencilo (DBE) como solvente orgánico. (B) Sumerja el corazón en una mezcla de solución de formaldehído (PFA) al 4% y deshidrételo con un gradiente de mezclas de metanol y agua desionizada (DI). Blanquear el corazón con 5% H2O2 en metanol a 4 °C. Delipidar el corazón con diclorometano (DCM) y solución de metanol hasta que la muestra se hunda hasta el fondo del tubo. Por último, incubar el corazón en DBE para obtener el índice de refracción deseado. Líneas de cuadrícula de 5 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig02.jpg"> Figura 2: Esquema de la microscopía de lámina de luz de barrido axial. (A) Cámara impresa en 3D personalizada, (B) imán de cámara, (C) soporte de abrazadera y (D) sistema ASLM. Abreviaturas: CL: lente cilíndrica; ETL: lente electrónica sintonizable; IL: lente de iluminación; DL: lente de detección; FW: rueda de filtros; TL: lente de tubo. Esta figura ha sido modificada de la Ref16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig03.jpg"> Figura 3: Costura de imágenes y deconvolución multivista. (A-B) La unión de imágenes se utiliza para cubrir todos los corazones del ratón, y cada mosaico tiene una superposición de FOV del 10% con sus mosaicos adyacentes. (C) Patrón de movimiento del corazón del ratón para la unión de imágenes. (D) Las perlas fluorescentes se fijan al extremo del tubo de vidrio para facilitar el registro de la imagen, mientras que el corazón se coloca dentro del tubo de vidrio que contiene DBE, lo que permite obtener imágenes simultáneas tanto del corazón del ratón como de las perlas fluorescentes. (E) La deconvolución multivista implica la adquisición de imágenes desde seis perspectivas distintas, cada una de las cuales reúne imágenes desde direcciones únicas. (F) Datos sin procesar del corazón de ratón P1 y las cuentas en diferentes ángulos de 0 °, 60 °, 120 °, 180 °, 240 ° y 300 °. Barras de escala: 500 μm. Esta cifra ha sido modificada de16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig04.jpg"> Figura 4: Diagrama de bloques del sistema ASLM. Utilizando la tarjeta DAQ para sincronizar la cámara ETL y sCMOS. La carcasa del controlador ETL se ha abierto para soldar los cables de señal y tierra a la PCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig05.jpg"> Figura 5: Panel de control de LabView. Panel de control de LabVIEW para generar disparadores para sincronizar ETL y píxeles activados de la cámara sCMOS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig06.jpg"> Figura 6: Sincronización del foco de la hoja de luz con los píxeles activados. (A) La identificación de los puntos de inicio y finalización del rango de escaneo de la hoja de luz se logra configurando el voltaje apropiado para el disparador ETL. (B) El resultado sincrónico de las perlas fluorescentes es evidente a lo largo de la diagonal de la imagen. (C-F) La resolución espacial no uniforme en todo el campo de visión surge del funcionamiento asíncrono del ETL con la cámara sCMOS. El ETL inicia el escaneo (C) más tarde o (D) antes que el píxel activado. (E-F) El área focal no es paralela a la diagonal de la imagen, lo que indica una incompatibilidad entre las velocidades de escaneo y activación. ETL escanea (E) más rápido o (F) más lento que el barrido de píxeles activos en sCMOS. Barra de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig07.jpg"> Figura 7: Resolución de problemas de ASLM. (A) La lámina de luz se coloca exactamente a la distancia focal de la lente de detección. El ETL escanea el foco de la lámina de luz a lo largo de la dirección de propagación mientras se sincroniza con el píxel activado del sensor sCMOS. (B) Vista XY de perlas fluorescentes cuando el ETL está correctamente alineado y sincronizado. (C-D) Resultados de perlas fluorescentes en el plano focal y desenfocadas en imágenes transversales, lo que indica la desalineación entre el escaneo ETL y la propagación del láser. Barras de escala: 200 μm y 10 μm en el recuadro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig08.jpg"> Figura 8: Imagen en hoja de luz de corazones de ratón. (A) Imagen renderizada en volumen del corazón de ratón P1 con deconvolución multivista que destaca la trabeculación dentro de la cavidad ventricular. (B) Imágenes transversales del corazón de un ratón de 8 semanas de edad generadas por LSM convencional (izquierda) y ASLM (derecha). Las imágenes se presentan como datos sin procesar. (C) Combinación de costura de imagen y ASLM para obtener imágenes de un corazón de ratón de 8 semanas de edad, compuesto por 12 mosaicos dispuestos en 3 mosaicos horizontalmente y 4 mosaicos verticalmente. Barra de escala: 500 μm. Abreviaturas: VI: ventrículo izquierdo, LA: aurícula izquierda, VD: ventrículo derecho y AR: aurícula derecha. Esta figura ha sido modificada de la Ref16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Procedimiento</td>
			<td>Tiempo (corazón de ratón P1)</td>
			<td>Time (corazón de ratón de 8 semanas)</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Fijación en 4% PFA</td>
			<td>Toda la noche</td>
			<td>Toda la noche</td>
			<td>4°C</td>
			<td rowspan="5">Preparación de la muestra</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Lavar con 1x PBS</td>
			<td>30 minutos</td>
			<td>30 minutos</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Lavar con 1x PBS</td>
			<td>30 minutos</td>
			<td>30 minutos</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Lavar con 1x PBS</td>
			<td>30 minutos</td>
			<td>30 minutos</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incrustar con gel de agarosa</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incubar en 20% de metanol/80% de agua desionizada</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
			<td rowspan="6">Deshidratación</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incubar en 40% de metanol/60% de agua desionizada</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incubar en 60% de metanol/40% de agua desionizada</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incubar en 80% de metanol/20% de agua desionizada</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incubar en metanol 100%</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incubar en metanol fresco 100%</td>
			<td>1 h</td>
			<td>2 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incubar en metanol fresco 100%</td>
			<td>10 minutos</td>
			<td>10 minutos</td>
			<td>4°C</td>
			<td rowspan="3">Despigmentación</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Lejía con 5% H2O2/metanol</td>
			<td>Toda la noche</td>
			<td>Toda la noche</td>
			<td>4°C</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incubar en metanol 100%</td>
			<td>1 h</td>
			<td>1 h</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Delipidato con 66% DCM/33% metanol en el agitador</td>
			<td>3 h</td>
			<td>3 h</td>
			<td>RT</td>
			<td>Delipemiación</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incubar en DBE en el agitador</td>
			<td>2 días</td>
			<td>5 días</td>
			<td>RT</td>
			<td>Coincidencia de instancias reservadas</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Pasos de limpieza de tejidos personalizados para imágenes de autofluorescencia.

El protocolo utiliza microscopía avanzada de lámina de luz junto con métodos de limpieza de tejidos adaptados para investigar estructuras cardíacas intrincadas en corazones de roedores, con un gran potencial para la comprensión de la morfogénesis y la remodelación cardíaca.

Imágenes con lámina de luz para revelar la estructura cardíaca en corazones de roedores

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

Nuestra investigación tiene como objetivo personalizar un sistema de imágenes de lámina de luz para investigar las estructuras miocárdicas del corazón intacto de un roedor a nivel celular. Hemos desarrollado un flujo de trabajo para explorar el miocardio intacto con resolución isotrópica a nivel de micras desde el corazón de roedores neonatos hasta adultos. Nuestro estudio llena un vacío en la investigación de las intrincadas microestructuras miocárdicas, como la trabeculación, dentro de los ventrículos intactos, con alta resolución espacial.Esta estrategia de imagen proporciona un punto de entrada para evaluar la microestructura sin corte físico, lo que conduce a una mejor comprensión del desarrollo y la remodelación cardíaca. Nos concentraremos en explorar los cambios estructurales del miocardio en respuesta a la lesión cardíaca y la remodelación.

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Investigación

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