Name: Transfección de un clon molecular de ADNr de Naegleria gruberi en trofozoítos de N. gruberi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Aprende el protocolo de transfección estable de elementos CERE en trofozoítos de Naegleria gruberi mediante PCR. Este método permite mantener el ADN transfectado durante múltiples pasajes in vitro y ciclos de enquistamiento.

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Estos estudios fueron parcialmente financiados por una subvención del Fondo George F. Haddix de la Universidad de Creighton (KMD). La figura 1 se genera en biorender.com y la figura 3 se genera en benchling.com.

Los detalles de las especies, reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. La secuencia de la construcción pGRUB de 17.004 pares de bases se proporciona en el Archivo Suplementario 1.
1. Cultivo de trofozoítos
<ol><li>Descongele los trofozoítos congelados de N. gruberi a 37 °C durante 3 min.</li>
	<li>Inocular trofozoítos en matraces T25 en peptona/extracto de levadura/ácido nucleico/ácido fólico/hemina modificados con un 10% de medios de suero fetal de ternero (PYNFH) más un 2% de tampón (fosfato disódico, fosfato de dihidrógeno potásico).</li>
	<li>Cultivar los trofozoítos a 25 °C hasta ~80% confluentes, donde exhiben una morfología ameboide (Figura 2A). NOTA: Cuando se revive inicialmente un cultivo de trofozoítos de su estado congelado, un T25 puede tardar hasta 5-7 días en confluente. Decantar los medios cada 3-4 días y reemplazarlos con medios nuevos.</li>
	<li>Coloque los matraces confluentes en hielo durante 5-10 minutos para liberar los trofozoítos adheridos del plástico. Agite suavemente el matraz para desalojar las células adherentes restantes. Los trofozoítos ahora tienen una morfología "redondeada" (Figura 2B).</li>
	<li>Divida los cultivos 1:2 a 1:4 en nuevos matraces de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Retire el PYNFH y reemplácelo con medios de enquistamiento estériles (cloruro de sodio 120 mM, cloruro de magnesio 0,03 mM, fosfato disódico 1 mM, fosfato dihidrógeno de potasio 1 mM, cloruro de calcio 0,03 mM, cloruro de hierro 0,02 m, pH 6,8)22 para enquistar el N. gruberi. NOTA: La mayoría de los trofozoítos se enquistan a las 72 h (Figura 2C). La extracción debe completarse dentro de las 72 h.</li>
	<li>Extraer los quistes de los matraces, centrifugar a 600 x g durante 10 min a 20 °C y resuspender los quistes en medios PYNFH con un 10% de suero fetal de ternero para excyster las células. Incubar a 25 °C durante 24 h hasta que comiencen a emerger los trofozoítos.</li>
</ol>2. Transfección de trofozoítos
<ol><li>Colocar los trofozoítos en una placa de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos (1 mL de 1 x 106 trofozoítos/mL) y cultivar a 25 °C.</li>
	<li>Transfecte las células cuando alcancen el 70%-80% de confluentes (~10,4 x 104 células/cm2 en grupos de 6 pocillos). Caliente el reactivo de transfección a temperatura ambiente antes de usarlo.</li>
	<li>Prepare la mezcla de reactivo de transfección y plásmido de la siguiente manera: 75 ng de ADN plasmídico y 0,225 μL del reactivo de transfección en 200 μL de medio PYNFH sin FBS. Prepare suficiente mezcla de reactivo de transfección de plásmidos para realizar la transfección por duplicado. NOTA: En este estudio se utilizó un plásmido bacteriano que contiene un clon completo de N. gruberi CERE (pGRUB). Se utilizó plásmido vacío (pGEM) como control negativo (Figura 3).</li>
	<li>Incubar la mezcla de reactivo de transfección de plásmidos a temperatura ambiente durante 10 min.</li>
	<li>Retire ~ 800 μL de medio de las monocapas de trofozoíto justo antes de la transfección.</li>
	<li>Coloque la mezcla de reactivo de transfección de plásmidos sobre los trofozoítos.</li>
	<li>Gire suavemente la placa cada 15 minutos para evitar que los medios se agreguen en los bordes de la placa.</li>
	<li>Lavar las monocapas una vez con 2 mL de medio de crecimiento después de 1 h de incubación a 25 °C.</li>
	<li>Trate las monocapas con 10 U de DNasa en 1 mL de tampón de DNasa 10x durante 15 min a 37 °C para eliminar el ADN plasmídico residual, lave una vez con medio de crecimiento, agregue 2 mL de medio fresco y colóquelo a 25 °C. Incubar la placa durante 24-36 h.</li>
	<li>Coloque el plato sobre hielo durante 10 minutos para liberar las células.</li>
	<li>Divida un pozo (1:2) en dos pozos nuevos.</li>
	<li>Recoja trofozoítos de los pozos restantes con fines experimentales. NOTA: Todos los cultivos se realizan por duplicado. Para cada condición, se usa 1 pozo para el paso y 1 para el aislamiento CERE.</li>
</ol>3. Aislar a CERE de Naegleria
<ol><li>Calcular el número de trofozoítos en cada pocillo utilizados para el aislamiento de CERE mediante tinción de exclusión con azul de tripano y un hemocitómetro23.</li>
	<li>Coloque los trofozoítos en un tubo de 2.0 mL.</li>
	<li>Lavar los trofozoítos una vez en 100 mM de cloruro de sodio (pH 7,5) mediante centrifugación (600 x g, 10 min, 4 °C). NOTA: El cloruro de sodio evita que los trofozoítos se adhieran a los lados del tubo.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante y resuspender los gránulos celulares en 100 μL de 100 mM de EDTA (pH 7,5).</li>
	<li>Coloque el tubo en un bloque de calor durante 15 minutos a 98 °C para lisar las células e inactivar las enzimas de los trofozoítos. NOTA: Este paso inactiva las DNasas, que son abundantes en los trofozoítos de Naegleria . Las DNasas pueden interferir con la capacidad de detectar CERE nativo y el clon molecular en el paso 4. El rendimiento de ADN disminuye cuando se utilizan más de ~ 3 x 106 células en el paso 3.4.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a máxima velocidad (16.000 x g) a 4 °C durante 10 min para pellet los residuos.</li>
	<li>Transfiera los sobrenadantes a un tubo nuevo.</li>
	<li>El etanol precipita los sobrenadantes con 0,5 volúmenes de acetato de amonio 7,5 M (pH 7,5), 3 volúmenes de etanol absoluto y 1 μL de 10 mg/mL de glucógeno como portador.</li>
	<li>Invierta el tubo varias veces y colóquelo a -80 °C durante al menos 1 h o toda la noche.</li>
	<li>Caliente las muestras a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a temperatura ambiente durante 10 min a 16.000 x g.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol al 70% por centrifugación durante 5 min a 16.000 x g (a temperatura ambiente).</li>
	<li>Retire el etanol y seque al aire el pellet durante 5 min.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet seco en agua desionizada estéril (DI). Normalizar el volumen a 10.000 trofozoítos por μL.</li>
	<li>Almacenar a -80 °C hasta su uso en PCR.</li>
</ol>4. Detección por PCR de trofozoítos transformados
<ol><li>Utilice 20.000 equivalentes celulares de ADN, cebadores de 600 nM (Tabla 1) y polimerasa Taq y realice la PCR24. NOTA: En la Tabla 1 se enumeran los cebadores que distinguen entre el CERE nativo y el CERE clonado, al igual que las condiciones de PCR. La Figura 3 muestra la ubicación de los cebadores en los constructos. La PCR requerirá optimización en función de los cebadores utilizados, así como de la mezcla específica de PCR utilizada.</li>
	<li>Cocine en el microondas agarosa al 0,8% en 1x base Tris, ácido acético y tampón EDTA (TAE) hasta que la agarosa se disuelva.</li>
	<li>Enfriar la agarosa a ~50 °C a temperatura ambiente.</li>
	<li>Vierta la solución en una bandeja de fundición de gel que contenga un peine para formar pocillos.</li>
	<li>Deje reposar el gel a temperatura ambiente hasta que se solidifique.</li>
	<li>Coloque el gel en el aparato de electroforesis.</li>
	<li>Decantar 1x TAE en la cámara de electroforesis hasta que el gel esté cubierto.</li>
	<li>Retira el peine.</li>
	<li>Añada 6 colorantes de carga (0,25 % azul de bromfenol, 0,25 % xileno cianol, 30 % glicerol) a las muestras y cargue el gel. Utilice una escalera de ADN para determinar el tamaño del producto de PCR.</li>
	<li>Conecte el electrodo, encienda la fuente de alimentación y haga funcionar el gel a 80 V durante ~ 1,5-2 h.</li>
	<li>Apague la alimentación y retire el gel.</li>
	<li>Tiñir el gel con colorante de ADN (por ejemplo, 10 μL de 10 mg/mL de bromuro de etidio) en 100 mL de agua desionizada durante 10 min.</li>
	<li>Quita el gel durante 20 minutos en agua desionizada.</li>
	<li>Visualice el gel en un sistema de luz ultravioleta (UV) y documente los resultados.</li>
</ol>

Uso de un vector basado en CERE para la transfección de trofozoítos de Naegleria gruberi

<ol><li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+we+know+by+now+about+the+genus+Naegleria%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">What do we know by now about the genus Naegleria.</a> Exp Parasitol. 145, Suppl S2-S9 (2014).</li>
<li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+research+on+the+Amoeboflagellate+genus+Naegleria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Protozool%22%5BJournal%5D)">A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria.</a> Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).</li>
<li>Fulton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+in+Naegleria+gruberi%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation in Naegleria gruberi.</a> Annu Rev Microbiol. 31, 597-629 (1977).</li>
<li>Grace, E., Asbill, S., Virga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naegleria+fowleri%3A+Pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22AAC%22%5BJournal%5D)">Naegleria fowleri: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options.</a> AAC. 59 (11), 6677-6681 (2015).</li>
<li>Moseman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Battling+brain-eating+amoeba%3A+enigmas+surrounding+immunity+to+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Battling brain-eating amoeba: enigmas surrounding immunity to Naegleria fowleri.</a> PLOS Pathog. 16 (4), e1008406(2020).</li>
<li>Marciano-Cabral, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Naegleria+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of Naegleria spp.</a> Microbiol Rev. 52 (1), 114-133 (1988).</li>
<li>Piñero, J. E., Omaña-Molina, M., Chávez-Munguía, B., Lorenzo-Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Naegleria fowleri.</a> Trends Parasitol. 35 (10), 848-849 (2019).</li>
<li>Zysset-Burri, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+pathogenicity+factors+of+the+free-living+amoeba+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of pathogenicity factors of the free-living amoeba Naegleria fowleri.</a> BMC Genomics. 15, 496-510 (2014).</li>
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<li>Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+sequencing+improves+the+draft+genome+of+the+human+pathogenic+amoeba+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanopore sequencing improves the draft genome of the human pathogenic amoeba Naegleria fowleri.</a> Sci Reports. 9, 16040-16049 (2019).</li>
<li>Fritz-Laylin, L. K., Ginger, M. L., Walsh, C., Dawson, S. C., Fulton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Naegleria+genome%3A+A+free-living+microbial+eukaryote+lends+unique+insights+into+core+eukaryotic+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Naegleria genome: A free-living microbial eukaryote lends unique insights into core eukaryotic cell biology.</a> Res Microbiol. 162, 607-618 (2011).</li>
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<li>Mullican, J. C., Drescher, K. M., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+Naegleria+fowleri+%28strain+LEE%29+closed+circular+extrachromosomal+ribosomal+DNA+element%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the Naegleria fowleri (strain LEE) closed circular extrachromosomal ribosomal DNA element.</a> Microbiol Resource Announce. 9 (49), e01055(2020).</li>
<li>Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Tracy, S., Drescher, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extrachromosomal+elements+of+the+Naegleria+amoebae%3A+How+little+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The extrachromosomal elements of the Naegleria amoebae: How little we know.</a> Plasmid. 115, 102567(2021).</li>
<li>Nguyen, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+%28CERE%29+of+Naegleria+australiensis+De+Jonckheere+%28strain+PP+397%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria australiensis De Jonckheere (strain PP 397).</a> Microbiol Resource Announce. 12, e0032123(2023).</li>
<li>Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Stessman, H. A. F., Tracy, S., Drescher, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+of+Naegleria+jadini+Willaert+and+Ray+%28Strain+ITMAP400%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element of Naegleria jadini Willaert and Ray (Strain ITMAP400).</a> Microbiol Resource Announce. 12 (4), 0006123(2023).</li>
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</ol>

No se declararon conflictos de interés financiero.

El protocolo descrito en este documento es muy sencillo, aunque es probable que cada constructo requiera algún grado de optimización, en particular de la proporción de reactivos de transfección y ADN, dependiendo de la naturaleza del constructo y de la especie de Naegleria utilizada. Solo hemos probado un reactivo de transfección disponible comercialmente utilizando este protocolo, pero es probable que varios otros puedan ser efectivos. Dado que se utiliza un clon de longitud completa del CERE, que contiene un origen funcional de replicación y, por lo tanto, se replica de forma autónoma, la construcción posee toda la maquinaria de replicación eucariota necesaria. Si se insertara un clon parcial en el vector pGEM, se predeciría que el clon transfectado se perdería muy pronto después de la transfección si no contiene un origen eucariota funcional de replicación, similar al vector pGEM vacío (Figura 2B). Además, estos datos demuestran que la presencia de ADN procariota no interfiere con la capacidad del clon molecular para ser retenido por el trofozoíto.
Si bien se ha reportado un caso de transfección de trofozoítos de N. gruberi 25, el inserto utilizado en el presente estudio es considerablemente más grande (~17 kbp) que lo que se transfectó en el estudio anterior (<1 kbp). Si bien se desconoce cuál es el tamaño máximo de plásmido que puede tolerar la Naegleria, datos no publicados de nuestro laboratorio han determinado que las amebas de otro género (Willaertia) contienen CERE de aproximadamente 24 kbp de tamaño.
Un paso clave para garantizar que este protocolo detecte el ADN dentro del trofozoito es el paso de tratamiento con DNasa (paso 2.9), que garantiza que el ADN residual (es decir, el ADN que no ha sido transfectado) se elimine de los cultivos. Se realizaron un par de procedimientos de control de calidad para garantizar la integridad del protocolo. En primer lugar, se secuenciaron los constructos. En segundo lugar, también se secuenciaron los productos de PCR para confirmar su identidad y garantizar que no hubiera contaminación del ensayo, así como para confirmar que los productos de PCR no eran el resultado de un cebado erróneo.
Si bien se demostró la transfección exitosa de un plásmido con un origen eucariota de replicación, está claro en la Figura 4 que hay una disminución de la señal de PCR después del primer paso de los trofozoítos. Se realizó una qPCR en los trofozoítos transfectados a lo largo del tiempo, y se determinó que el nivel de pGRUB cae de aproximadamente 1.600 copias en el pasaje 1 a 35 en el pasaje 7 (datos no mostrados), lo que indica que el plásmido transfectado probablemente se perderá en los próximos pasajes. Esto no es inesperado, ya que el plásmido transfectado es extraño a los trofozoítos y se consideraría innecesario o perjudicial para la supervivencia de la ameba.
Hay un desconocimiento fundamental sobre el CERE de la Naegleria. La mayoría de las secuencias de CERE en GenBank son secuencias parciales, con el enfoque principal en el ADNr y las regiones espaciadoras transcritas internas (ITS), que se utilizan para identificar géneros (ITS1) y especies (ITS2)1,26,27. Mientras que la secuencia de las subunidades del ADNr está altamente conservada entre Naegleria sp., el NRS de Naegleria sp. varía mucho, tanto en tamaño como en secuencia, desde aproximadamente 5,5 kbp hasta 10 kbp 1,15,16,17,18,19,20. La función de la NRS en Naegleria es en gran medida un territorio inexplorado, pero se presume que contiene elementos reguladores que incluyen, entre otros, un origen de replicación, un promotor y una secuencia de terminación17. Sobre la base de las secuencias completas de CERE en GenBank, una característica común de Naegleria CERE es la presencia de regiones repetidas en el NRS que son ricas en A-T. Actualmente se desconoce la función de estas regiones.
La capacidad de transfectar trofozoítos de Naegleria permite el estudio de varios aspectos de la biología de CERE NRS, en particular la dinámica y los requisitos de la replicación de CERE. En Escherichia coli, se han identificado G-cuádruples en las regiones promotoras de algunos genes28. También se han identificado estructuras G-cuádruples en los promotores de una amplia variedad de eucariotas, incluyendo ratones, ratas, humanos y primates no humanos29. El análisis in silico de varias secuencias CERE de longitud completa diferentes demuestra que se predice que múltiples áreas del NRS forman estructuras G-cuádruples. Un área de estructuras cuádruples G predichas en el NRS de varias Naegleria sp. es anterior al comienzo del gen 18S. La capacidad de transfectar trofozoítos permitiría explorar la identificación de la región promotora del ADNr en el CERE de Naegleria mediante la eliminación/mutación de secuencias aguas arriba del ADNr. Del mismo modo, se podrían realizar estudios similares para identificar secuencias que finalicen la transcripción del ADNr.
La retención de la longitud completa de la CERE en los trofozoítos durante una serie de pasajes permitirá estudios que se centren en la identificación del área mínima del NRS necesaria para la replicación de la CERE. Si bien se ha identificado una región del CERE como el origen putativo de la replicación20, se desconoce si se requieren estructuras secundarias fuera de la región para la replicación del CERE o si la región podría truncarse significativamente y los ori siguen siendo funcionales. Los elementos repetitivos en el NRS se encuentran en todas las especies de Naegleria secuenciadas hasta la fecha 15,16,17,18,19,20. Actualmente se desconoce el propósito de estas secuencias. Todavía se desconoce si existen como elemento regulador, o si se eliminan, si el CERE se replicará en los trofozoítos. Las secuencias repetitivas son específicas de cada especie en Naegleria, pero no se sabe si las secuencias de una especie pueden funcionar en otra. En resumen, hay una miríada de preguntas sobre la biología de CERE que ahora pueden abordarse utilizando la técnica aquí descrita.

El género Naegleria contiene más de 45 especies, aunque es poco probable que todos los miembros de la especie hayan sido identificados1. Naegleria puede existir en diferentes formas: como trofozoítos (amebas), como flagelados o, cuando los recursos son muy limitados, como quistes 1,2,3,4. El género Naegleria es reconocido por su especie particularmente peligrosa, Naegleria fowleri, conocida como "la ameba comecerebros" (revisado en 1,2,3,4,5,6,7), que es la causa de la meningoencefalitis amebiana primaria casi universalmente fatal.
Naegleria codifica su ADNr en el CERE ubicado en el nucléolo. La secuenciación completa de los genomas de tres especies de Naegleria confirma la ausencia de ADNr en el genoma nuclear 8,9,10,11. Sobre la base de las secuencias limitadas de CERE de longitud completa, el CERE oscila entre aproximadamente 10 kbp y 18 kbp de longitud. Los CERE de cada especie de Naegleria llevan un solo cistrón de ADNr (que contiene el ADN ribosómico 5.8, 18 y 28S) en cada uno de aproximadamente 4,000 CERE por célula 12,13,14. Aparte del ADNr, cada CERE tiene una gran secuencia no ADNr (NRS). Los tamaños de los CERE varían de una especie a otra; las diferencias se deben principalmente a la variación de la longitud del NRS, ya que las secuencias de ADNr están muy conservadas en el género 1,15,16,17,18,19,20. El mapeo de un único origen de replicación del ADN dentro de N. gruberi CERE NRS21 proporciona un fuerte apoyo a la hipótesis de que Naegleria CERE se replica independientemente del genoma nuclear.
N. gruberi es una ameba no patógena que se utiliza a menudo para estudiar la biología de Naegleria . Desarrollamos una metodología para transformar trofozoítos de N. gruberi con un clon de CERE de la misma especie para probar la hipótesis de que las amebas de Naegleria toleran y replican de forma independiente CERE dentro de los trofozoítos. Esto se logró transformando N. gruberi con un clon completo de N. gruberi CERE en trofozoítos y siguiendo el destino del clon CERE donante mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la Figura 1 se describe una descripción general del protocolo. Los datos presentados en este documento demuestran que el clon del donante puede detectarse a través de al menos siete pasajes en cultivo de tejidos, así como mantenerse mediante enquistamiento y excystment. Estos estudios forman la base de un medio para diseccionar cómo se replica CERE, así como explorar su uso como vector para transfectar Naegleria.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Bio Rad</td><td>161-3102</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7330</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultivo de</td><td></td> hielo <td></td> picado, T-75 Thermo Scientific 130190 <td></td></tr><tr><td></td> Placa de cultivo, 6 pocillos Corning 3506 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-4527</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 m</td><td>Affymetrix</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de gel de electroféresis</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6052-45</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 100%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de Etidio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-8751</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Fólico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876-25G</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Escalera</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green PCR Master Mix Promega</td><td></td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor</td><td>Thermo Scientific</td><td>88871001</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de hierro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>372870-256</td><td></td></tr><tr><td>Ligasa</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magneisum</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge Microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>MySpin 12</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td></td></tr><<tr><td>em>N. gruberi</td><td>ATCC</td><td>30224</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nucleico</td><td>Chem Impex Int' l</td><td>#01625</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>pGEM</td><td>Promega</td><td>P2251</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Unidad de fuente de alimentación de electroforesis</td><td>Bio Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>MCB Reactivos</td><td>SX0420</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio, dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Tris, base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ViaFect Reactivo</td><td>Promega</td><td>E4981</td><td></td></tr><tr><td>Báscula de pesaje</td><td>Denver Instruments</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

transfección de un clon molecular de adnr de naegleria gruberi en trofozoítos de n. gruberi

Transfection of a Molecular Clone of Naegleria gruberi rDNA into N. gruberi Trophozoites

Todos los genes ribosómicos de los trofozoítos de Naegleria se mantienen en un elemento que contiene ADN ribosómico (ADNr) circular cerrado (ADNr) (CERE). Si bien se sabe poco sobre el CERE, un análisis completo de la secuencia del genoma de tres especies de Naegleria demuestra claramente que no hay cistrones de ADNr en el genoma nuclear. Además, se ha mapeado un único origen de replicación del ADN en el CERE de N. gruberi , lo que apoya la hipótesis de que el CERE se replica independientemente del genoma nuclear. Esta característica de CERE sugiere que puede ser posible utilizar CERE modificado para introducir proteínas extrañas en los trofozoítos de Naegleria . Como primer paso para explorar el uso de un CERE como vector en Naegleria, desarrollamos un protocolo para transfectar N. gruberi con un clon molecular del CERE de N. gruberi clonado en pGEM7zf+ (pGRUB). Después de la transfección, se detectó fácilmente pGRUB en trofozoítos de N. gruberi en al menos siete pasajes, así como a través de enquistamiento y excitación. Como control, los trofozoítos se transfectaron con el vector troncal, pGEM7zf+, sin las secuencias de N. gruberi (pGEM). La pGEM no se detectó después del primer paso después de la transfección en N. gruberi, lo que indica su incapacidad para replicarse en un organismo eucariota. Estos estudios describen un protocolo de transfección para los trofozoítos de Naegleria y demuestran que la secuencia de plásmidos bacterianos en pGRUB no inhibe la transfección y replicación exitosas del clon CERE transfectado. Además, este protocolo de transfección será fundamental para comprender la secuencia mínima del CERE que impulsa su replicación en trofozoítos, así como para identificar regiones reguladoras en la secuencia no ribosómica (NRS).

La PCR de los trofozoítos que han sido transfectados con pGRUB demuestra que el CERE transfectado se detecta a través de al menos siete pasajes de los trofozoítos, así como el enquistamiento y la excitación (Figura 4). Los cebadores utilizados en la PCR recocen tanto al vector pGEM como a la secuencia CERE, lo que garantiza que la PCR no detecte CERE nativo. La PCR tras la transfección de pGEM en trofozoítos indicó que el pGEM fue negativo (Figura 4), lo que indica que el plásmido vacío no fue retenido por las amebas. La Figura 4 demuestra que pGEM se perdió en el primer pasaje: los pasajes subsiguientes, el enquistamiento y la excitación fueron todos negativos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig01v3.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo del procedimiento de transfección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig02.jpg"> Figura 2: Trofozoítos de N. gruberi (cepa NEG-M) en cultivo. (A) En condiciones estándar de cultivo a 25 °C, los trofozoítos de N. gruberi son de morfología ameboide y adherentes a los matraces/placas de cultivo. La flecha indica un pseudópodo que se utiliza para propulsar el trofozoito direccionalmente. (B) Después de la incubación del cultivo de N. gruberi en hielo, los trofozoítos se vuelven redondos en morfología y no adherentes. (C) Después de la incubación en medios de enquistamiento durante 24-48 h, los trofozoítos de N. gruberi se enquistan. Barras de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig03.jpg"> Figura 3: Construcción de pGRUB utilizada para transfectar N. gruberi (NEG-M). El CERE de longitud completa de N. gruberi (cepa EBM, 14.007 pb; rojo) se clonó en pGEM7Zf(+) (2.997 pb; verde), lo que resultó en una construcción de 17.004 pb. Las flechas en cada plásmido indican la ubicación de los cebadores de PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig04.jpg"> Figura 4: Resultados de la PCR que detectan pGRUB y pGEM transfectados en trofozoítos de N. gruberi . La PCR demuestra que el pGRUB se detecta en trofozoítos transfectados a través de al menos siete pasajes, enquistamiento (En) y excystment (Ex). El pGEM se pierde después del primer paso de los trofozoítos. P1 = pasaje 1, P7 = pasaje 7. Los controles negativos (neg) no recibieron ADN en la PCR, mientras que los controles positivos (pos) son pGRUB o pGEM de entrada en la PCR. Los tamaños de producto esperados son 656 pb (pGRUB) y 337 pb (pGEM). Las figuras a la izquierda del panel A indican el tamaño de las bandas más brillantes de la escalera del ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre del cebador</td>
			<td colspan="2">Secuencia - 5'-&gt;3'</td>
			<td>Tm</td>
			<td>Tamaño del producto</td>
		</tr><tr><td>pGEM-adelante</td>
			<td colspan="2">CTCTTCGCTATTACGCCAGC</td>
			<td>54</td>
			<td>337 pb</td>
		</tr><tr><td>pGEM-reverso</td>
			<td colspan="2">TTGTGTGGAATTGTGAGCGG</td>
			<td></td>
			<td>337 pb</td>
		</tr><tr><td>pGRUB-adelante</td>
			<td colspan="2">AGCCCCCGATTTAGAGCTTG</td>
			<td>60.5</td>
			<td>656 pb</td>
		</tr><tr><td>pGRUB-reverso</td>
			<td colspan="2">TCGGCTAGAAATGAAGTGAGGAC</td>
			<td></td>
			<td>656 pb</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Cebadores de PCR y condiciones utilizadas en estos estudios.
Archivo suplementario 1: La secuencia de la construcción pGRUB de 17.004 pares de bases. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo describe una metodología para transfectar trofozoítos de Naegleria gruberi con un constructo que se mantiene a lo largo del paso de trofozoítos in vitro, así como a través del enquistamiento y la excystación.

Transfección de un clon molecular de ADNr de Naegleria gruberi en trofozoítos de N. gruberi

All ribosomal genes of Naegleria trophozoites are maintained in a closed circular extrachromosomal ribosomal DNA (rDNA) containing element (CERE). While ...

transfection-molecular-clone-naegleria-gruberi-rdna-into-n-gruberi

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

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Transfección de un clon molecular de ADNr de Naegleria gruberi en trofozoítos de N. gruberi

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