Name: Cocultivo de sistemas in vitro para reproducir el ciclo cáncer-inmunidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprende a reproducir el ciclo cáncer-inmunidad mediante cocultivos in vitro con citometría de flujo multiparamétrica y modelos tumor-on-a-chip. Este protocolo permite monitorear interacciones entre células cancerosas e inmunitarias de forma simple y confiable.

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A.S. está soportado por AIRC (IG #28807) y por PRIN (#P2022YE2MX). M.M. cuenta con el apoyo de la beca AIRC-FIRC (#25558). A.D.N. cuenta con el apoyo del Ecosistema de Innovación Rome Technopole ECS00000024 financiado por la UE - Next Generation EU, PNRR Mission 4 Component 2 Investment 1.5.

Monitorización del ciclo oncológico-inmunitario basada en citometría de flujo 

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer-immunity+cycle%3A+Indication%2C+genotype%2C+and+immunotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.</a> Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).</li>
<li>Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+privilege+of+cancer+stem+cells%3A+A+key+to+understanding+tumor+immune+escape+and+therapy+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure.</a> Cells. 10 (9), 2361(2021).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+Es+of+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The three Es of cancer immunoediting.</a> Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).</li>
<li>Musella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+promote+cancer+cell+stemness+by+triggering+the+epigenetic+regulator+KDM1B%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B.</a> Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+immune+resistance+archetypes+in+solid+cancer+to+inform+next-generation+anticancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies.</a> J Immunother Cancer. 11 (6), e006533(2023).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+cancer+cell+immunogenicity+and+antigen-specific+T-cell+cytotoxicity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Front Mol Biosci. 7, 612801(2020).</li>
<li>Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+automated+cytometry+in+the+new+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy.</a> Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).</li>
<li>Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+of+cytometry+practices+for+immuno-oncology%3A+A+multifaceted+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge.</a> Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).</li>
<li>Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cancer+models%3A+One+step+closer+to+in+vitro+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D cancer models: One step closer to in vitro human studies.</a> Front Immunol. 14, 1175503(2023).</li>
<li>De Ninno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+models+for+dissecting+the+immune+response+in+in+vitro+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments.</a> JoVE. (170), e61895(2021).</li>
<li>Mattei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoimmunology+meets+organs-on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oncoimmunology meets organs-on-chip.</a> Front Mol Biosci. 8, 627454(2021).</li>
<li>Businaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+cancer+and+immune+cells%3A+exploring+complex+dynamics+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).</li>
<li>Vacchelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+antitumor+immunity+requires+formyl+peptide+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1.</a> Science. 350 (6263), 972-978 (2015).</li>
<li>Maulana, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocompetent+cancer-on-chip+models+to+assess+immuno-oncology+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).</li>
<li>Lorenzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+control+antigen+retention+and+survival+of+CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+after+uptake+of+tumor+apoptotic+cells+leading+to+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming.</a> J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).</li>
<li>Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+assessment+of+dendritic+cell-mediated+uptake+of+cancer+cell+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies.</a> Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).</li>
<li>Lucarini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Type+I+Interferons+and+5-Aza-2%27-Deoxycitidine+to+improve+antitumor+response+against+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma.</a> J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).</li>
<li>Gutiérrez-Martínez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+cell-associated+antigens+by+MHC+Class+I+in+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets.</a> Front Immunol. 6, 363(2015).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+spatial+omics+in+dissecting+tumour+microenvironment+and+the+role+of+AI%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI.</a> Front Oncol. 13, 1172314(2023).</li>
<li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li>
<li>Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics%3A+Navigating+to+the+golden+era+of+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research.</a> Clin Transl Med. 12 (1), 696(2022).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).</li>
<li>Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+flow+cytometry+automated+data+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Current trends in flow cytometry automated data analysis software.</a> Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).</li>
<li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+oncoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El seguimiento de la respuesta inmunitaria contra el cáncer es de suma importancia para dilucidar y comprender las intrincadas interacciones moleculares y celulares que actúan en la EMT y respaldan una batalla constante por la supremacía23. A continuación, detallamos un protocolo sencillo asistido por mFC y ToC para el seguimiento y la caracterización de los pasos que constituyen el ciclo cáncer-inmunidad. Con pequeñas variaciones, este protocolo, basado en líneas celulares murinas y células inmunitarias derivadas de ratones, puede adaptarse tanto a líneas de cáncer inmortalizadas como primarias e inmortalizadas humanas y a células inmunitarias derivadas de sangre periférica humana. Además, al combinar la inhibición genética o farmacológica de vías específicas y sus controles apropiados para el afín, este protocolo permite la identificación de biomarcadores que regulan la inmunovigilancia y, por lo tanto, la respuesta a las terapias inmunogénicas e inmunológicas.
mFC permite el análisis de alto rendimiento de diversos parámetros inmunitarios y combina la capacidad de analizar millones de células en poco tiempo con la posibilidad de identificar eventos raros, evaluar la proliferación y la muerte celular, detectar múltiples parámetros a la vez en un pequeño volumen de muestras y permite realizar análisis moleculares y funcionales posteriores a la clasificación celular basada en la fluorescencia9. Estas características, junto con el bajo costo, han favorecido la accesibilidad y el uso generalizado de mFC en laboratorios clínicos y de investigación. Sin embargo, siguen existiendo algunas limitaciones importantes. En primer lugar, el análisis de mFC requiere la disociación del tejido para obtener suspensiones unicelulares durante la preparación de la muestra, destruyendo así la información espacial del tejido tumoral. El advenimiento de las tecnologías espaciales en la última década, incluidas las transcriptómicas, proteómicas y epigenómicas espaciales de alta complejidad, amplió nuestra capacidad para perfilar el TME mediante el análisis de la posición de las células cancerosas, inmunológicas y estromales y sus interacciones mutuas24. En segundo lugar, la mFC permite la detección de hasta dieciséis (más o menos) parámetros a la vez y, por lo tanto, no cubre todos los marcadores de estado de identificación, maduración y activación de células en una sola muestra. Una vez más, las tecnologías de vanguardia anteriores permiten la detección de hasta cien parámetros simultáneamente con una resolución unicelular e incluso subcelular, incluso antes de 25,26,27. En tercer lugar, la monitorización inmunitaria de los estudios longitudinales y comparativos requiere protocolos reproducibles y la estandarización de cada paso del flujo de trabajo, incluida la adquisición y el análisis de datos. La compuerta manual convencional puede ser subjetiva, y el mantenimiento de los instrumentos y los controles de calidad pueden variar, lo que afecta a la minería y la interpretación de datos. La adquisición automatizada y los complementos que implementan el análisis de datos ayudan a minimizar la variabilidad de los datos28.
Los ToC están ganando una gran atención en la investigación del cáncer por su capacidad para replicar de cerca varias características distintivas de la TME y para reemplazar, al menos en algunos entornos experimentales, a los tumores in vivo 12. Si bien proporcionan un modelo bastante realista de la arquitectura del tejido tumoral, la complejidad multicelular y la interacción dinámica entre los componentes celulares del TME, las ToC aún no pueden reemplazar completamente los estudios en animales en términos de reflejar la complejidad de las respuestas inmunes sistémicas, específicamente el conjunto de mecanismos responsables de la aparición de pasos limitantes de la velocidad para cada uno de los pasos del ciclo de inmunidad al cáncer12. Artículo 29. Más allá de este aspecto, el campo de la oncoinmunología seguirá beneficiándose y beneficiándose del uso de los ToCs, ya que las rondas y la velocidad de la innovación científica los están acercando cada vez más a los modelos in vivo 12.
En conclusión, el protocolo descrito aquí sirve como una herramienta analítica y de descubrimiento poderosa y simple para desentrañar las complejidades dinámicas del TME. Además, las características relacionadas con el tiempo y el costo de este protocolo permiten su viabilidad a gran escala. El desafío que tenemos por delante es estandarizarlo para su uso clínico a fin de informar y guiar mejor las decisiones terapéuticas para los pacientes con cáncer.

En las últimas décadas, la inmunoterapia ha estado a la vanguardia de las opciones de vanguardia para el tratamiento del cáncer. El aprovechamiento del sistema inmunitario con fines antitumorales ha proporcionado una poderosa prueba de concepto para el beneficio del paciente en diversas neoplasias malignas hematológicas y sólidas con pronósticos históricamente malos. A medida que la inmunoterapia ofrece una oportunidad para cánceres que de otro modo serían difíciles de tratar, está experimentando un progreso asombrosamente rápido. Este progreso puede atribuirse, al menos en parte, a la comprensión refinada de la interacción entre las células cancerosas y las células inmunitarias. Esta interacción se asemeja a un "motor" de retroalimentación que el sistema inmunitario enciende para destruir las células cancerosas, el llamado ciclo de inmunidad al cáncer. Esta respuesta inmunitaria contra el cáncer progresa a través de tres niveles principales: reconocimiento, procesamiento y reacción. En primer lugar, en la fase de reconocimiento, las células cancerosas moribundas en el microambiente tumoral liberan antígenos tumorales (Ags) producidos durante la formación del tumor (TME, paso 1) y son engullidos por las células dendríticas infiltrantes del tumor (CD, paso 2). A continuación, en la fase de procesamiento, las CD presentan los epítopos de los Ags tumorales capturados a través de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), expresan en su superficie niveles más altos de moléculas coestimuladoras (paso 3) y se trasladan a los ganglios linfáticos drenadores del tumor (dLN) para presentar su carga a las células T CD8 vírgenes (CD8N, paso 4). Todos estos pasos convergen en el proceso final de reacción durante el cual se activan las células T CD8 (CD8C-P) específicas de Ag tumoral, maduran en células T CD8 efectoras (CD8E) y experimentan una expansión clonal (paso 5). Luego, las célulasE CD8 abandonan las dLN y regresan a casa a través de la sangre hasta el TME (paso 6), donde reconocen específicamente y se unen a las células cancerosas a través de la interacción entre su receptor de células T (TCR) y sus Ags tumorales afines, liberan moléculas citotóxicas [es decir, interferón (IFN)-γ, perforinas y granzimas (Grzs)] y matan las células cancerosas (paso 7)1, 2. La destrucción de las células cancerosas conduce a la liberación de más Ags tumorales para alimentar el ciclo de inmunidad contra el cáncer. De hecho, a través de todos estos pasos, el sistema inmunológico destruye y rechaza las células cancerosas con mucha más frecuencia de lo que se supone. Sin embargo, en los pacientes con cáncer, al menos uno de estos pasos no funciona correctamente. Nosotros y otros demostramos que las células cancerosas buscan detener la respuesta inmune evolucionando hacia variantes más agresivas y con privilegios inmunológicos 3,4,5 o dificultando la efectividad de las células T 6,7.
Tanto la investigación como el desarrollo de fármacos oncológicos se basan en modelos experimentales que permiten estudiar la relación entre el cáncer y las células inmunitarias, la llamada oncoinmunología. A continuación se describen modelos in vitro rápidos, fiables, reproducibles y de bajo coste que reproducen de forma exhaustiva cada paso del ciclo onco-inmunológico y ofrecen una visión rápida y clara de los conjuntos de características fenotípicas y funcionales de la inmunovigilancia y, finalmente, de la inmunoedición.
La citometría de flujo multiparamétrica (mFC) es una de las herramientas analíticas unicelulares más exitosas en la investigación fundamental, el diagnóstico y la investigación traslacional del cáncer en ensayos clínicos del cáncer. Dado que permite capturar simultáneamente más características en cada célula, mFC se ha ganado su lugar como una plataforma de análisis de referencia en oncoinmunología. Combina una alta sensibilidad y especificidad con la posibilidad de medir múltiples patrones de expresión de proteínas y propiedades funcionales de forma rápida y reproducible a nivel de una sola célula a partir de suspensiones celulares heterogéneas e incluso heterotípicas, como las del TME 8,9,10. Dado que tanto los patrones de expresión fenotípicos como los funcionales son sensibles al tiempo, la atención cuidadosa al diseño del experimento, la selección de paneles, controles y anticuerpos titulados adecuados, así como el procesamiento de la muestra y el uso adecuado de la instrumentación son fundamentales para la fiabilidad, comparabilidad y reproducibilidad de los resultados y para interpretar con confianza el resultado del experimento11.
Los dispositivos microfluídicos (ToC) de tumores en un chip modelan el TME al permitir la biomimética a microescala in vitro de la dinámica e interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias 12,13,14,15. En concreto, los ToCs son dispositivos de cultivo celular microfluídicos multicanal capaces de albergar diversos tipos de células organizadas en entornos de cultivo bidimensionales (2D) o tridimensionales (3D) y capaces de modelar con alta fidelidad y controlar con alta precisión, unidades estructurales y funcionales clave, como las interacciones celulares heterotípicas y los flujos de gradientes químicos que ocurren fisiológicamente en el TME12, 13,14,15. En particular, la quimioatracción y las trayectorias inmunitarias, así como la interacción de las células inmunitarias con las células cancerosas, pueden monitorizarse en tiempo real y cuantificarse mediante microscopía de lapso de tiempo y análisis de seguimiento automatizado 5,12,13,14,15,16. Además, las TdC ofrecen la posibilidad de analizar y manipular procesos cruciales que regulan la aparición y progresión del cáncer y la respuesta a la terapia17.
En este artículo, se combinan mFC con ToCs para estudiar todos los niveles de la respuesta inmune anticancerígena que pasan por la fagocitosis mediada por DC de las Ags cancerosas (pasos 1-3), el cebado cruzado de células T (paso 4), la activación y expansión clonal (esta última mediante la tecnología de cicloadición catalizada por 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) y Cu(I), una metodología altamente sensible y precisa, paso 5), la localización de célulasE CD8 en el TME (paso 6) y, finalmente, la destrucción de células cancerosas mediada por célulasE CD8 (paso 7, Figura 1).
Este trabajo contribuye al esfuerzo por establecer protocolos estándar simples, rápidos y confiables para estudiar el ciclo de inmunidad al cáncer. La mejora e integración de los modelos mFC y ToC en la investigación del cáncer, la dinámica de la EMT y la respuesta a la terapia tienen un gran potencial, ya que estos modelos proporcionan fidelidad biológica junto con el control experimental. Por lo tanto, este protocolo ayuda a recrear, de manera escalonada, el ciclo de inmunidad al cáncer al permitir caracterizar, monitorear y maniobrar oportunamente los roles de los actores celulares individuales y sus interacciones recíprocas sobre la inmunovigilancia natural y adquirida. En última instancia, esto ayudará a refinar, reducir y reemplazar los estudios en animales, al tiempo que proporcionará información crítica para burlar a los tumores y guiar la atención clínica. Por último, las ventajas y limitaciones de mFC y ToC se discuten críticamente y se comparan con las tecnologías de vanguardia (por ejemplo, análisis espaciales de alta complejidad a una sola célula e incluso a resolución subcelular) para impulsar la investigación y el tratamiento oncoinmunológicos.

<table><tbody><tr><td>Microtubos de 1,5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>litografía de haz eléctrico de 100 kV</td><td>Vistec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm placas de Petri&nbsp;</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>placas de 12 pocillos</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp; ET3012</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 y 50 mL Corning</td><td>&nbsp;</td><td>352096; 352070</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; Filtro de células M&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431750</tr><tr><td>tubos de poliestireno de 5 mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>120180</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro de células M&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431751</tr><tr><td>matraz tratado con cultivo celular de 75 cm2</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp; ET7076</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas adsorbentes</td> Papel <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de aluminio anti-ratón CD107a (LAMP-1) Anticuerpo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-319</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón CD25 (7D4) Anticuerpo&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-678</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón CD3 (17A2) Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Plus Kit de solución de fijación/permeabilización con BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>BD GolgiPlug Inhibidor del transporte de proteínas (que contiene brefeldina A)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555029</tr><tr><td>BD GolgiStop Inhibidor del transporte de proteínas (que contiene monensina)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>US Biological, Salem</td><td>A1312</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Anticuerpo monoclonal (N418)</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Anticuerpo monoclonal (17B5)</td><td>eBioscience</td><td>17-1371-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Anticuerpo monoclonal (17A2)</td><td>eBioscience</td><td>25-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Anticuerpo monoclonal (IM7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD45 (30-F11)</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4528</td><td></td></tr><tr><td>CD69 Anticuerpo monoclonal (H1.2F3)</td><td>eBioscience</td><td>48-0691-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD95 (APO-1/FAS) Anticuerpo monoclonal (15A7)</td><td>eBioscience</td><td>53-0951-82</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de recuento de células</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td></td></tr><tr><td>Mascarillas de cuarzo cromo</td><td>MB W& A, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Kit de ensayo de citometría de flujo</td><td>Invitrogen</td><td>C10635</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Citómetro de flujo</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de eliminación de células muertas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4053L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0.7</td><td>Flowjo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal Granzyme B (NGZB)</td><td>eBioscience</td><td>12-8898-82</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr> Placa <tr><td>calefactora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivos celulares humificados (37 grados, 5 % CO2)</td>Máquina de hielo <td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Brema Ice Makers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IFN gamma Anticuerpo monoclonal (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>11-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2015</td><td>Adobe Systems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Instituto Nacional de Salud</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte 2022A Software</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Citotox Colorante para Contar Células Muertas</td><td>Sartorius</td><td>4632</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte SX5 Sistema de Análisis de Células Vivas&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JuLi Microscopio de imágenes fluorescente inteligente de células vivas</td><td>Bulldog Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banco de laboratorio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador de laboratorio (4&deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina de seguridad de laboratorio (Clase II)</td><td>Angelantoni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM</td><td>EuroClone</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Columnas MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201; 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separadores MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-10; 130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MCA205 línea celular de fibrosarcoma de ratón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC173</td><td></td></tr><tr><td>Animalario controlado microbiológicamente equipado con cabina</td><td></td><td></td><td></td>de seguridad de clase II</tr><tr><td>MicroCL 21R Microcentrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002552</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp;</td><td>Microsoft, Redmond &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratón: C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD8a+ T Isolation Kit, ratón</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-543</td><td></td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ts2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 5.30.0064 bits</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Litografía óptica</td><td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G sal sódica y sulfato de estreptomicina</td><td>EuroClone</td><td>ECB3001D/1</td><td></td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>&nbsp; 4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PKH67 Kits de enlazadores de células fluorescentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH67GL-1KT kit de</td><td>enlace de células fluorescentes</td></tr><tr><td></td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Thermo Scientific</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de grabado de iones reactivos</td><td>Oxford plasmalab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td></td><td>Pipetas</td> serológicas EuroClone ECB9006L <td></td></tr><tr><td>(2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td><td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; </td><td></td>CLS4489</tr><tr><td>Serie de centrífugas SL 16</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004031</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes estériles, pinzas quirúrgicas, tijeras y alicates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas estériles (1&ndash; 10 &mu; L, 20&ndash; 200 &mu; L, 1000 &mu; L)</td><td>EuroClone Spa, Milán, Italia</td><td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; </td><td></td>ECTD01005</tr><tr><td>SU-8 serie 3000</td><td>MicroChem corp, Newton, (MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de punzones de biopsia dérmica</td><td>Kai Medical, Tedpella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dowsil, Dow Corning</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal TCR beta (H57-597)</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Baño</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>termostáticoTemporizador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMCS&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360</td><td></td></tr><tr><td>Tinte azul de tripán (0,4 %)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA con rojo fenol</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920</td><td></td></tr><tr><td>Desecador</td><td></td><td></td><td></td> de vacío</tr></tbody></table>

cocultivo de sistemas in vitro para reproducir el ciclo cáncer-inmunidad

Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle

La investigación fundamental sobre el cáncer y el desarrollo de terapias eficaces para contrarrestar el ataque se basan en estudios experimentales que detallan las interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias, el llamado ciclo cáncer-inmunidad. Los sistemas de cocultivo in vitro combinados con citometría de flujo multiparamétrica (mFC) y dispositivos microfluídicos de tumor en chip (ToC) permiten una monitorización y caracterización sencillas, rápidas y fiables de cada paso del ciclo de inmunidad al cáncer y conducen a la identificación de los mecanismos responsables de inclinar la balanza entre la inmunovigilancia del cáncer y la inmunoevasión. Una comprensión profunda de las interacciones dinámicas entre el cáncer y las células inmunitarias proporciona información crítica para burlar a los tumores y acelerará el ritmo de la personalización y optimización terapéutica en los pacientes. En concreto, detallamos un protocolo sencillo asistido por mFC y ToC para desentrañar las complejidades dinámicas de cada paso del ciclo de inmunidad al cáncer en líneas celulares de cáncer murino y células inmunitarias derivadas de ratones, y nos centramos en la inmunovigilancia. Teniendo en cuenta las características relacionadas con el tiempo y el costo de este protocolo, sin duda es factible a gran escala. Además, con pequeñas variaciones, este protocolo puede adaptarse tanto a líneas celulares de cáncer humano como a células inmunitarias derivadas de sangre periférica humana y combinarse con la inhibición genética y/o farmacológica de vías específicas para identificar biomarcadores de respuesta inmunitaria.

Se evaluó la capacidad de las CD CD11c+, el subconjunto de fagocitos ampliamente conocido especializado en la presentación cruzada21,22 y activado como se muestra en la Figura 2A, para engullir cuerpos apoptóticos de células cancerosas MCA205 irradiadas con UV que fueron previamente marcadas con el enlazador de células fluorescentes PKH67 mediante mFC. Como era de esperar, las CD CD11c+ capturaron eficientemente células MCA205 apoptóticas in vitro a 37 °C, pero no a 4 °C (Figura 2B, pasos 1-3 del ciclo de inmunidad al cáncer). Para caracterizar aún más la maduración de las CD después de la captación tumoral de Ag, se comprobó y comparó la expresión superficial de las moléculas ligando de puntos de control coestimuladores e inmunitarios en las CD antes y después de la fagocitosis (DCN y DCPHAGO, respectivamente). Las célulasDC PHAGO mostraron niveles significativamente mayores de CD86 y MHC-II, junto con niveles reducidos de PDL1 (Figura 2C, paso 4 del ciclo de inmunidad al cáncer). Por otra parte, se evaluó la expansión clonal de los linfocitos T CD8 una vez cebados por DCPHAGO (CD8C-P) evaluando la incorporación del análogo de timidina EdU (paso 5 del ciclo cáncer-inmunidad). Al controlar adecuadamente las células T CD3 + CD8 + vivas (Figura 3A), se encontró que ~ 20% de CD8C-P, que representan los clones que expresan la molécula CD95 y portan TCR tumorales específicos de Ag (Figura suplementaria 1), experimentaron proliferación en comparación con las células T CD8 ingenuas (CD8N, Figura 3B). Mediante el uso de modelos ToC (Figura 3C), se evaluó la capacidad de CD8C-P para detectar y reaccionar a la quimioatracción de las alarmas liberadas por las células cancerosas, reflejando así el acoplamiento de las células T CD8 específicas del tumor a la TME (paso 6 del ciclo cáncer-inmunidad). Específicamente, se emplearon ToC para permitir y seguir la atracción química y física y la interacción entre las células inmunitarias no adherentes, que se mueven de la cámara inmune a la cámara tumoral, y las células cancerosas adherentes que descansan en la cámara tumoral. Las microfotografías tomadas en diferentes momentos posteriores al cocultivo mostraron una migración progresiva de CD8C-P hacia las células cancerosas mediante el cruce de microcanales (Figura 3C). El interés era que las células inmunitarias que se acercaban podían interactuar de manera estable y eficiente con las células cancerosas a las 24 h, 48 h y 72 h (Figura 3D). Por último, se analizó la respuesta de CD8C-P localizada al TME y reestimulada por Ags (CD8E) presentada en cáncer mediante la evaluación, a través de mFC, de los niveles de expresión superficial de los marcadores de activación CD69 tempranos (Figura suplementaria 2A) y CD44 y CD25 tardíos (Figura 4A), así como la expresión en la membrana de los marcadores de reactividad tumoral CD137 (Figura 4B) y CD107a (Figura suplementaria 2B) en comparación con CD8N y CD8C-P (Paso 7 del ciclo de inmunidad contra el cáncer). También evaluamos la producción intracelular de las moléculas citotóxicas Grz-B (Figura 5A) e IFN-γ (Figura 5B). Curiosamente, todos estos niveles de marcadores aumentaron progresiva y significativamente y alcanzaron un pico de expresión a las 72 h de cocultivo, lo que refleja una activación tardía y efectiva. En consecuencia, las células MCA205 cocultivadas por afines experimentaron niveles significativos de muerte mediada por CD8E, según lo revelado por un sistema de análisis de células vivas y análisis de mFC (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig01.jpg"> Figura 1: Resumen del protocolo experimental para el estudio del ciclo cáncer-inmunidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig02.jpg"> Figura 2: Absorción y presentación de Ag de células cancerosas mediadas por DC. (A) Estrategia de compuerta para el análisis de mFC de DC. Durante la adquisición de mFC y el análisis de datos, las muestras se comprimieron secuencialmente (1) para determinar su morfología mediante el trazado de FSC-A y SSC-A; (2) para singletes trazando FSC-A y FSC-H; y (3) para la viabilidad mediante el trazado de Near-IR y SSC-A. Finalmente, se analizaron las células viables para el marcador de superficie específico CD11c. (B) Análisis de mFC de la capacidad de las CD CD11c+ para engullir cuerpos apoptóticos de células cancerosas MCA205 marcadas con PKH67 e irradiadas con UV a 37 °C y 4 °C (pasos 1-3 del ciclo de inmunidad al cáncer). Gráficos biparamétricos representativos y un histograma que muestra el porcentaje de células CD11c+PKH67+ (media ± s.e.m. con un punto de datos individual, se muestra un experimento representativo de tres). (C) Análisis mFC de moléculas de superficie de ligandos de puntos de control coestimuladores e inmunitarios en DC antes y después de la fagocitosis (DCN y DCPHAGO, respectivamente; paso 4 del ciclo de inmunidad al cáncer). Los histogramas representan el porcentaje (media ± s.e.m. y puntos de datos individuales, n = 3 experimentos independientes) de las células CD11c+CD86+, CD11c+MHC-II+ y CD11c+PDL1+. (B) Prueba t de Student bilateral no apareada con corrección de Welch en comparación con 4 °C. (C) Prueba t de Student bilateral no apareada comparada con DCN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig03.jpg"> Figura 3: Proliferación y tráfico de linfocitos T CD8 a las células cancerosas después del cebado cruzado. (A) Estrategia de compuerta para el análisis de células T CD3 + CD8+ . Durante la adquisición de mFC y el análisis de datos, las muestras se comprimieron secuencialmente (1) para determinar su morfología mediante el trazado de FSC-A y SSC-A; (2) para singletes trazando FSC-A y FSC-H; y (3) para la viabilidad mediante el trazado de Aqua y SSC-A. Finalmente, se analizaron las células viables para la tinción de EdU de proliferación específica. (B) Análisis mFC de la expansión clonal de linfocitos T CD8 mediante tecnología EdU (paso 5 del ciclo cáncer-inmunidad). Los histogramas monoparamétricos representan el porcentaje (media ± s.e.m. con un punto de datos individual, se muestra un experimento representativo de tres) de linfocitos T CD8 naïve EdU+ en proliferación y cebados cruzados (CD8N y CD8C-P, respectivamente). (C,D) Modelo microfluídico ToC de linfocitos T CD8 que se dirigen a la TME (paso 6 del ciclo cáncer-inmunidad). (C) Planimetría esquemática de una TdC. Las dos cámaras de cultivo laterales, que albergan células inmunitarias y cancerosas, están conectadas por canales de tamaño micrométrico (ancho = 12 μm, largo = 10 μm, altura = 10 μm). Los compartimentos de cultivo celular miden 1 mm de ancho, 8 mm de largo y 100 μm de alto. Las microfotografías generadas durante las grabaciones time-lapse representan la migración de CD8C-P hacia las células cancerosas en diferentes puntos temporales (de 0 a 72 h; barra de escala, 100 μm). (D) Se muestran gráficos que representan las trayectorias de CD8C-P individuales (n = 100 células por condición) hacia las células cancerosas objetivo (puntos negros) dentro de las 24-72 h (barra de escala, 10 μm). (A) Prueba t de Student bilateral no apareada con corrección de Welch comparada con CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig04.jpg"> Figura 4: Reactividad tumoral de los linfocitos T CD8 después de la reestimulación con células cancerosas vivas. (A) Análisis mFC de los niveles de expresión superficial de los marcadores de activación CD44, CD25 en los linfocitos T CD8 reestimulados por Ags (CD8E) presentados por cáncer (paso 7 del ciclo de inmunidad al cáncer) hasta 72 h. Gráficos biparamétricos representativos y un histograma que muestra el porcentaje de linfocitos T CD44+CD25+ CD8 en CD8N, CD8C-P, CD8E a las 48 h y 72 h (media ± s.e.m. y puntos de datos individuales, n = 3 experimentos independientes). (B) Análisis mFC de la expresión membrana del marcador de reactividad tumoral CD137 en CD8E. Gráficos biparamétricos representativos y un histograma que muestra el porcentaje de linfocitos T CD137+ CD8 en CD8N, CD8C-P, CD8E a las 48 h y 72 h (media ± s.e.m. y puntos de datos individuales, se muestra un experimento representativo de tres). (A,B) Prueba de ANOVA ordinaria de un factor seguida de corrección de Bonferroni en comparación con CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig05.jpg"> Figura 5: Producción de linfocitos T CD8 de Grz-B e IFN-γ. (A) Análisis mFC de los niveles de expresión intracelular de Grz-B en CD8E (paso 7 del ciclo de inmunidad al cáncer). Gráficos de histograma representativos que muestran el MFI de células T Grz-B+ CD8 en CD8N, CD8C-P, CD8E a las 48 h y 72 h (media ± s.e.m. y puntos de datos individuales, n = 3 experimentos independientes). (B) Análisis mFC de IFN-γ intracelular en CD8E. Gráficos de histograma representativos que muestran el porcentaje de linfocitos T CD8 con IFN-γ+ en CD8N, CD8C-P, CD8E a las 48 h y 72 h (media ± s.e.m. y puntos de datos individuales, n = 3 experimentos independientes). (A,B). Prueba de ANOVA ordinaria de un factor seguida de corrección de Bonferroni en comparación con CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig06.jpg"> Figura 6: Destrucción tumoral mediada por linfocitos T CD8. (A) Análisis mFC de la muerte de células CD45 impulsada por CD8E después de 72 h de cocultivo (paso 7 del ciclo de inmunidad al cáncer). Los histogramas representan el porcentaje (media ± s.e.m. y puntos de datos individuales, n = 3 experimentos independientes) de células PI+CD45-- moribundas. (B) Análisis de células vivas de la muerte de células cancerosas mediada por CD8E. Imágenes representativas y un gráfico que muestra la incorporación de Cytotox Red por células cancerosas moribundas y muertas (se muestra un experimento representativo de tres). (A) Prueba t de Student bilateral no apareada en comparación con células cancerosas solas (CTR). (B) Prueba de Mann-Whitney de dos colas comparada con CTR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a>
Figura complementaria 1: Los gráficos de histograma representan el MFI de CD95 + TCR-β + CD8N y CD8C-P. Prueba t de Student bilateral no apareada comparada con CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%201_revised.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Activación de los linfocitos T CD8. (A) Análisis mFC de los niveles de expresión superficial del marcador de activación temprana de CD69 en CD8E (paso 7 del ciclo de inmunidad al cáncer). Gráficos biparamétricos representativos y un histograma que muestra el porcentaje de linfocitos T CD69+ CD8 en CD8N, CD8C-P, CD8E a las 48 h y 72 h (media ± s.e.m. y puntos de datos individuales, un experimento de cada tres). (B) Análisis mFC de la expresión de membrana de la proteína asociada al lisosoma CD107a en CD8E. Gráficos biparamétricos representativos y un histograma que muestra el porcentaje de linfocitos T CD107a+ CD8 en CD8N, CD8C-P, CD8E a las 48 h y 72 h (media ± s.e.m. y puntos de datos individuales, se muestra un experimento representativo de tres). (A,B). Prueba de ANOVA ordinaria de un factor seguida de corrección de Bonferroni en comparación con CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%202_revised%20.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 1: Mezclas de anticuerpos etapa 3.3.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Aquí, detallamos un protocolo simple, rápido y confiable de citometría de flujo multiparamétrica y asistida por tumores en un chip para monitorear y caracterizar los pasos que constituyen el ciclo de inmunidad al cáncer. De hecho, una comprensión profunda de las interacciones entre el cáncer y las células inmunitarias proporciona información crítica para burlar a los tumores y guiar la atención clínica.

Cocultivo de sistemas in vitro para reproducir el ciclo cáncer-inmunidad

Fundamental cancer research and the development of effective counterattack therapies both rely on experimental studies detailing the interactions between ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Expansión ex vivo de células T tumor-reactiva por medio de la 1/Ionomycin briostatina y la formulación de la cadena gamma común de citoquinas

En este video, demostramos el ensayo de desafío tumoral repetitivo para evaluar el potencial de destrucción tumoral repetitiva de las células CAR-T durante altas cargas de células tumorales. Además, las células CAR-T se pueden analizar mediante citometría de flujo para determinar las diferentes subpoblaciones de células CAR-T en la muestra.

Ensayo de provocación tumoral repetitiva: un ensayo de cultivo in vitro para evaluar las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) para determinar el potencial de destrucción tumoral repetitiva

Las células iniciadoras de tumores (TICs) pueden representar una diana terapéutica viable para el tratamiento del cáncer de ovario, una enfermedad altamente recurrente y mortal. Presentamos un protocolo para condiciones de cultivo enriquecedoras para esta población de células altamente tumorigénicas.

En Enriquecimiento vitro de células iniciadoras del tumor del cáncer de ovario

Adaptamos un inserto de membrana microporosa permeable para imitar el microambiente tumoral (TME). El modelo consiste en un cultivo celular mixto, permite la generación simplificada de poblaciones celulares individuales altamente enriquecidas sin utilizar el marcaje fluorescente o la clasificación celular, y permite estudiar la comunicación intercelular dentro del TME en condiciones normales o de estrés.

Un imitador del microambiente tumoral: Un método simple para generar poblaciones de células enriquecido y Comunicación intercelular Investigando

Aquí, describimos un método de cultivo in vitro de co para recurrentemente desafío orientada a tumor las células T, que permite el análisis fenotípico y funcional de la actividad de las células T antitumorales.

En Vitro Tumor celular Rechallenge de evaluación predictiva de antígeno quimérico del Receptor de la célula T función antitumoral

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular, la biología del cáncer requiere nuevas herramientas in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado. Describimos protocolos para explotar cocultivos microfluídicos inmunes al tumor en entornos 2D y 3D, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico de las funciones celulares.

Modelos de cocultivo microfluídico para diseccionar la respuesta inmune en microambientes tumorales in vitro

El presente protocolo describe un flujo de trabajo experimental que permite el análisis ex vivo de la estimulación de células T humanas en un sistema de cocultivo alogénico con células tumorales pretratadas.

Análisis de la actividad de las células T humanas en un entorno de cocultivo alogénico de células tumorales pretratadas

El protocolo describe un método para crear un modelo de organoide de cáncer colorrectal (CCR) derivado del paciente cocultivado con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para estudiar sus interacciones y potencial terapéutico. Este modelo proporciona una plataforma preclínica para explorar las respuestas inmunitarias en el microambiente tumoral y predecir la eficacia de la terapia basada en TIL para el tratamiento personalizado del CCR.

Establecimiento de un sistema de cocultivo de organoides tumorales colorrectales derivados de pacientes y linfocitos infiltrantes de tumores (TIL)

Este protocolo describe la reprogramación in vivo de células cancerosas de ratón en células dendríticas tipo 1 dentro del microambiente tumoral a través de la expresión forzada de los factores de transcripción PU.1, IRF8 y BATF3.

Reprogramación intratable in vivo de células tumorales a células dendríticas convencionales tipo 1

Aprende a reproducir el ciclo cáncer-inmunidad mediante cocultivos in vitro con citometría de flujo multiparamétrica y modelos tumor-on-a-chip. Este protocolo permite monitorear interacciones entre células cancerosas e inmunitarias de forma simple y confiable.

Cocultivo de sistemas in vitro para reproducir el ciclo cáncer-inmunidad

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