Name: Condensados sintéticos y arquitecturas similares a células a partir de nanoestructuras de ADN anfifílico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a crear condensados sintéticos con nanoestructuras de ADN anfifílico para biología sintética. Este método modular permite la transcripción in vitro de ARN y facilita el diseño de células artificiales con complejidad funcional.

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LM, LDM y DT reconocen el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 (ERC-STG n.º 851667 - NANOCELL). LDM agradece el apoyo de una beca de investigación de la Royal Society para becarios de investigación (RGF/R1/180043) y el apoyo de una beca de investigación de la Royal Society University (UF160152, URF/R/221009).

NOTA: El protocolo se divide en tres secciones. En la sección 1 se describen los pasos previos, incluida la preparación de oligonucleótidos de ADN y capilares de vidrio. La sección 2 describe la preparación de condensados de estrella C de varios diseños, incluidos diseños de uno y dos componentes, y su extracción de los capilares de vidrio. En la sección 3 se describe el uso de condensados de estrella C de plantillas de ARN de un componente para la síntesis de un aptámero de ARN. El usuario debe seguir las buenas prácticas de laboratorio en todo momento, asegurarse de que se implementen todas las evaluaciones y mitigaciones de riesgos necesarias y usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluidos guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. La limpieza de los tubos capilares de vidrio requiere su sonicación, primero en una solución de tensioactivo y segundo en isopropanol o etanol. La extracción de condensados de estrella C de los tubos capilares requiere el uso de un bolígrafo de rayado de diamante para marcar y romper el vidrio, con un riesgo asociado de lesiones por fragmentos de vidrio. Los materiales, equipos y reactivos clave utilizados se enumeran en la Tabla de materiales. La mayoría de los oligonucleótidos no funcionalizados son purificados por el proveedor mediante desalinización estándar, con la excepción de las hebras "Núcleo 1 extendido" y "Plantilla de aptámero", que se solicitan con purificación por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Los oligonucleótidos modificados con colesterol son purificados por el proveedor mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase inversa.
1. Requisitos previos
NOTA: Las siguientes soluciones deben prepararse en agua ultrapura (Tipo I) y filtrarse utilizando filtros de jeringa de 0,22 μm: Tampón Tris-EDTA (TE), que comprende 10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, a pH ~8,0; Tampón TE suplementado con NaCl 2 M; y tampón TE suplementado con NaCl 0,3 M. Las soluciones tampón deben utilizarse dentro de las 2 semanas siguientes a la preparación y almacenarse a 4 °C cuando no estén en uso. Además, se utilizará una solución de detergente óptico alcalino al 1 % en agua ultrapura para la limpieza de los capilares de vidrio.
<ol><li>Preparación de oligonucleótidos de ADN a partir de un estado liofilizado<ol><li>Centrifugar brevemente (2000 x g durante 10-30 s) los tubos de oligonucleótidos de ADN liofilizado para asegurarse de que los gránulos de ADN liofilizado se recojan en el fondo. NOTA: La centrifugación se realiza a temperatura ambiente (RT) durante 10-30 s. La mini centrífuga utilizada aquí tiene un valor predeterminado de 2000 x g (6000 rpm).</li>
		<li>Agregue la cantidad adecuada de tampón TE para reconstituir cada oligonucleótido a 100 μM. Vértice a fondo para asegurar la disolución completa, luego gire los tubos hacia abajo para recolectar todo el líquido según el paso 1.1.1.</li>
		<li>Para cada solución madre, mida la absorbancia a 260 nm y calcule la concentración final utilizando el coeficiente de extinción de la secuencia de oligonucleótidos bajo prueba. NOTA: El coeficiente de extinción para una secuencia de oligonucleótidos dada generalmente se encuentra en la hoja de datos del proveedor, pero también se puede calcular con herramientas en línea utilizando el modelo de vecino más cercano35 o valores tabulados del coeficiente de extinción de nucleótidos individuales36.</li>
		<li>Almacene los oligonucleótidos rehidratados a 4 °C durante períodos cortos de tiempo (hasta 1 semana) o a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo (hasta 6 meses).</li>
	</ol></li>
	<li>Limpieza de tubos capilares de vidrio<ol><li>Sonicato en detergente óptico alcalino al 1% para componentes ópticos en agua desionizada.<ol><li>Tome el número requerido de tubos capilares de vidrio que se van a limpiar y colóquelos en un recipiente alto y estrecho (por ejemplo, un vaso de precipitados o un tubo de centrífuga de 15/50 ml) de modo que los capilares no queden planos sobre la base del recipiente.</li>
			<li>Agregue el detergente al recipiente, llenándolo justo por encima del nivel de los tubos capilares. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas dentro de los tubos capilares: toque para eliminar, si es necesario. Cubra el recipiente sin apretar (por ejemplo, con papel de aluminio o con la tapa del tubo de centrífuga, asegurándose de que no esté herméticamente sellado).</li>
			<li>Ponga un baño de agua sonicante a 40 °C, coloque el recipiente tapado en posición vertical en el baño y sonique durante 30 min. Asegúrese de que la lámina, si se utiliza, no entre en contacto con el agua del baño de sonicación. NOTA: El baño de sonicación utilizado en este estudio tiene por defecto una frecuencia de sonicación de 60 Hz y una potencia de sonicación de 150 W. PRECAUCIÓN: Nunca agregue o elimine elementos de un baño de sonicación mientras corre; Pausar siempre primero el protocolo.</li>
			<li>Una vez finalizada la sonicación, apague el elemento calefactor del baño de agua de sonicación, enjuague a fondo los capilares del recipiente con agua desionizada o ultrapura, un mínimo de cinco veces, desechando el agua de enjuague cada vez.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Sonicato en isopropanol o etanol.<ol><li>A los tubos capilares de vidrio en el recipiente de limpieza, agregue isopropanol o etanol (mínimo 70%), llenando hasta justo por encima del nivel de los tubos capilares. Al igual que en el paso 1.2.1.2, asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas en los tubos capilares y cubra el recipiente sin apretar.</li>
		<li>Coloque el recipiente en posición vertical en el baño de sonicación y sonique durante 15-30 min. PRECAUCIÓN: El isopropanol y el etanol son inflamables, con puntos de inflamación por debajo de RT. Minimice los volúmenes de disolventes utilizados durante la limpieza eligiendo un recipiente del tamaño adecuado, asegúrese de que los recipientes estén cubiertos sin apretar y no deje el baño de sonicación desatendido durante esta etapa.</li>
		<li>Una vez finalizada la sonicación, deseche adecuadamente el isopropanol o etanol y seque los capilares bajo nitrógeno, manipulándolos con un pañuelo sin pelusa.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación y extracción de condensados C-star (Figura 2)
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66738/66738fig02.jpg"> Figura 2: Carga de mezclas C-star y extracción de condensados de tubos capilares de vidrio. En todos los paneles, la mezcla C-star se ha sustituido por una solución acuosa de 25 mM de calceína para mejorar la visibilidad. (A-E) Pasos clave, en orden, que deben tomarse antes del recocido, correspondientes a las secciones 2.1 y 2.2 del protocolo. (De F a J) Pasos clave, en orden, que deben tomarse después del recocido, correspondientes a la sección 2.3 del protocolo. Durante la extracción (paneles (I-J)), los condensados de ADN se sedimentarán desde el capilar hasta el depósito tampón siempre que el tubo de microcentrífuga se almacene verticalmente. Los condensados no serán visibles a simple vista. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66738/66738fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>Preparación de mezclas C-star para condensados monocomponente NOTA: Los detalles de la secuencia para varios diseños de componentes individuales se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1 y en los trabajos anteriores 29,30,32. Los protocolos de recocido lento definidos en los pasos 2.1.9 y 2.2.2 se desarrollaron para garantizar la relajación de las redes de nanoestrellas en morfologías compactas, dadas las propiedades reológicas fuertemente dependientes de la temperatura de las redes de nanoestrellas37.<ol><li>Los oligonucleótidos y los componentes del tampón variarán en función del diseño de estrella C deseado. Prepare una mezcla de 60 μL de condensados de estrella C de un solo componente a una concentración de 5 μM para la estrella C de cuatro brazos que no responde, la estrella C que responde a TMSD o la estrella C que crea plantillas de ARN.</li>
		<li>Para cada diseño, pipetee los componentes apropiados enumerados en la Tabla complementaria 2 en un tubo de microcentrífuga separado y mezcle bien mediante pipeteo. NOTA: Se supone que todas las soluciones madre de oligonucleótidos tienen una concentración de 100 μM en TE.</li>
		<li>Extraiga todo el 60 μL de solución de C-star y pipetee con cuidado para inyectar la mezcla en el tubo capilar de vidrio limpio y seco como se muestra en la figura 2A, teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire.</li>
		<li>Con una pipeta, inyecte aproximadamente 9-12 μL de aceite mineral en cada extremo del tubo capilar, tapando la muestra de manera que no haya una interfaz libre entre la solución de C-star y el aire (ver Figura 2B). Luego, seque cuidadosamente el tubo capilar con papel de seda para asegurarse de que no haya aceite en el exterior (Figura 2C), teniendo cuidado de no absorber el aceite mineral o la solución de C-star fuera del tubo capilar. El resultado final se muestra en la Figura 2D.</li>
		<li>Prepare un pequeño lote de pegamento epoxi de dos partes para adherir cada extremo del tubo capilar, con el lado plano hacia abajo, a un engobe de cubierta de vidrio. Asegúrese de que las aberturas del tubo estén completamente cubiertas de pegamento, formando un sello continuo, como se muestra en la Figura 2E.</li>
		<li>Dejar curar durante un mínimo de 3 h, pero preferiblemente toda la noche.</li>
		<li>Después de ~ 30 min de curado, inspeccione la capa de pegamento para detectar la presencia de espacios en el sello causados por burbujas de aire. Si estos están presentes, séllelos con una pequeña cantidad de pegamento.</li>
		<li>Envuelva el tubo capilar pegado al cubreobjetos en papel de aluminio, asegurándose de que el tubo se mantenga plano en la parte inferior del cubreobjetos de vidrio. La lámina asegura un buen contacto térmico entre el mismo y el elemento calefactor del termociclador (ver siguiente paso).</li>
		<li>Coloque la muestra envuelta en un termociclador y recociendo siguiendo el siguiente protocolo: Mantenga a 95 °C durante 30 min, luego enfríe de 85 °C a 50 °C a -0,04 °C·min-1, y luego enfríe de 50 °C a RT a -0,5 °C·min-1.<ol><li>Almacene los condensados recocidos de estrella C a 4 °C o RT durante períodos prolongados (meses) mientras el capilar permanezca sellado, ya que el recocido térmico esteriliza eficazmente la muestra y desnaturaliza las nucleasas. Mantenga el capilar plano durante el almacenamiento y la manipulación para evitar que los condensados se sedimenten hacia un extremo y se agreguen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de mezclas C-star para condensados binarios NOTA: Para informar la selección de las poblaciones de estrellas C para sistemas binarios, consulte el trabajo de Malouf et al., que describe las reglas de diseño y el comportamiento de fase esperado de los condensados binarios de estrellas C30.<ol><li>Para preparar condensados binarios, combine volúmenes de 30 μL de las mezclas C-star descritas en el paso 2.1 anterior hasta un volumen total de 60 μL, mezcle bien, cargue en capilares y siga los pasos 2.1.4-2.1.8.</li>
		<li>Coloque la muestra envuelta en un termociclador y recociendo siguiendo el siguiente protocolo: Mantenga a 95 °C durante 30 min, luego enfríe de 85 °C a 40 °C a -0.01 °C·min-1, y luego enfríe de 40 °C a RT a -0.1 °C·min-1.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de condensados de estrella C de tubos capilares.<ol><li>Prepare un tubo de microcentrífuga grande (1,5 mL o 2,0 mL) que contenga 60 μL de NaCl 0,3 M en tampón TE.</li>
		<li>Desenvuelva la muestra capilar y use un bolígrafo de rayado de diamante para marcar la parte inferior del cubreobjetos en cada extremo interior del área pegada (Figura 2F). Rompa el cubreobjetos en esta región y deséchelo adecuadamente.</li>
		<li>Limpie a fondo los tubos capilares con etanol y séquelos.</li>
		<li>Marque cada extremo de los tubos capilares con el rotulador de diamante, primero con la parte inferior (Figura 2G), luego voltee y marque los tubos "con el lado derecho hacia arriba".<ol><li>Asegúrese de que las líneas de puntuación no se superpongan a la interfaz aceite-agua. Deben estar dentro de la región acuosa para evitar que el aceite permanezca en la muestra extraída.</li>
		</ol></li>
		<li>Separar los extremos de los tubos capilares (Figura 2H), reteniendo la parte central del tubo y desechando el resto. Coloque el tubo capilar cortado en el tubo de microcentrífuga preparado en el paso 2.3.1, asegurándose de que la parte inferior del tubo capilar entre en contacto con la solución tampón (Figura 2I).</li>
		<li>Los condensados se sedimentarán desde el tubo hacia el depósito amortiguador a través de la gravedad; permita que esto ocurra durante un mínimo de 10 minutos (Figura 2J). Retire el tubo capilar cortado y deséchelo adecuadamente. Este enfoque de extracción suave limita el riesgo de agregación de condensado.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Transcripción de un aptámero de ARN a partir de condensados de estrellas C con plantillas de ARN
NOTA: Para la producción del aptámero de ARN de brócoli, se requiere una solución de difluoro-4-hidroxibencilideno imidazolidinona (DFHBI): el polvo de DFHBI se prepara primero como una solución madre a 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO), que luego se diluye a 600 μM en agua libre de ARNasa y DNasa.
<ol><li>Lavado de condensados C-star con plantillas de ARN NOTA: Los condensados de estrella C con plantillas de ARN se lavan tres veces para garantizar que se eliminen los oligonucleótidos plantilla no unidos.<ol><li>Deje que la solución de condensados extraídos se asiente durante al menos 5 minutos y luego elimine aproximadamente la mitad del volumen del sobrenadante.<ol><li>Para un volumen de 60 μL de condensados extraídos, elimine entre 25-30 μL del sobrenadante.</li>
			<li>Pipetee desde la parte superior del nivel de líquido para minimizar el número de condensados eliminados durante este paso.</li>
		</ol></li>
		<li>Añadir el mismo volumen de 0,3 M de NaCl en TE para sustituir el sobrenadante eliminado y mezclar mediante pipeteo.</li>
		<li>Repita los dos pasos anteriores para un total de tres ciclos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la mezcla de transcripción T7 NOTA: La mezcla de transcripción T7 se prepara utilizando el kit de transcripción CellScript T7-FlashScribe. El paso 3.2.2 es una modificación del protocolo del fabricante, que se puede encontrar aquí38. Aquí describimos la transcripción del aptámero de ARN de brócoli, que induce fluorescencia en DFHBI al unirse. En el caso de otros aptámeros luminosos, sustituya el volumen de DFHBI descrito en el paso 3.2.2 por el fluorógeno adecuado. Para otras transcripciones, elimine este componente por completo.<ol><li>Prepare una solución madre de 10 mM de DFHBI en DMSO, luego diluya una alícuota hasta una concentración final de 600 μM usando agua libre de RNasa y DNasa.</li>
		<li>Descongele los componentes del kit de transcripción en hielo y, a continuación, pipetee lo siguiente en un tubo de microcentrífuga esterilizado en autoclave a temperatura ambiente utilizando puntas de pipeta estériles: 2 μL de tampón de transcripción T7 10x (incluido en el kit de transcripción), 1,8 μL de 100 mM de ATP, 1,8 μL de 100 mM de CTP, 1,8 μL de 100 mM UTP, 1,8 μL de 100 mM GTP, 2 μL de DTT de 100 mM, 2 μL de DFHIBI de 600 μM, 0,5 μL de inhibidor de RNasa, 2 μL de solución de enzima T7 (incluida en el kit de transcripción).</li>
		<li>Mezcle suavemente la solución pipeteando.</li>
		<li>Utilice la mezcla de transcripción para el paso 3.3 (síntesis de la transcripción de ARN) inmediatamente después de la preparación.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntesis de la transcripción de ARN<ol><li>En una cámara adecuada para la obtención de imágenes de microscopía, pipetee 3,3 μL de los condensados lavados preparados a partir de estrellas C con plantillas de ARN y añada el volumen total de la mezcla de transcripción preparada anteriormente.</li>
		<li>Adquisición de imágenes de microscopía durante 18 h, comenzando inmediatamente después de añadir la mezcla de transcripción a los condensados. NOTA: La configuración de la microscopía dependerá del sistema preparado. Asegúrese de que se utilizan los ajustes adecuados de excitación y emisión para los fluoróforos de la muestra, junto con tiempos de exposición que no provoquen saturación a medida que avanza la transcripción. Al igual que para cualquier lapso de tiempo, se debe encontrar un compromiso entre una potencia láser o LED lo suficientemente alta para una buena señal y, al mismo tiempo, minimizar el riesgo de fotoblanqueo. El fotoblanqueo durante largos períodos de tiempo se minimizará en los sistemas basados en LED en comparación con los sistemas basados en láser. Intervalos de imagen sugeridos: 20 min durante las primeras 2 h y 30 min posteriormente.</li>
	</ol></li>
</ol>

Condensados biomoleculares versátiles de nanoestrellas de ADN anfifílico o estrellas C

<ol><li>Buddingh', B. C., Hest, J. C. M. v <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+Synthetic+compartments+with+life-like+functionality+and+adaptivity%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity.</a> Acc Chem Res. 50 (4), 769-777 (2017).</li>
<li>Fanalista, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+and+size+control+of+artificial+cells+for+bottom-up+biology%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology.</a> ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).</li>
<li>Dora Tang, T. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+membrane+assembly+on+coacervate+microdroplets+as+a+step+towards+a+hybrid+protocell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Fatty acid membrane assembly on coacervate microdroplets as a step towards a hybrid protocell model.</a> Nat Chem. 6 (6), 527-533 (2014).</li>
<li>Deshpande, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+coacervate+formation+within+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes.</a> Nat Commun. 10 (1), 1800(2019).</li>
<li>Rubio-Sánchez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+driven+membrane+phase+transitions+enable+content+reshuffling+in+primitive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Thermally driven membrane phase transitions enable content reshuffling in primitive cells.</a> J Am Chem Soc. 143 (40), 16589-16598 (2021).</li>
<li>Jahnke, K., Huth, V., Mersdorf, U., Liu, N., Göpfrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+assembly+of+synthetic+cells+with+a+DNA+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Bottom-up assembly of synthetic cells with a DNA cytoskeleton.</a> ACS Nano. 16 (5), 7233-7241 (2022).</li>
<li>Tran, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+segregation+module+for+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A DNA segregation module for synthetic cells.</a> Small. 19 (13), 2202711(2023).</li>
<li>Mason, A. F., Buddingh', B. C., Williams, D. S., Hest, J. C. M. v <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+self-assembly+of+a+copolymer-stabilized+coacervate+protocell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hierarchical self-assembly of a copolymer-stabilized coacervate protocell.</a> J Am Chem Soc. 139 (48), 17309-17312 (2017).</li>
<li>Gumz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+functional+synthetic+cells%3A+In-depth+study+of+nanoparticle+and+enzyme+diffusion+through+a+cross-linked+polymersome+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Toward functional synthetic cells: In-depth study of nanoparticle and enzyme diffusion through a cross-linked polymersome membrane.</a> Adv Sci. 6 (7), 1801299(2019).</li>
<li>Huang, X., Patil, A. J., Li, M., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+higher-order+structure+and+function+in+proteinosome-based+protocells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Design and construction of higher-order structure and function in proteinosome-based protocells.</a> J Am Chem Soc. 136 (25), 9225-9234 (2014).</li>
<li>Booth, R., Qiao, Y., Li, M., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+positioning+and+chemical+coupling+in+coacervate-in-proteinosome+protocells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Spatial positioning and chemical coupling in coacervate-in-proteinosome protocells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 58 (27), 9120-9124 (2019).</li>
<li>Hindley, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-triggered+enzymatic+reactions+in+nested+vesicle+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Light-triggered enzymatic reactions in nested vesicle reactors.</a> Nat Commun. 9 (1), 1093(2018).</li>
<li>Zubaite, G., Hindley, J. W., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+reconfiguration+of+subcompartment+architectures+in+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Dynamic reconfiguration of subcompartment architectures in artificial cells.</a> ACS Nano. 16 (6), 9389-9400 (2022).</li>
<li>Hirose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+membraneless+organelles+and+their+various+roles+in+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to membraneless organelles and their various roles in gene regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (4), 288-304 (2023).</li>
<li>Guindani, C., Silva, L. C. d, Cao, S., Ivanov, T., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cells%3A+From+Simple+Bio-Inspired+Modules+to+Sophisticated+Integrated+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Synthetic cells: From Simple Bio-Inspired Modules to Sophisticated Integrated Systems.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 61 (16), e202110855(2022).</li>
<li>Adamala, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+synthetic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Present and future of synthetic cell development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (3), 162-167 (2023).</li>
<li>Allen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+behaviors+in+hydrogel+artificial+cells+through+embedded+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Biomimetic behaviors in hydrogel artificial cells through embedded organelles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (35), e2307772120(2023).</li>
<li>Cook, A. B., Novosedlik, S., Hest, J. C. M. v <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+coacervate+materials+as+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Complex coacervate materials as artificial cells.</a> Acc Mater Res. 4 (3), 287-298 (2023).</li>
<li>Seeman, N. C., Sleiman, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">DNA nanotechnology.</a> Nat Rev Mater. 3, 17068(2018).</li>
<li>Takinoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+droplets+for+intelligent+and+dynamical+artificial+cells%3A+from+the+viewpoint+of+computation+and+non-equilibrium+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">DNA droplets for intelligent and dynamical artificial cells: from the viewpoint of computation and non-equilibrium systems.</a> Interface Focus. 13 (5), 20230021(2023).</li>
<li>Liu, W., Lupfer, C., Samanta, A., Sarkar, A., Walther, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switchable+hydrophobic+pockets+in+DNA+protocells+enhance+chemical+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Switchable hydrophobic pockets in DNA protocells enhance chemical conversion.</a> J Am Chem Soc. 145 (13), 7090-7094 (2023).</li>
<li>Wilner, O. I., Willner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Functionalized DNA nanostructures.</a> Chem Rev. 112 (4), 2528-2556 (2012).</li>
<li>Gong, J., Tsumura, N., Sato, Y., Takinoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+DNA+droplets+recognizing+miRNA+sequence+inputs+based+on+liquid-liquid+phase+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Computational DNA droplets recognizing miRNA sequence inputs based on liquid-liquid phase separation.</a> Adv Funct Mater. 32, 2202322(2022).</li>
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<li>Cavaluzzi, M. J., Borer, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+UV+extinction+coefficients+for+nucleoside-5%27-monophosphates+and+unpaired+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Revised UV extinction coefficients for nucleoside-5'-monophosphates and unpaired DNA and RNA.</a> Nucleic Acids Res. 32 (1), e13(2004).</li>
<li>Lattuada, E., Caprara, D., Piazza, R., Sciortino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+uniform+dynamics+in+equilibrium+colloidal+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Spatially uniform dynamics in equilibrium colloidal gels.</a> Sci Adv. 7 (49), (2021).</li>
<li>T7-FlashScribeTM Transcription Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cellscript.com/products/018pl0617CS.pdf">https://www.cellscript.com/products/018pl0617CS.pdf</a> (2017).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> J Comput Chem. 32 (1), 170-173 (2011).</li>
<li>Walczak, M., Brady, R. A., Leathers, A., Kotar, J., Di Michele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hydrophobic+moieties+on+the+crystallization+of+amphiphilic+DNA+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Influence of hydrophobic moieties on the crystallization of amphiphilic DNA nanostructures.</a> The Journal of Chemical Physics. 158 (8), 084501(2023).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de interés.

El protocolo descrito aquí proporciona un enfoque para la preparación de condensados de uno o dos componentes a partir de nanoestrellas de ADN anfifílico, con variaciones de diseño para introducir diferentes respuestas en los condensados. El protocolo dado produce condensados en una solución tampón de 0,3 M de NaCl en TE, pero las condiciones tampón pueden modificarse modificando adecuadamente los volúmenes enumerados anteriormente. Trabajos previos han estudiado la formación de condensados de estrella C en 0,2 M de NaCl en TE y 0,1 M de NaCl en TE y en solución salina tamponada con fosfato (PBS)32. Los condensados de estrella C se producen a una concentración final de 5 μM, pero esto también se puede variar modificando adecuadamente las concentraciones de oligonucleótidos y/o los volúmenes agregados en el protocolo anterior. Dependiendo de las variaciones deseadas, puede ser necesario preparar soluciones madre de oligonucleótidos a diferentes concentraciones y en diferentes tampones en comparación con el protocolo descrito en la sección 1, aunque los aspectos prácticos del protocolo siguen siendo los mismos. El diseño de la estrella C puede modificarse fácilmente para introducir una funcionalidad o respuesta diferente, como se detalló en el trabajo anterior32. Las variaciones de diseño incluyen la introducción de motivos que responden a cambios de pH32, iones de potasio31 o secuencias de oligonucleótidos30,32. En caso de que se deseen nuevos diseños, se aconseja probar primero el ensamblaje computacionalmente (utilizando herramientas como NUPACK39) y luego probar la formación de las nanoestrellas equivalentes no colesterolizadas utilizando electroforesis en gel de agarosa 32,40. El grado de separación de fases en condensados binarios dependerá de la combinación de poblaciones de estrellas C utilizadas, como se describe en el trabajo previo30. Observamos que los protocolos de recocido especificados para la formación de condensado requieren escalas de tiempo mucho más largas que las típicas para el plegamiento de pequeñas nanoestructuras de ADN similares a estrellas C individuales. De hecho, se requiere un recocido lento para permitir el equilibrio en las escalas de longitud más grandes de los condensados. Para condensados de un solo componente, el protocolo sugerido tiene una duración de 17 h, y para condensados binarios, se utiliza un protocolo de recocido aún más largo (~3 días) para acercarse al equilibrio termodinámico. Hemos descubierto que estos protocolos producen resultados reproducibles en todas las diferentes poblaciones de estrellas C utilizadas hasta la fecha, pero si los investigadores desean mejorar el rendimiento de las muestras, recomendaríamos un estudio sistemático en el que se modulen las tasas de recocido para encontrar el protocolo más corto posible en el que se puedan lograr las morfologías deseadas para el sistema bajo prueba. Se recomienda no modificar la retención de 30 minutos a 95 °C, ya que este paso esteriliza eficazmente la muestra y permite el almacenamiento a largo plazo en tubos capilares.
La cámara en la que se producen los condensados de estrella C es crucial para su formación exitosa. La cámara debe ser de vidrio o cuarzo; El uso de recipientes de plástico como el polipropileno, un material típico de los tubos de microcentrífuga, interrumpirá el autoensamblaje debido a las interacciones hidrofóbicas entre el plástico y las fracciones de colesterol. La relación de aspecto del recipiente de recocido y la concentración de la mezcla C-star también afectarán las características de los condensados, en particular su tamaño y agregación. En concreto, si se utiliza un contenedor "más alto", con una superficie pequeña en el fondo en relación con su altura, los condensados C-star sedimentarán en el fondo con altas densidades superficiales, lo que favorecerá la formación de puntos de contacto entre condensados. Si estos ocurren tarde en el proceso de recocido térmico, cuando la temperatura es relativamente baja y los condensados se comportan como líquidos o sólidos altamente viscosos, los condensados en contacto no se relajarán en formas esféricas y más bien formarán agregados irregulares de configuraciones parcialmente fusionadas. Al pipetear la mezcla de estrella C en tubos capilares, se debe tener cuidado para evitar la introducción de burbujas de aire: tienden a formarse agregados grandes en la interfaz aire/agua, por lo que los condensados extraídos tendrán un tamaño y una morfología no ideales. El secado de los extremos de los tubos capilares después de la inyección de la mezcla de estrella C o aceite mineral mejorará la adherencia. El adhesivo seleccionado debe ser lo suficientemente viscoso como para recubrir completamente las aberturas del tubo capilar sin ser absorbido por el tubo, inerte al aceite mineral, compatible con el vidrio y estable a las temperaturas de recocido utilizadas. Hemos descubierto que el adhesivo epoxi Araldite Rapid de dos partes es adecuado para nuestros propósitos a pesar de que solo está clasificado para temperaturas de 80 °C. Las burbujas de aire o los espacios en el pegamento darán lugar a capilares imperfectamente sellados, que tienden a gotear durante el recocido. Una vez que el pegamento se ha curado, envolver las muestras en papel de aluminio tiene el doble beneficio de contener cualquier fuga y mejorar el contacto térmico entre la muestra y el termociclador. La lámina debe mantenerse lo más lisa y plana posible para garantizar que los capilares se mantengan nivelados durante el recocido. Los condensados recocidos en capilares pueden almacenarse a largo plazo a temperatura ambiente y volver a recocer si es necesario. Las muestras deben manipularse con cuidado: es probable que los condensados se fusionen cuando estén en contacto, por lo que los capilares deben almacenarse planos. Para obtener imágenes de microscopía óptimas, el cubreobjetos se puede marcar y quitar mientras se dejan intactos los tubos capilares. Los condensados tienden a tener más de 5 μm de diámetro, y no hemos observado un movimiento browniano significativo durante su obtención de imágenes29,30.
Se recomienda preparar varios lotes independientes de condensados de estrella C para garantizar que las posibles diferencias observadas entre las muestras reflejen diferencias en la composición o en las condiciones de recocido, y no diferencias causadas por posibles errores experimentales.
Es probable que se introduzcan pequeñas partículas de vidrio en la solución de condensado como resultado del proceso de extracción. Estos se pueden minimizar frotando cuidadosamente los extremos cortados del tubo capilar con una tira limpia de Parafilm, que es muy eficaz para recoger el vidrio, antes de colocar el tubo capilar cortado en el tubo de microcentrífuga que contiene la solución tampón. Durante la extracción, el número de condensados extraídos se puede maximizar girando brevemente el tubo de microcentrífuga que contiene el tubo capilar cortado, aunque esto aumenta la probabilidad de que los condensados se fusionen y formen morfologías no ideales. Después de la extracción, los condensados deben almacenarse a temperaturas de refrigerador (generalmente 4 ° C) y usarse dentro de los tres días para evitar posibles problemas de contaminación biológica y porque los condensados en los tubos de microcentrífuga se agregarán y fusionarán con el tiempo debido a las formas típicamente redondeadas o puntiagudas de estos tubos. Debe evitarse el pipeteo muy vigoroso de los condensados extraídos, ya que pueden dañarse por un flujo de cizallamiento excesivo.
Para la transcripción de un aptámero de ARN, puede ser necesario modificar el volumen de la mezcla de transcripción utilizada, ya que el número y el tamaño de los condensados (y, por lo tanto, la concentración de la plantilla) en cada reacción individual no se pueden controlar con precisión. En los experimentos descritos en la sección 3, se utiliza un exceso de mezcla de transcripción en relación con la concentración teórica de la plantilla. Se recomienda que los sobrenadantes de las tres etapas de lavado (sección 3.1) se conserven y se utilicen para llevar a cabo las reacciones de transcripción. Estos experimentos darán una indicación de la cantidad de plantilla de aptámero no unida presente en la solución.
Una de las principales ventajas de la plataforma C-star es su flexibilidad y modularidad. Como se ha descrito anteriormente y en trabajos anteriores, los condensados pueden diseñarse para responder a una serie de entradas, como el desplazamiento de la hebra mediado por puntos de apoyo y la transcripción de aptámeros de ARN por separado o en secuencia. Combinado con la programabilidad inherente de sus bloques de construcción de ADN, las nanoestrellas de ADN anfifílico proporcionan una solución robusta y versátil para el diseño y la preparación de células sintéticas.

Las células sintéticas son dispositivos a escala micrométrica (10-50 μm) construidos de abajo hacia arriba para replicar funciones y estructuras de las células biológicas existentes 1,2. Las células sintéticas a menudo están unidas por membranas construidas a partir de vesículas bicapa lipídica 3,4,5,6,7, polimerosomas 8,9 o proteinosomas10,11, que también se pueden utilizar para establecer la compartimentación interna12,13. Inspiradas en los orgánulos sin membrana que se sabe que sostienen diversas funcionalidades en las células vivas14, estructuras como los coacervados poliméricos, los condensados biomoleculares y los hidrogeles están ganando terreno como alternativas versátiles y robustas para establecer la compartimentación externa e interna en las células sintéticas 15,16,17,18.
Aprovechando el versátil conjunto de herramientas de la nanotecnología de ADN19, se han desarrollado múltiples soluciones para diseñar gotas y condensados sintéticos a partir del autoensamblaje de nanoestructuras artificiales de ADN, cuyo tamaño, forma, funcionalidad, valencia e interacciones mutuas se pueden programar con precisión20. Las gotas o condensados de ADN son biocompatibles y pueden actuar como andamios tanto para las células sintéticas como para los orgánulos, albergando reacciones químicas y biomoleculares21, computando información22,23, capturando y liberando cargas24,25 y sosteniendo respuestas estructurales26.
Entre los diversos diseños de nanoestructuras de ADN formadoras de condensado, las nanoestrellas de ADN anfifílicas, denominadas estrellas C, han demostrado ser robustas y versátiles27. Las estrellas C son motivos ramificados simples que consisten en una unión de ADN fija (generalmente de cuatro vías), de la cual emergen brazos de ADN de doble cadena (ds)28. Luego, los brazos se llenan de fracciones hidrofóbicas, generalmente colesterol, lo que hace que las nanoestructuras sean anfifílicas e impulsan su condensación después de un recocido sencillo de una sola olla. Los condensados C-star ofrecen una programabilidad estructural y funcional precisa, incluida la posibilidad de establecer arquitecturas multicompartimentales29,30, responder estructuralmente a los desencadenantes de ADN y cationes31, sintetizar macromoléculas29, capturar y liberar cargas útiles32 e interactuar con células vivas33. A continuación, describiremos y discutiremos los protocolos para producir condensados de estrellas C a partir de sus oligonucleótidos constituyentes.
El protocolo resume la preparación de condensados unarios (de un componente) y binarios (de dos componentes), utilizando tres diseños diferentes de estrellas C (Figura 1): "No sensible", "Sensible a TMSD" y "Plantillas de ARN". La estrella C "no sensible" (panel A) consta de cuatro "hebras centrales" con secuencias distintas que forman la unión de cuatro vías. Cuatro oligonucleótidos idénticos modificados con colesterol están conectados a la unión, lo que garantiza que una molécula de colesterol esté presente al final de cada brazo. Las estrellas C que no responden constituyen andamios simples e inertes para condensados unarios y binarios. En la estrella C "sensible a TMSD" (panel B), la conexión entre las hebras colesterolizadas y la unión está asegurada por una hebra de "puente de detención", que presenta un dominio de "toehold" de ADN monocatenario (ss) colgante. En presencia de una hebra de ADN invasora con un dominio de punto de apoyo complementario, se puede desencadenar una reacción de desplazamiento de la hebra mediada por un punto de apoyo34, mediante la cual el invasor desplaza el puente de detención, rompiendo la conexión entre la unión y las partes hidrofóbicas y desencadenando el desmontaje de la red de ADN32. Por último, la estrella C de "plantillas de ARN" (panel C) incluye una modificación de "Base" complementaria a una hebra "puente", la última de las cuales enlaza la plantilla de ssDNA transcribible para el aptámero de brócoli29. Los detalles de la secuencia de los oligonucleótidos constituyentes para los tres tipos de diseños de estrellas C mencionados aquí se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1 y en trabajos anteriores 29,30,32.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66738/66738fig01v2.jpg"> Figura 1. Esquemas de tres diseños diferentes de nanoestrellas de ADN anfifílico (estrellas C). Las secuencias de oligonucleótidos para varios ejemplos de las estrellas C descritas aquí se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1. (A) Esquema de una estrella C diseñada para formar condensados que no responden, con las hebras de oligonucleótidos componentes "Core 1", "Core 2", "Core 3", "Core 4" (coloreadas en tonos rosados) y "Colesterol terminal" (coloreadas en azul). Cada color único representa una cadena de oligonucleótidos de secuencia única. "Core 1" y "Core 3" son parcialmente complementarios a "Core 2" y "Core 4", pero no complementarios entre sí. (B) Esquema de una estrella C diseñada para desmontarse tras la adición de una hebra invasora a través del desplazamiento de la hebra mediada por un punto de apoyo, como se describe en el trabajo anterior32. Esta estrella C está compuesta por las hebras "Core" y "Terminal cholesterol" (coloreadas en gris), así como una hebra "Terminal complemento" (mostrada en naranja) y una hebra "Toeholding bridge" (mostrada en verde azulado oscuro). Este último contiene un saliente de seis nucleótidos al que una hebra invasora adecuadamente diseñada puede unirse y posteriormente desplazar por completo la hebra del "puente de sostenimiento del pie", lo que provoca la disociación de la unión central de la nanoestrella (compuesta por el "Núcleo 1, 2, 3 y 4") de los dúplex compuestos por las hebras "Complemento terminal" y "Colesterol terminal". (C) Esquema de una estrella C funcionalizada con una plantilla de ADN para un aptámero de ARN. Este también está compuesto por la hebra de "colesterol terminal" y el "Núcleo 2, 3 y 4" (todos mostrados en gris), así como una versión extendida de la hebra "Core 1" (mostrada en rosa), una hebra "Base" (marrón), una hebra "Puente" (amarillo) y la "plantilla de aptámero" (verde). El dúplex de ADN compuesto por las dos últimas hebras forma la región promotora de la polimerasa T7, que marca el sitio de inicio de la transcripción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66738/66738fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los condensados de estrella C se forman tras el recocido térmico de los oligonucleótidos constituyentes, que en el protocolo presentado aquí se lleva a cabo dentro de capilares de vidrio sellados con una sección transversal rectangular de alta relación de aspecto. Estos recipientes ofrecen múltiples ventajas clave: i) El sellado garantiza que la evaporación se evite por completo durante las etapas de recocido (a veces lentas); ii) La parte inferior plana de calidad óptica de los capilares permite obtener imágenes del transitorio de autoensamblaje (o desmontaje); iii) la alta relación de aspecto de los capilares asegura que los condensados pesados se depositen en un área amplia y plana, lo que reduce las posibilidades de coalescencia y agregación en etapas posteriores del transitorio de autoensamblaje que ocurriría en contenedores en forma de cuña (por ejemplo, tubos de microcentrífuga), y produce poblaciones de condensado relativamente monodispersas; iv) Realizar el recocido en un capilar de vidrio alargado minimiza la exposición de la muestra a interfaces hidrofóbicas (aire, plástico o aceite), que se ha observado que perturban el autoensamblaje al reclutar los oligonucleótidos colesterolizados anfifílicos. Una vez completado el protocolo de montaje, los condensados pueden extraerse de los capilares de vidrio para realizar experimentos posteriores que impliquen reactivos adicionales.

<table><tbody><tr><td>0,22 y mu; m filtros de jeringa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 mm #1.5 Cubreobjetos rectangulares, Menzel Gl&auml; ser</td><td>VWR</td><td>631-0853</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34683</td><td></td></tr><tr><td>6 L Limpiador ultrasónico con temporizador digital y calor, 230 VAC</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-08895-11</td><td></td></tr><tr><td>Araldite Adhesivo Rápido 2 Parte Pegamento Epoxi</td><td>RS</td><td>ARA-400005</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad C1000 termociclador</td><td>Bio-Rad</td> Marca <td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Microcentrífuga 2 mL con tapa de bloqueo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15338665</td><td>Tubos de microcentrífuga de 2 mL para la extracción de condensados C-star</td></tr><tr><td>Rotulador de trazado de diamante</td><td>RS</td><td>394-217</td><td></td></tr><tr><td>Difluoro-4-hidroxibencilideno imidazolidinona (DFHBI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR Clean Colorless Tubos de centrífuga Safe-Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>0030123301</td><td>tubos de microcentrífuga de 0,5 ml para la preparación de mezclas C-star</td></tr><tr><td>Etanol absoluto 99,8+%</td><td>Fisher Scientific</td><td>10437341</td><td>etanol al 70% es suficiente para fines de limpieza</td></tr><tr><td>Fisherbrand ZX4 IR Mezclador de vórtice</td><td>Fisherbrand 13284769</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Capilares rectangulares huecos ID 0,40 x 4,00 mm, 50 mm de longitud</td><td>CM Scientific</td><td>2540-50</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69794</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga, 230 V</td><td>PRISM(TM)</td><td></td><td></td></tr>Z763128 <tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Espectrofotómetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td>Se utiliza para medir la absorbancia de oligonucleótidos para cálculos de concentración</td></tr><tr><td>Oligonucleótidos</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>Las</td><td>secuencias personalizadas de oligonucleótidos son exclusivas del diseño de estrella C requerido.</td></tr><tr><td>ScriptGuard Inhibidor de RNasa</td><td>CELLSCRIPT</td><td>C-SRI6310K</td><td>Inhibidor de RNasa</td></tr><tr><td>T7-FlashScribe Kit de transcripción</td><td>Cambio</td><td>C-ASF3507</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris-EDTA, solución madre 100x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>574793</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada ultrapura sin DNasa/RNasa</td><td>Invitrogen</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>VWR Spec-Wipe 3 Limpiaparabrisas</td><td>VWR</td><td>21914-758</td><td></td></tr></tbody></table>

condensados sintéticos y arquitecturas similares a células a partir de nanoestructuras de adn anfifílico

Synthetic Condensates and Cell-Like Architectures from Amphiphilic DNA Nanostructures

Las gotas y condensados sintéticos se están convirtiendo en constituyentes cada vez más comunes de los sistemas biomiméticos avanzados y las células sintéticas, donde se pueden utilizar para establecer la compartimentación y mantener respuestas similares a las de la vida. Las nanoestructuras de ADN sintético han demostrado un potencial significativo como bloques de construcción formadores de condensado debido a su forma programable, funcionalización química y comportamiento de autoensamblaje. Recientemente hemos demostrado que las "nanoestrellas" de ADN anfifílico, obtenidas mediante el marcaje de uniones de ADN con fracciones hidrofóbicas, constituyen una solución particularmente robusta y versátil. Los condensados de ADN anfifílico resultantes pueden programarse para mostrar arquitecturas internas complejas de múltiples compartimentos, responder estructuralmente a diversos estímulos externos, sintetizar macromoléculas, capturar y liberar cargas útiles, sufrir transformaciones morfológicas e interactuar con células vivas. Aquí, demostramos protocolos para la preparación de condensados de ADN anfifílico a partir de oligonucleótidos de ADN constituyentes. Abordaremos (i) sistemas de un solo componente que forman condensados uniformes, (ii) sistemas de dos componentes que forman condensados de núcleo y (iii) sistemas en los que los condensados se modifican para soportar la transcripción in vitro de nanoestructuras de ARN.

Después del recocido, los condensados de estrella C se pueden obtener imágenes directamente en el tubo capilar, o después de la extracción, para confirmar su formación. Para todas las variaciones de diseño de la estrella C, se deben observar distintos condensados esféricos o poliédricos de aproximadamente 10-50 μm de diámetro, este último se forma cuando se produce la cristalización28,32. En el caso de los condensados de un solo componente, los condensados deben ser discretos y de apariencia uniforme, y pueden parecer poliédricos (Figura 3A) o esféricos (Figura 3B, C) dependiendo del diseño de estrella C utilizado. La morfología de los condensados binarios depende de las propiedades de las poblaciones de estrellas C utilizadas, como se describió anteriormente30. La Figura 3D muestra condensados binarios que exhiben una separación de fases, observable en imágenes de campo claro. La presencia de burbujas de aire en el tubo capilar también puede interferir con el autoensamblaje de los condensados, lo que a menudo resulta en la agregación cerca de la interfaz de aire (Figura 4A, B). Las mezclas preparadas incorrectamente, como las que carecen de componentes de oligonucleótidos o las preparadas con estequiometrías desequilibradas, pueden dar lugar a que los condensados no se formen en absoluto o que formen redes o agregados conectados no esféricos, como se muestra en la Figura 4C. De manera similar, los condensados binarios preparados incorrectamente pueden exhibir agregación y redes, y también pueden exhibir ninguna separación de fase observable, como se muestra en la Figura 4D.
En el caso de la transcripción de aptámeros luminosos de ARN, se observará un resultado satisfactorio mediante el seguimiento del aumento de la fluorescencia del fluorógeno a lo largo del tiempo, por ejemplo, mediante microscopía (Figura 5) o espectrofotometría.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66738/66738fig03.jpg"> Figura 3: Micrografías representativas que muestran condensados de estrella C recocidos. (A) Micrografía de campo claro e incuadro que muestra condensados formados a partir de una estrella C que no responde con una longitud de brazo de 28 pares de bases. Aquí observamos la morfología poliédrica que refleja el orden cristalino de las estrellas Cmás pequeñas 32. (B) Micrografía de campo claro e incuadro que muestra condensados formados a partir de una estrella C sensible a TMSD, con una longitud de brazo de 50 pares de bases. Estos condensados son ampliamente esféricos, aunque muchos muestran una morfología más irregular indicativa de la fusión de múltiples condensados, como se espera para las estrellas C más grandes que tienden a ser más fluidas32. (C) Micrografía de campo claro e incuadro que muestra condensados formados a partir de una estrella C que no responde con una longitud de brazo de 35 pares de bases. Estos condensados parecen esféricos, aunque los datos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño de trabajos anteriores muestran que su microestructura es cristalina32. (D) Micrografía de campo claro e incuadro que muestra condensados binarios formados a partir de una combinación de las poblaciones de estrellas C también utilizadas en los paneles (B) y (C). La combinación de estas dos poblaciones conduce a la formación de condensados con una separación de fases distinta, visible sin marcaje fluorescente. Es posible que otras combinaciones no presenten separación de fases, como se describe en el trabajo anterior30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66738/66738fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66738/66738fig04v2.jpg"> Figura 4: Micrografías que muestran los problemas comunes encontrados con condensados preparados incorrectamente. (A) Micrografías de campo claro que muestran condensados formados a partir de una estrella C que no responde con una longitud de brazo de 28 pares de bases (que se formaron con éxito en la Figura 3A) en presencia de una burbuja de aire en el tubo capilar. El panel está compuesto por dos micrografías cosidas en la línea discontinua roja y muestra la agregación de condensados cerca de la interfaz aérea. (B) Micrografía de campo claro que muestra condensados formados a partir de una estrella C sensible a TMSD de 50 pares de bases de longitud de brazo (que se formaron con éxito en la Figura 3B) en presencia de una burbuja de aire en el tubo capilar. Aquí, los condensados se han fusionado para formar una red interconectada continua debido a la naturaleza más fluida de los condensados compuestos por motivos de estrella C32 más grandes. (C) Micrografía de campo claro que muestra condensados formados a partir de una estrella C que no responde con una longitud de brazo de 35 pares de bases (que se formó con éxito en la Figura 3C). La morfología es irregular y angulosa, lo que indica un error en la preparación, posiblemente estequiometrías desequilibradas. (D) Micrografía de campo claro de condensados binarios formados a partir de una combinación de las poblaciones de estrellas C, como en Fig. 3D. Estos condensados están altamente conectados, como en el panel (C), y además no presentan la separación de fases esperada (ver Figura 3D), lo que indica un error en su preparación. Si bien las fuentes exactas de los errores son difíciles de identificar, las estequiometrías incorrectas o el uso de secuencias de oligonucleótidos incorrectas son causas potenciales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66738/66738fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66738/66738fig05.jpg"> Figura 5: Resultados representativos de la transcripción de una plantilla de ADN incrustada para un aptámero de ARN. Timelapse que muestra la síntesis del aptámero iluminado de brócoli a través de la transcripción de una plantilla de ADN incrustada en condensados hechos a partir del motivo de estrella C descrito en la Figura 1C. El aptámero se une al DFHBI presente en la mezcla de transcripción, induciendo un aumento de la fluorescencia con el tiempo. Notable aquí es un cambio en la morfología del condensado a lo largo del tiempo, que parece formar una estructura de núcleo-caparazón. Es probable que este fenómeno se deba a la hinchazón de la capa externa del condensado debido a un desequilibrio transitorio de la presión osmótica asociado a la producción local del aptámero de ARN. La producción de aptámeros puede ocurrir preferentemente en las capas externas de los condensados debido a la tendencia reportada de la hebra molde de aptámero a acumularse en esta región30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66738/66738fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla complementaria 1: Detalles de secuencia para varios diseños de componentes individuales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66738/Supplementary_Table_1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 2: Volumen de componentes para cada diseño. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66738/Supplementary_Table_2.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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