Name: Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprenda métodos reproducibles para evaluar el compromiso temprano de células T FH específicas de virus en ratones infectados con LCMV agudo. Estas técnicas incluyen citometría de flujo y manipulación génica con vectores retrovirales para optimizar el diseño de vacunas.

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Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 32300785 a X.C.), el Programa Nacional Postdoctoral de China para Talentos Innovadores (No. BX20230449 a X.C.), y el Proyecto Nacional Mayor de Ciencia y Tecnología (No. 2021YFC2300602 a L.Y.).

Descifrando el compromiso temprano de las células T auxiliares foliculares en la infección aguda por LCMV

<ol><li>O'shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+follicular+helper+cell+biology%3A+A+decade+of+discovery+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases.</a> Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).</li>
<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper t cells.</a> Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS+receptor+instructs+T+follicular+helper+cell+versus+effector+cell+differentiation+via+induction+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6.</a> Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+expressing+follicular+helper+CD4+T+cells+are+fate+committed+early+and+have+the+capacity+to+form+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory.</a> J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).</li>
<li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+BLIMP-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEF1+and+TCF1+orchestrate+T%28FH%29+differentiation+by+regulating+differentiation+circuits+upstream+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6.</a> Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF1+is+required+for+the+t+follicular+helper+cell+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection.</a> Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+TCF-1+initiates+the+differentiation+of+T%28FH%29+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection.</a> Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).</li>
<li>Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+control+the+expression+and+activity+of+bcl-6+in+th1+cells+to+regulate+flexibility+with+a+TFH-like+gene+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile.</a> Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).</li>
<li>Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+STAT1+is+required+for+IL-6-mediated+bcl6+induction+for+early+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation.</a> J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+ezh2+primes+the+early+differentiation+of+follicular+helper+T+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection.</a> Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+programs+T%28FH%29+differentiation+by+integrating+phosphorylation-dependent+activation+of+bcl6+and+polycomb-dependent+repression+of+p19ARF%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF.</a> Nat Commun. 9 (1), 5452(2018).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METTL3-dependent+m%286%29A+modification+programs+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 1333(2021).</li>
<li>Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+is+a+potent+negative+regulator+of+TFH+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation.</a> J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+KLF2+restrains+CD4%2B+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation.</a> Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+e3+ubiquitin+ligase+itch+is+required+for+the+differentiation+of+follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells.</a> Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).</li>
<li>Baumjohann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+cluster+mir-17%7E92+promotes+TFH+cell+differentiation+and+represses+subset-inappropriate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression.</a> Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+complex+mTORC2+promotes+the+longevity+of+virus-specific+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+by+preventing+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis.</a> Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).</li>
<li>Hale, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+memory+CD4%2B+T+cells+with+commitment+to+T+follicular+helper-+and+T+helper+1-cell+lineages+are+generated+after+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection.</a> Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenium-GPX4+axis+protects+follicular+helper+t+cells+from+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis.</a> Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).</li>
<li>Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+MHC-class+II-restricted+TCR-transgenic+mice%3A+Effects+on+humoral+and+cellular+immune+responses+after+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection.</a> Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).</li>
<li>Grosjean, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+mouse+splenic+t+cells+for+ex+vivo+and+in+vivo+T+cell+receptor+stimulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100961(2021).</li>
<li>Dowling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+bottom-up+proteomic+analysis+of+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100196(2020).</li>
<li>Choi, Y. S., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+expression+in+TCR+transgenic+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells.</a> Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+expansion+and+retroviral+transduction+of+mouse+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells.</a> J Immunol Methods. 488, 112931(2021).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+CXCR5-+expressing+CD8%28%2B%29+T+cells+curtail+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection.</a> Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+B+helper+T+cells+express+CXC+chemokine+receptor+5%2C+localize+to+B+cell+follicles%2C+and+support+immunoglobulin+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production.</a> J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+mTORC1+promotes+the+generation+and+suppressive+function+of+follicular+regulatory+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells.</a> Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphatase+pten+links+platelets+with+immune+regulatory+functions+of+mouse+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 2762(2022).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+identification+of+T%28fh%2913+cells+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human.</a> J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

La investigación en el campo de las células TFH se ha destacado desde el descubrimiento de la función especializada de las células TFH para ayudar a las células B. Los estudios acumulados indicaron que la diferenciación de las células TFH es un proceso multietapa y multifactorial30, en el que el compromiso con el destino de las células TFH se determina en la etapa temprana5. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a las células TFH diferenciadas tempranamente es crucial para la biología de las células TFH y el diseño racional de vacunas. En este trabajo, proporcionamos métodos para acceder al compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus y para manipular la expresión génica en las células TFH diferenciadas tempranamente mediante la explotación del modelo de infección viral LCMV Armstrong, el ratón SM transgénico TCR y la transducción mediada por retrovirus.
El receptor de quimiocinas CXCR5 es un marcador de superficie importante que distingue a las células TFH de otros subconjuntos de células TH CD4+ 6,7,8,31, por lo que es necesario el método de tinción CXCR5 de alta especificidad y sensibilidad en la investigación de células TFH. En el estudio, se mostró un método de tinción CXCR5 de estreptavidina-biotina de tres pasos para identificar el subconjunto de células TFH (Figura 1C). Aunque la pérdida de especificidad es un problema difícil para los enfoques de tinción de anticuerpos con dos o tres estreptococos de alta sensibilidad, se encontró que la señal de fluorescencia por la tinción de anticuerpos CXCR5 en tres pasos se superponía casi por completo con la señal de GFP en las células T SM CD4+ reporteras de CXCR5-GFP29 en el día 3 después de la infección (Figura 1D), lo que sugiere el logro de tanto la especificidad como la sensibilidad mediante el método de tinción de anticuerpos CXCR5 en tres pasos. De hecho, esta estrategia de tinción de CXCR5 de tres estreptococos está probada y ha ayudado a los investigadores a investigar mejor la biología de las células TFH 11,14,15,21, así como otros tipos de células T que expresan CXCR529,32.
Tras la infección y la inmunización, el compromiso del destino de los linfocitos TFH generalmente se modela mediante una diferenciación bifurcada de los linfocitos T CD4+ vírgenes en linfocitos TFH o linfocitos T H efectores no TFH 2,3,30. Este estudio mostró la bifurcación equilibrada de las células TFH y TH1 en las células T SM CD4+ transferidas. Además, estos linfocitos T SM CD4+ transferidos tienen una cantidad adecuada de células en la etapa temprana de infección, por lo que actúan como un modelo adecuado para estudiar la diferenciación de los linfocitos TFH. Sin duda, la expresión ectópica de Bcl-6 mediada por retrovirus en las células T SM CD4+ transferidas estaba fuertemente sesgada hacia la diferenciación de las células TFH en comparación con la de las células T SM CD4+ de control (86,6% frente a 53,8%) (Figura 3C), lo que está alineado con el informe anterior6 y demuestra aún más la precisión de los protocolos descritos en el estudio. Alternativamente, los protocolos antes mencionados también se pueden aplicar a la eliminación mediada por retrovirus de genes interesados (p. ej., bcl6, Tcf7) en células T SM CD4+ activadas tempranamente11 (datos no mostrados).
Una limitación en el protocolo es el problema del tiempo (más de 2 h en total) y el proceso de múltiples pasos del método de tinción CXCR5 de tres pasos. Alternativamente, también se aplicaron métodos de tinciónde 18,33 o 4,9,34 CXCR5 de dos pasos en la investigación de células T FH. Se justifica una comparación de la especificidad/sensibilidad de estos métodos de tinción CXCR5.
En resumen, el estudio actual proporcionó protocolos para acceder a las células TFH específicas del virus diferenciadas tempranamente y para investigar los genes interesados que potencialmente regulan la diferenciación de las células TFH . Estos protocolos impulsarán las investigaciones sobre el compromiso temprano del destino de las célulasT FH .

Al encontrarse con diferentes patógenos o amenazas, las células T CD4+ ingenuas adaptan sus respuestas inmunitarias diferenciándose en varios subconjuntos de células T (TH) auxiliarescon funciones especializadas. En el escenario de infección viral aguda, una gran parte de las células T CD4+ vírgenes se diferencian en células T auxiliares foliculares (TFH) que proporcionan ayuda a las células B 2,3. A diferencia de otros subconjuntos de células TH CD4+ (por ejemplo, células TH1, TH2, TH9 y TH17), las células TFH expresan un nivel sustancial de CXCR5, que es el receptor de quimiocinas para la quimiocina CXCL13 de las células B, lo que permite que las células TFH migren a los folículos de las células B. En los folículos de las células B, las células TFH ayudan a las células B afines a iniciar y mantener las reacciones del centro germinal, lo que permite una rápida producción de anticuerpos de alta afinidad y una memoria humoral a largo plazo 2,3.
Tras la infección viral aguda, el compromiso temprano del destino de las células TFH específicas del virus ocurre dentro de las 72 h 4,5 y es controlado por el linfoma represor transcripcional de células B-6 (Bcl-6)5,6,7,8, que actúa como el "regulador maestro" que gobierna las decisiones de destino de las células TFH. La deficiencia de Bcl-6 reduce gravemente la diferenciación de las células TFH, mientras que la expresión ectópica de Bcl-6 promueve sustancialmente el compromiso con el destino de las células TFH. Además de Bcl-6, múltiples moléculas están involucradas en la instrucción del compromiso temprano del destino de las células TFH. Los factores de transcripción TCF-1 y LEF-1 inician la diferenciación de las células TFH a través de la inducción de Bcl-6 9,10,11. La inhibición de Blimp1, tanto por Bcl-6 como por TCF-1, es necesaria para el compromiso temprano del destino de las células TFH 11,12. STAT1 y STAT3 también son necesarios para la diferenciación temprana de las células TFH 13. Además, las modificaciones epigenéticas por la histona metiltransferasa EZH214,15 y la m6A metiltransferasa METTL316 ayudan a estabilizar los programas transcripcionales de las células TFH (especialmente Bcl6 y Tcf7) y, por lo tanto, a preparar el compromiso temprano del destino de las célulasT FH. Si bien se han logrado avances, incluidas las moléculas antes mencionadas y otras, resumidas en otra parte3, en la comprensión de las regulaciones transcripcionales y epigenéticas del compromiso temprano del destino de las células TFH, las moléculas previamente desconocidas aún no se han aprendido.
En el modelo murino de infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica aguda (LCMV), las células T CD4+ transgénicas TCR-transgénicas TCR transferidas adoptivamente, que reconocen específicamente el epítopo de la glicoproteína LCMV I-ABGP66-77, experimentan una diferenciación de células TFH o TH1 durante la infección viral. Este patrón de diferenciación de bifurcación TFH/TH1 apoya el avance del modelo de infección por SM/LCMV aguda en el estudio de la biología de las células TFH específicas del virus. De hecho, el modelo de infección por SM/LCMV aguda se ha utilizado ampliamente en el campo de la investigación de células TFH y ha desempeñado un papel crucial en los descubrimientos de hitos en la biología de las células TFH. Esto incluye la identificación del mencionado Bcl-6 como el factor de transcripción que define el linaje de las células TFH 5,6, así como otros factores transcripcionales importantes (por ejemplo, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 y Itch19) que guían la diferenciación de las células TFH, las regulaciones postranscripcionales ( por ejemplo, METTL316 y miR-17~9220) de la diferenciación de los linfocitos TFH, la memoria y plasticidad de los linfocitos TFH 21,22 y las estrategias racionales de vacunación dirigidas a los linfocitos TFH (p. ej., selenio23).
El estudio actual describe métodos reproducibles para acceder al compromiso de destino temprano de las células TFH específicas del virus, que incluyen (1) el establecimiento de un modelo de ratón de quimera SM infectado con LCMV agudo adecuado para acceder a las células TFH diferenciadas tempranamente, (2) la realización de tinciones por citometría de flujo de moléculas relacionadas con las células TFH diferenciadas tempranamente y (3) la realización de manipulación génica basada en vectores retrovirales en SM CD4+ Células T. Estos métodos serán útiles para los estudios que investigan el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus.

<table><tbody><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehído Solución Fija, 4% PFA</td><td>Beyotime</td><td>P0099-500mL</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; filtro de células m</td><td>Merck</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-ratón TCR V&alpha; 2 (clon B20.1)</td><td>Biolegend</td><td>127812</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-ratón CD45.1 (clon A20)</td><td>Biolegend</td><td>110724</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>APC anti-ratón CD25 (clon PC61)</td><td>Biolegend</td><td>101910</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) ratón</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BeaverBeads Estreptavidina</td><td>Beaver</td><td>22321-10</td><td></td></tr><tr><td>Biotina anti-ratón F4/80 Anticuerpo (clon BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123106</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>Biotina Rata anti-ratón CD11c (clon N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>Biotina Rata anti-Ratón CD19 (clon 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clon 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>Biotin Rat anti-ratón NK-1.1 (clon PK136)</td><td>Biolegend</td><td>108704</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>Biotin Rat anti-ratón TER-119/Células eritroides (clon TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina, BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clon 4B10)</td><td>Biolegend</td><td>644816</td><td>dilución 1:100</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-ratón CD279 (PD-1) (clon 29F.1A12)</td><td>Biolegend</td><td>135220</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>Ratón C57BL/6J (B6)</td><td>Ratón</td><td></td> reportero knock-in 000664 <td></td></tr><tr><td>de</td> Jackson Laboratory <td></td><td></td><td>En casa; la línea de ratón knock-in CXCR5-GFP se generó mediante la inserción de una construcción IRES-GFP después del marco de lectura abierto de Cxcr5.</td></tr><tr><td>DMEM 10% medio</td><td></td><td></td><td>DMEM medio que contiene 10% FBS</td></tr><tr><td>Medio</td><td>DMEM Gibco</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>FACSFortesa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, FBS</td><td>Sigma</td><td>F8318</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo (versión 10.4.0)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foxp3/Juego de tampones de tinción de factor de transcripción</td><td>Invitrogen</td><td>00-5523-00</td><td>El kit contiene tres reactivos: a. Concentrado de fijación/permeabilización (4X); b. Diluyente de fijación/permeabilización; c. Tampón de permeabilización.</td></tr><tr><td>Anticuerpo IgG anti-rata de cabra (H + L), biotinilado</td><td>Laboratorios de vectores</td><td>BA-9400-1.5</td><td>Dilución 1:200</td></tr><tr><td>Sistema de imágenes de células automáticas Invitrogen EVOS FL</td> Tampón de aislamiento <td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td><td>FACS que contiene 0,5% de BSA y 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>LCMV GP61-77 péptido (GLKGPDIYKGVYQFKSV)</td><td>Compañía</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>china de péptidosKit de tinción de células muertas en infrarrojo cercano fijable LIVE/DEAD, para excitación de 633 o 635 nm</td><td>Life Technologies</td><td>L10199</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>MigR1</td><td>addgene</td><td>#27490</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medio</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>addgene</td><td>#12371</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-ratón CD69 (clon H1.2F3)</td><td>Biolegend</td><td>104508</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>PE Ratón anti-Bcl-6 (clon K112-91)</td><td>BD Biosciences</td><td>561522</td><td>dilución 1:50</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Solarbio</td><td>H8761</td><td></td></tr><tr><td>Rata purificada Anti-Ratón CXCR5 (clon 2G8)</td><td>BD Biosciences</td><td>551961</td><td>Dilución 1:50</td></tr><tr><td>Rata monoclonal PerCP anti-ratón CD4 (clon RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100538</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>recombinante murino IL-2</td><td>Gibco</td><td>212-12-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Beyotime</td><td>C3702-500mL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 2%</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 medio que contiene 2% Ratón transgénico FBS</td></tr><tr><td>SMARTA (SM) TCR</td><td></td><td></td><td>La línea transgénica SM TCR en nuestro laboratorio es un regalo del Dr. Rafi Ahmed (Universidad de Emory). Además, esta línea de ratones también se puede obtener de The Jackson Laboratory (tinción #: 030450).</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de tinción <td>PBS que contiene 2% de FBS y 0,01% de NaN3</td></tr><tr><td>Estreptavidina, PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td>, <td>dilución 1:200</td></tr>, <tr><td>TCF1/TCF7 (C63D9), mAb de conejo (Alexa Fluor 488 conjugado)&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>6444S</td><td></td></tr><tr>Tampón <td></td><td></td><td>de tinción celular TFH</td> de dilución 1:400 <td>Tampón FACS que contiene 1% de BSA y 2% de suero de ratón</td></tr><tr><td>Reactivo TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIRUMIR2700</td><td></td></tr></tbody></table>

acceso a la diferenciación temprana de células t cd4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con lcmv agudo

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Las células T auxiliares foliculares (TFH) se perciben como un linaje independiente de células T CD4+ que ayuda a las células B afines a producir anticuerpos de alta afinidad, estableciendo así una inmunidad humoral a largo plazo. Durante la infección viral aguda, el compromiso del destino de las células TFH específicas del virus se determina en la fase temprana de infección, y las investigaciones de las células TFH diferenciadas tempranamente son cruciales para comprender la inmunidad humoral dependiente de las células T y optimizar el diseño de la vacuna. En el estudio, utilizando un modelo de ratón de infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica aguda (LCMV) y el ratón transgénico TCR SMARTA (SM) con linfocitos T CD4+ que reconocen específicamente el epítopo de glicoproteína LCMVI-A bGP66-77, describimos procedimientos para acceder al compromiso del destino temprano de los linfocitos TFH específicos del virus basados en tinciones por citometría de flujo. Además, mediante la explotación de la transducción retroviral de células T SM CD4+ , también se proporcionan métodos para manipular la expresión génica en células TFH específicas del virus diferenciadas tempranamente. Por lo tanto, estos métodos ayudarán en los estudios que exploran los mecanismos que subyacen al compromiso temprano de las células TFH específicas del virus.

Características de las células TFH específicas del virus diferenciadas tempranamente durante la infección aguda por LCMV Para probar el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus, las células T SM CD4+ congénitas naïve que reconocen específicamente el epítopo I-ABGP GP66-77 de LCMV se transfirieron adoptivamente a receptores de CD45.2+ C57BL/6. Al día siguiente, estos receptores fueron infectados por vía intravenosa con una dosis alta del LCMV Armstrong resuelto agudamente (Figura 1A). El día 3 después de la infección, los esplenocitos de los receptores de C57BL/6 se analizaron mediante citometría de flujo, y los resultados indicaron una gran cantidad de células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas (~10% del total de células T CD4+) (Figura 1B), lo que proporcionó un número suficiente de células T CD4+ específicas del virus para una mayor investigación. Los análisis posteriores de los linfocitos T SM CD4+ transferidos mostraron la coexpresión de CXCR5 y Bcl-6/TCF-1 y la expresión recíproca de CXCR5 y CD25/T-bet, definiendo así los linajes TFH (CXCR5+Bcl-6+ o CXCR5+TCF-1+) y TH1 (CXCR5-CD25+ o CXCR5-T-bet+) (Figura 1C). Para evaluar la especificidad y sensibilidad de la tinción de anticuerpos CXCR5 presentada en el estudio, cruzamos la línea de ratón CD45.1+ SM antes mencionada con la línea de ratón knock-in CXCR5-GFP, que se generó mediante la inserción de un constructo IRES-GFP después del marco de lectura abierto de Cxcr529. A continuación, las células SM reporteras CD45.1+ CXCR5-GFP se transfirieron a los receptores C57BL/6. Estos receptores se infectaron con LCMV Armstrong y sus esplenocitos se analizaron el día 3 después de la infección. De hecho, la señal de fluorescencia por el método de tinción de anticuerpos CXCR5 en el estudio se superpuso finamente con la señal de GFP en las células T CD4+ CXCR5-GFP reporteras29 SM transferidas el día 3 después de la infección (Figura 1D), lo que indica la alta especificidad del método de tinción de anticuerpos CXCR5 de tres pasos.
Sobreexpresión de Bcl-6 basada en retrovirus en linfocitos T SM CD4+ Bcl-6 es una de las moléculas más importantes en el fomento de la diferenciación de las células TFH 6,7,8. Para determinar la fiabilidad del protocolo actual en el acceso a los linfocitos TFH diferenciados tempranamente, se activaron in vivo linfocitos T CD45.1+ SM CD4+ y se transducieron con sobrenadante retroviral a partir de linfocitos 293T transfectados con plásmido de sobreexpresión MigR1-Bcl6 (Figura 2 y Figura 3A). A continuación, las células T SM CD4+ transducidas por retrovirus se transfirieron adoptivamente a receptores C57BL/6, que luego se infectaron con LCMV Armstrong (Figura 3B). El día 3 después de la infección, encontramos una bifurcación equilibrada de las células TFH yT H1 en las células T MigR1-SM CD4+, mientras que una diferenciación predominante dirigida a las células TFH en las células T MigR1-Bcl6-SM CD4+ (Figura 3C). Consistentemente, el nivel de expresión de Bcl-6 mejoró en las células T MigR1-Bcl6-SM CD4+ en comparación con las células T MigR1-SM CD4+ (Figura 3D). Por lo tanto, el fenotipo que expresa la diferenciación 6 de las células TFH 6 ectópicas de Bcl-6 se reprodujo finamente siguiendo el protocolo actual.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig01.jpg"> Figura 1: Análisis de citometría de flujo del compromiso del destino temprano de las células SM TFH durante la infección por LCMV Armstrong. (A) Diseño experimental. Las células T esplénicas CD4+ se recolectaron de ratones CD45.1+ SM y luego se transfirieron adoptivamente a receptores C57BL/6 (CD45.2+). Al día siguiente, estos receptores se infectaron con LCMV Armstrong. El día 3 después de la infección, las células CD45.1+ SM transferidas desde el bazo de los receptores se analizaron mediante citometría de flujo. (B) Datos representativos de citometría de flujo que muestran la estrategia de activación de las células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas desde el bazo de los receptores en el día 3 después de la infección por LCMV Armstrong. (C) Datos representativos de citometría de flujo que muestran tinciones conjuntas de CXCR5 y otras moléculas asociadas a células TFH (Bcl-6, TCF-1, CD25 y T-bet) en células CD45.1+ SM transferidas desde el bazo de los receptores en el día 3 después de la infección por LCMV Armstrong. (D) Datos representativos de citometría de flujo que muestran tinciones conjuntas de anticuerpos conjugados con fluorescencia contra la señal CXCR5 y GFP en células SM reporteras CD45.1+ CXCR5-GFP transferidas desde el bazo de los receptores en el día 3 después de la infección por LCMV Armstrong. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig02.jpg"> Figura 2: Transducción retroviral en linfocitos T SM CD4+ . (A) Diagrama esquemático de la producción de retrovirus y la transducción retroviral en células T SM CD4+ . Para la producción de retrovirus, las células 293T sembradas en una placa de 6 pocillos se transfectaron con plásmidos de ADN objetivo cuando la densidad celular alcanzó el ≥80% de confluencia. A continuación, se recolectó el sobrenadante de cultivo celular que contenía retrovirus 72 h después de la transfección e inmediatamente se utilizó o almacenó a -80 °C. Para la transducción retroviral en células T SM CD4+ , se inyectó por vía intravenosa a un ratón CD45.1+ SM 200 μg de péptido LCMV GP61-77 . A continuación, se diseccionó el bazo de un ratón SM 16-18 h después de la inyección de péptidos, y se detectó el estado de activación de las células T CD4+ esplénicas. Los linfocitos T SM CD4+ activados se transducieron con un sobrenadante de cultivo que contenía retrovirus y se cultivaron in vitro durante 48 h antes de alcanzar la eficiencia de la transducción. (B) Imágenes de microscopía de fluorescencia de GFP en células 293T transfectadas con ADN plasmídico. Barra de escala: 400 μm. (C) Análisis por citometría de flujo de los niveles de expresión de CD25 y CD69 en linfocitos T CD4+ naïve esplénicos de ratón naïve (naïve, izquierda) o linfocitos T CD4+ SM esplénicos de ratón SM inyectado con péptido LCMV GP61-77 (activado, derecha). (D) Análisis por citometría de flujo de la expresión de GFP en células T SM CD4+ transducidas con retrovirus (transducidas, izquierda) o células T SM CD4+ no transducidas con retrovirus (no transducidas, izquierda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig03.jpg"> Figura 3: Efectos de la sobreexpresión de Bcl-6 en el compromiso con el destino de las células SM TFH. (A) Mapas lineales de las redes troncales retrovirales de MigR1 (panel superior) y el vector MigR1 modificado con la región Bcl6 CDS en la parte superior de IRES-GFP (MigR1-Bcl6) (panel inferior). (B) Diseño experimental. Las células T SM CD4+ transducidas con MigR1 o MigR1-Bcl6 se transfirieron adoptivamente a receptores C57BL/6 (CD45.2+) un día antes de LCMV Armstrong. El día 3 después de la infección, las células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas desde el bazo de los receptores se analizaron mediante citometría de flujo. (C) Análisis de citometría de flujo de CXCR5 y CD25 en células T GFP+ SM transducidas con transducción MigR1 o MigR1-Bcl6. Los números adyacentes a la puerta indican las frecuencias de las células TFH en las células T SM CD4+. (D) Análisis por citometría de flujo del nivel de expresión de Bcl-6 en células T SM CD4+ transducidas con MigR1 o MigR1-Bcl6. MFI: intensidad media de fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El estudio actual muestra protocolos para evaluar el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus y manipular la expresión génica en estas células.

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

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Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo (Video) | JoVE Journal

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4⁺ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

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