Name: Un ensayo in vitro para estudiar la migración plaquetaria utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Aprende a estudiar la migración plaquetaria in vitro utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD. Este ensayo permite visualizar cómo las plaquetas generan fuerzas mecánicas para romper enlaces adhesivos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Obtención de imágenes de la migración de plaquetas individuales mediante un sistema de recubrimiento de tres capas

<ol><li>Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+thrombosis--insidious%2C+unpredictable+and+deadly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Arterial thrombosis--insidious, unpredictable and deadly.</a> Nat Med. 17, 1423-1436 (2011).</li>
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<li>Fan, S., Lorenz, M., Massberg, S., Gaertner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+migration+and+bacterial+trapping+assay+underflow%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Platelet migration and bacterial trapping assay underflow.</a> Bio-Protocol. 8 (18), e3018(2018).</li>
<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+A+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: A physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Palecek, S. P., Loftus, J. C., Ginsberg, M. H., Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-ligand+binding+properties+govern+cell+migration+speed+through+cell-substratum+adhesiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrin-ligand binding properties govern cell migration speed through cell-substratum adhesiveness.</a> Nature. 385, 537(1997).</li>
<li>Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+integrin+tension+and+cellular+force+at+submicron+resolution+with+an+integrative+tension+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor.</a> J Vis Exp. (146), e59476(2019).</li>
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<table><tbody><tr><td>Adenosina 5&prime;-difosfato sódico sal (ADP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 faloidina&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>Contador de sangre</td><td>Sysmex</td><td>XN-1000</td><td></td></tr><tr><td>Bottomless 6 canales sticky slide</td><td>IBIDI, sticky slides VI0.4</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(Biotin-PEG-PEG)]</td><td>Péptido internacional</td><td>PCI-3697-PI</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubos</td><td>Corning Brand&nbsp;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>FITC conjugado neutravidina</td><td>Thermofisher</td><td>A2662</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Solución HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase y epifluorescente</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Diener</td><td>116531</td><td></td></tr><tr><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotina(50%)</td><td>Susos</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotina (50%)</td><td></td></tr><tr><td>Poli(L-lisina)- injerto de poli(etilenglicol) copolímero</td><td>Susos PLL</td><td>(20)-g[3.5]-PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de prostaglandina I2 (PGI2)</td><td>Abcam</td><td>ab120912</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador</td><td>BANDELIN</td><td>SONNOREX RK514M</td><td></td></tr><tr><td>Ttriton X-100 20% v/v</td><td>Cayman Chemical&nbsp;</td><td></td><td></td>600217</tr><tr><td>U46619</td><td>Enzo Ciencias de la Vida</td><td>BML-PG023-0001)</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo in vitro para estudiar la migración plaquetaria utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con rgd

An In Vitro Assay to Study Platelet Migration Using RGD-Functionalized Avidin-Biotin Tethers

Las plaquetas activadas se adhieren y diseminan fácilmente en portaobjetos recubiertos de PLL-PEG-biotina-neutravidina-FITC-biotina-cRGD (Figura 1C y Figura 2A; 0 min y 5 min) y posteriormente se polarizan formando un laminupidio en el borde delantero (Figura 2A; 10 min). Durante este proceso, el pseudonúcleo (área oscura en el centro de las plaquetas) se movió del centro a la parte posterior de la plaqueta (Figura 2A). Luego, las plaquetas polarizadas comienzan a migrar sin direccionalidad obvia (Figura 2A; 15 min y 20 min y Figura 2B). Observamos que las plaquetas que migran en los recubrimientos PLL-PEG-biotina-neutravidina-FITC-biotina-cRGD pueden romper el enlace neutravidina-FITC-biotina-PLL-PEG, como lo demuestra la reducción de la intensidad de fluorescencia a lo largo del camino de migración (Figura 1C y Figura 2A, B). Además, el complejo neutravidina-FITC-biotina-cRGD interrumpido se acumula en la superficie plaquetaria (Figura 2A,B). Este fenómeno es similar a los hallazgos previos, donde las plaquetas migratorias eliminaron el fibrinógeno del sustrato y lo acumularon dentro de su sistema canalicular abierto (OCS)4.
Para investigar cómo la densidad del ligando influye en la migración plaquetaria, se ajustó la densidad de cRGD variando la proporción de PLL-PEG-biotina a PLL-PEG en la primera capa de recubrimiento. Estos datos revelan que las plaquetas de ratón alcanzan una migración óptima a una concentración del 2,5% de PLL-PEG-biotina. La migración se reduce tanto a las concentraciones más bajas (1%) como a las más altas (10%) de PLL-PEG-biotina (Figura 3A,B). Estos cambios en el comportamiento migratorio dependientes del sustrato se acompañan de alteraciones en la morfología plaquetaria (Figura 3C). A bajas densidades de ligandos (1%), las plaquetas no se diseminan adecuadamente, como lo demuestra un área y un perímetro plaquetarios proyectados bajos (Figura 3C). Esto sugiere una activación insuficiente de integrinas y una señalización de afuera hacia adentro7. En consecuencia, las plaquetas no pueden ejercer fuerzas sobre los ligandos cRGD, no logran remodelar el sustrato y no migran (Figura 3A,B).
A una densidad de ligando intermedia (2,5%), se produce un aumento significativo del área y el perímetro plaquetario (Figura 3C). Las plaquetas se propagan eficazmente, interrumpiendo mecánicamente los ligandos lábiles de cRGD, y migran (Figura 3A,B). Sin embargo, a altas densidades de ligandos (10%), aunque la dispersión aumenta, las plaquetas no se polarizan, lo que se indica por una relación de aspecto reducida (Figura 3C). En estas condiciones, las plaquetas permanecen adheridas al sustrato pegajoso y no migran porque no pueden romper los ligandos cRGD lábiles (Figura 3A,B).
Estos hallazgos demuestran que la migración plaquetaria depende críticamente de las propiedades adhesivas del sustrato. Las plaquetas solo pueden migrar cuando se involucran lo suficiente con los ligandos adhesivos y, al mismo tiempo, generan fuerzas de tracción lo suficientemente fuertes como para superar la tolerancia a la tensión del sustrato adhesivo 4,6,7,8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig01.jpg"> 
Figura 1: Procedimiento de recubrimiento e imágenes en vivo de la interacción plaqueta-sustrato. (A) Fotografía de la cámara ensamblada. B) Principio del protocolo. Izquierda: Esquema del recubrimiento. Los cubreobjetos de vidrio tratados con plasma se recubrieron con tres capas. La primera capa es la mezcla de PLL-PEG y PLL-PEG-biotina (la columna vertebral de PLL-PEG es inerte a las células y evita la unión inespecífica). La segunda capa es neutravidina-FITC, y la tercera capa es biotina-cRGD. Neutravidin-FITC une PLL-PEG-biotina y biotina-cRGD. Las plaquetas se unen a la biotina-cRGD a través de integrinas en la membrana plasmática. Derecha: Ilustración de la unión de biotina-avidina por integrinas plaquetarias. Las plaquetas ejercen fuerzas sobre el sustrato a través de la unión de la integrina-cRGD y rompen el enlace superior cRGD-biotina - neutravidina-FITC - o el enlace inferior neutravidin-FITC - PLL-PEG-BIOTINA - . La ruptura del enlace inferior entre la neutravidina-FITC y la biotina-PLL-PEG da lugar a una reducción de la señal fluorescente, mientras que la ruptura del enlace superior entre la biotina-cRGD y la neutravidina-FITC no lo hace. (C) Series temporales que muestran la migración de plaquetas y la depleción de los ligandos lábiles de cRGD. Las áreas de fluorescencia reducida indican las trayectorias de migración de las plaquetas (véase también la Figura 2A), y las áreas de fluorescencia aumentada indican la acumulación de FTIC-neutravidina-biotina-cRGD en las plaquetas migratorias. Barra de escala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig02.jpg"> 
Figura 2: Imagen de inmunofluorescencia de la migración plaquetaria codificada por el sustrato remodelado. (A) Secuencia de película representativa de la migración de plaquetas individuales. Izquierda: Imágenes de contraste de fase de plaquetas en migración. Las plaquetas se polarizan formando un laminipidio en el borde delantero y posteriormente migran. Derecha: La neutravidina-FITC se retiró del sustrato, dejando la "huella" de la migración plaquetaria. La ruptura de la cRGD-biotina-neutravidina-FITC se acumula en el centro de las plaquetas en migración. (B) Imágenes representativas de la migración plaquetaria en recubrimientos de ligando lábil cRGD-biotina-avidina. Superior: Las plaquetas teñidas con faloidina (Alexa FluorTM 594) mostraron una gran formación de laminupidio y una forma polarizada que recuerda a las plaquetas en migración. Las plaquetas migratorias rompen el enlace cRGD-biotina-neutravidina-FITC, generando vías de migración en el sustrato indicadas por la reducción de la señal FITC. Inferior: imagen recortada con mayor aumento. (C) Las huellas migratorias se dibujaron manualmente en Fiji con líneas amarillas. Barras de escala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66757/66757fig03.jpg"> 
Figura 3: La proporción de PLL-PEG-biotina a PLL-PEG determina la migración y la forma de las plaquetas. (A) Imágenes representativas de plaquetas en recubrimientos de PLL-PEG-biotina al 1%, 2,5% y 10%, barra de escala: 5 μm. (B) Cuantificación de la adhesión plaquetaria, la eficiencia de migración y la distancia de migración, n = 4 experimentos independientes; Media/DE; ANOVA de un factor/Tukey; **p &lt; 0,01; p &lt; 0,001; p &lt; 0,0001, ns: no significativo (C) Cuantificación de los descriptores de forma plaquetaria (área, perímetro, circularidad y relación de aspecto), n = 4 experimentos independientes; Media/Mín.-Máx.; ANOVA de un factor/Tukey; **p &lt; 0,01; p &lt; 0,001; P &lt; 0,0001, ns: no significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66757/66757fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Un ensayo in vitro para estudiar la migración plaquetaria utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD

Despite being anucleated cell fragments, platelets are now widely recognized for their multifaceted abilities. Not only do they form blood clots to ...

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Un ensayo in vitro para estudiar la migración plaquetaria utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD

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