Un ensayo in vitro para estudiar la migración plaquetaria utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD

Las plaquetas son cruciales para prevenir la pérdida de sangre después de una lesión de los vasos, combatir las infecciones y mantener la integridad vascular durante la inflamación. Si bien los tapones hemostáticos requieren la activación y agregación colectiva de plaquetas, su papel en la protección de los vasos sanguíneos inflamados se realiza a nivel de una sola célula. En este contexto, estudios recientes han encontrado que las plaquetas pueden migrar de forma autónoma, un proceso que depende de la mecanodetección de su microambiente adhesivo.

Este enfoque permite un control preciso de las propiedades adhesivas del sustrato y sirve como un ensayo in vitro simple para estudiar los mecanismos subyacentes a la migración de plaquetas. Los resultados indican que la migración de las plaquetas que se une a los ligandos de integrina puede ejercer una fuerza capaz de interrumpir el enlace avidina-biotina. Este ensayo proporciona un método sencillo y fiable para visualizar la migración de plaquetas.

Combinado con imágenes de células vivas, nos ayudará a comprender mejor la interacción y la regulación de los diferentes componentes del citoesqueleto en esta importante función plaquetaria. Para empezar, la cubierta de vidrio del sonicateto desliza ácido nítrico al 20% durante un minuto, seguido de la sonicación en isopropanol, etanol y agua durante un minuto cada uno. Trate los cubreobjetos prelimpios con plasma de oxígeno en un limpiador de plasma durante dos minutos, luego móntelos con portaobjetos adhesivos.

Ahora llene el canal con 2,5 microlitros de PLL-PEG-biotina diluida en 97,5 microlitros de PLL-PEG e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego lave tres veces con PBS. A continuación, agregue 100 microlitros de neutravidina-FITC e incube durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, luego lave tres veces con PBS. Por último, añadir 100 microlitros de biotina cyclo-RGD, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y lavar tres veces con PBS.

Después de anestesiar al ratón y extraer la piel torácica, inserte la aguja entre la segunda y la tercera costilla en el lado izquierdo del esternón para extraer sangre del corazón. Mezclar la sangre con un mililitro de tampón Tyrode y centrifugar a 70 g durante 20 minutos a temperatura ambiente con el freno apagado, luego tomar la parte superior que contiene plasma rico en plaquetas. Mezclar con tres mililitros de tampón Tyrode y añadir 100 nanogramos por mililitro de prostaciclina para evitar la activación plaquetaria.

A continuación, centrifugar a 1200 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón Tyrode. Luego, con un hemocitómetro, mida los recuentos de plaquetas.

Para empezar, tome plaquetas de ratón en canales de recubrimiento de biotina-neutravidina-biotina cRGD y registre la migración de plaquetas vivas utilizando un microscopio invertido equipado con una incubadora de etapas. Para contar los números de adhesión o migración de plaquetas, haga clic con el botón derecho en el menú desplegable de la herramienta de punto en la barra de herramientas y seleccione la herramienta multipunto. Extraiga la distancia de migración de muestras fijas midiendo la longitud de la ruta de migración impresa en el recubrimiento de neutravidina-FITC.

Haga clic derecho en el menú desplegable de la herramienta de línea recta en la barra de herramientas y seleccione la herramienta de línea manual gratuita. Para cuantificar la forma de las plaquetas, seleccione Imagen, Ajustar y Umbral en la barra de herramientas para generar máscaras binarias segmentando las plaquetas fluorescentes. Seleccione descriptores de forma en Analizar y Establecer medidas y, a continuación, seleccione Mostrar resultados mediante Analizar y Analizar partículas.

Las plaquetas mostraron una migración óptima al 2,5% de concentración de PLL-PEG-biotina. La migración se redujo tanto a las densidades de ligandos más bajas como a las más altas. Las plaquetas se diseminan inadecuadamente a una densidad de ligando del 1%, indicada por un área y un perímetro bajos, lo que sugiere una activación insuficiente de las integrinas.

Con una densidad de ligandos del 2,5%, las plaquetas se propagan eficazmente, interrumpiendo los ligandos cRGD y migrando. La alta densidad de ligandos hizo que las plaquetas se extendieran sin polarización, lo que redujo la migración debido a la imposibilidad de romper los ligandos cRGD.