Diagnóstico postmortem de la rabia en animales mediante el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa LN34 en tiempo real multiplexado actualizado

La rabia es cien por cien mortal y se requiere un diagnóstico rápido y preciso para conseguir un tratamiento que salva vidas a quienes más lo necesitan. Las pruebas de laboratorio fiables son realmente cruciales para el control de la rabia. Los CDC han desarrollado un protocolo paso a paso para la prueba de la rabia mediante PCR cuantitativa de transcriptasa inversa o RT-PCR, utilizando una prueba validada en tiempo real del virus Alisa llamada LN34, que permite a los laboratorios mejorar la precisión diagnóstica y apoyar los esfuerzos de prevención de la rabia.

Durante décadas, las pruebas de rabia se basaron en las pruebas directas de anticuerpos de fluorescencia llamadas DFA o FAT. Sin embargo, muchos laboratorios internacionales también utilizan RT-PCR para pruebas de rabia debido a su excelente sensibilidad y precisión. La prueba DFA para la rabia requiere microscopios especializados, almacenamiento en cadena de frío, formación especializada del personal y los reactivos han experimentado escasez en los últimos años; la PCR y la RT-PCR se utilizan ampliamente para la prueba de patógenos.

Muchos laboratorios ya cuentan con equipos y experiencia de PCR y RT-PCR, y los reactivos necesarios están disponibles en proveedores comerciales. El coste es una barrera importante para las pruebas de rabia en las zonas con más casos humanos. El CDC desarrolló una forma multiplex del ensayo LN34, que mejora los controles de calidad y reduce el coste por muestra analizada.

La RT-PCR se está implementando cada vez más para el diagnóstico de la rabia porque se utiliza ampliamente para analizar otros patógenos y los resultados son fáciles de interpretar. Pero usar una prueba validada es extremadamente importante, y asegurarse de que la prueba funciona como se espera es igualmente crucial. Nuestro protocolo paso a paso incluye controles de calidad, consideraciones de seguridad y mejores prácticas de PCR para ayudar a los laboratorios a empezar.

Para empezar, lleva equipo de protección personal, incluyendo gafas de seguridad, una bata cerrada en la parte delantera y dos pares de guantes. Limpia y desinfecta la superficie de trabajo con compuesto de amonio cuaternario u otro desinfectante adecuado para inactivar el virus de la rabia. Coloca una almohadilla absorbente forrada de plástico sobre la superficie de trabajo, usando un tejido colector de bisturí limpio y de un solo uso que represente la sección transversal completa del tronco encefálico y el cerebelo.

Para la homogeneización y extracción de ARN, finalmente, tritura los tejidos necesarios usando un bisturí de un solo uso. Unta el tejido picada con un hisopo y transfiere el hisopo a un tubo prellenado con buffer de homogeneización y perlas. Después de desechar el guante exterior con desinfectante QAC diluido 1:256, limpia y desinfecta la estación de trabajo, el equipo y el exterior de los tubos de muestra.

Homogeneiza las muestras con un mini batidor de cuentas durante 60 segundos. Y revisa visualmente los tubos. Deja reposar las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Finalmente, limpia y desinfecta la estación de trabajo, el equipo y el exterior de los tubos de muestra con desinfectante QAC antes de proceder a la extracción de ARN. Para empezar, realiza la descontaminación superficial del gabinete de seguridad biológica usando QAC diluido a 1:256. Realiza una limpieza adicional para eliminar el polvo u otros contaminantes ambientales.

Coloca una almohadilla absorbente forrada de plástico sobre la plataforma de trabajo. Luego, coloca los reactivos y las muestras en el armario de bioseguridad. Coloca todos los tubos de recogida en una estantería limpia para los tubos de microcentrífuga.

Prellena un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con 300 microlitros de etanol al 100% para cada muestra de cerebro. Centrifugar las muestras homogeneizadas de lámina cerebral a 10.000 a 16.000 G durante dos minutos en una microcentrífuga de mesa. Transfiere el sobrenadante rosa transparente a un nuevo tubo estéril que contenga 100% etanol, pipetear arriba y abajo para mezclar y transferir 600 microlitros de la mezcla de sobrenadante de etanol a una columna de centrifugación en un tubo de recogida.

Centrifugar durante un minuto hasta que el líquido pase por la columna, descartar el flujo y transferir cada columna a un nuevo tubo de recogida. Añade 400 microlitros de tampón de pre-lavado de ARN a cada columna. Centrifugar la mezcla a 10.000 a 16.000 G durante 30 segundos y descartar el flujo a través.

Devuelve cada columna al mismo tubo de recogida y repite el paso de prelavado una segunda vez. A continuación, añade 700 microlitros de tampón de lavado de ARN a cada columna. Centrifugar a 10.000 a 16.000 G durante dos minutos.

Y transfiere cuidadosamente a un tubo libre de RNasa. Descarta el flujo y el tubo de recogida, luego quita y descarta los guantes exteriores. Ahora añade 50 microlitros de DNasa y agua libre de RNasa directamente a la matriz de columna e incuba durante 30 segundos.

Luego centrifugar a 10.000 a 16.000 G durante un minuto. Transfiere cuidadosamente el ARN a un nuevo tubo microcentrífuga con tapa plana y tornillo para el ensayo RT-PCR. Para empezar, descongela un paso de tampón RT-PCR, sin control de plantilla, agua libre de nucleasa, cebadores y sondas sobre hielo, en el espacio de preparación de la mezcla maestra.

Coloca una enzima RT-PCR de paso sobre hielo. Calcula el volumen de cada reactivo para las mezclas multiplexadas LN34 y beta A Master. Designa los pozos para cada muestra en triplicado para el ensayo multiplexado LN34 usando un mapa de placas de 96 pozos.

Tras el vórtice y el centrifugado, dispensar 23 microlitros de mezcla maestra multiplex LN34 en cada pozo asignado LN34. Para establecer reacciones de control de plantilla negativa, añadir dos microlitros de agua de grado PCR en cada pozo de control de plantilla negativa. Coloca la placa de 96 pozos sobre hielo.

Limpia la estación de trabajo con etanol al 70%. Ahora, en el espacio de trabajo de la edición plantilla, muestras de ARN de descongelación y alícuota de ARN artificial de un solo uso, control positivo, sobre hielo. Tras el vórtice, centrifuga brevemente tubos que contienen muestras de ARN, pipetea dos microlitros de muestra o ARN de control positivo en el pozo correspondiente.

Después de añadir todas las muestras, coloca la cubierta adhesiva óptica sobre los pozos para sellarlos completamente. Centrifuga la placa a 500 G durante un minuto a temperatura ambiente, coloca la placa sellada en un instrumento de PCR en tiempo real o cuantitativo calibrado para chips de reporteros Hex de familia y VIC. Ajusta el instrumento a los parámetros de ciclo adecuados.

Una vez finalizada la ejecución, fija los valores umbral en 0,2 para LN34 y 0,05 para la actina beta. Revisa las curvas de muestra de control por si hay problemas de calidad. El ensayo LN34 mostró curvas de amplificación exitosas con resultados positivos que cruzaron el umbral en valores específicos del umbral del ciclo cuando se observan en una escala logarítmica.

Y curvas de amplificación sigmoide a escala lineal tanto para LN34 como para beta actina. Los resultados negativos mostraron líneas planas sin amplificación. Se identificaron curvas de amplificación anormales, algunas mostrando aumentos lineales en lugar de sigmoidales en la fluorescencia, lo que indica resultados atípicos.

Los gráficos multicomponentes correspondientes mostraron señales fluorescentes onduladas irregulares en lugar de curvas suaves esperadas. Destacando la necesidad de analizar gráficos de amplificación en lugar de depender únicamente de los valores umbral del ciclo.