Name: Biselado húmedo de agujas de microinyección que utiliza presión de aire constante para obtener información sobre la apertura de la aguja (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprenda el biselado neumático de agujas de borosilicato para microinyección en insectos genéticamente modificados. Este método permite controlar con precisión el tamaño de la apertura mediante presión de aire constante, garantizando agujas afiladas y de calidad consistente para aplicaciones de biología molecular.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo para el biselado húmedo de agujas de microinyección a presión de aire constante

<ol><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+Element+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li>
<li>O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+systems+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation systems in insects.</a> Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+Transgenesis%3A+Methods+and+Applications%22">Insect Transgenesis: Methods and Applications</a>. , CRC Press. Boca Rato. (2000).</li>
<li>Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrell%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).</li>
<li>Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable%2C+germ-line+transformation+of+Culex+Quinquefasciatus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).</li>
<li>Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+transgenesis+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transformation+of+the+South+American+malaria+vector%2C+Anopheles+albimanus%2C+with+a+piggyBac%2FEGFP+transposon+vector+is+routine+and+highly+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient.</a> Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).</li>
<li>Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+embryo+microinjection+under+halocarbon+oil+or+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+The+immune+deficiency+pathway+impacts+vector+competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major.</a> mBio. 10 (4), e01941(2019).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html">https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html</a> (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microcapilares de diámetro exterior de 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments Aceite</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>pedestal biselador</td><td>Sutter Instruments</td><td>008</td><td></td></tr><tr><td>Clip de guardabarros de bicicleta</td><td>VeloOrange</td><td>R-clip Paquete de 4</td><td>https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack</td></tr><tr><td>Microscopio de soporte de brazo</td><td>AmScope</td><td></td><td>AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Microscopio estereoscópico o </td></tr><tr><td>equivalente BV-10 Biseladora</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Placa abrasiva de diamante&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>104F</td><td>Placa abrasiva de diamante - extrafina (tamaños de punta de 0,2 y micro; a 1,0 y micro)</td></tr><tr><td>Junta, Buna-N</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>11761-2-pkg</td><td>Se utiliza para sellar la conexión en conectores T&nbsp; o L, si aún no está incluido con estas piezas</td></tr><tr><td>Abrazadera de manguera</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>5000-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>Conector de manguera</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>CT4-pkg</td><td>Necesita 5 conectores de manguera Portaagujas</td></tr> para <tr><td>microinyección</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH3-10</td><td>Portaagujas para microcapilares de 1 mm de diámetro exterior</td></tr><tr><td>P-2000</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Cualquier extractor de agujas</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 Solution</td><td>B& H Foto, Vídeo y Audio</td><td>BH #KOPF200P&nbsp; MFR #1464510</td><td>agente humectante</td></tr><tr><td>Manómetro</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>PG-100</td><td>Calibre de 0-100 psi</td></tr><tr><td>Mecha de referencia</td><td>Sutter Instruments</td><td>X050300</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de mecha de referencia</td><td>Sutter</td><td></td> Instruments M100019 <td></td></tr><tr><td>Regulador</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>01-Mar</td><td>Necesidad de puertos #10-32 para conexiones Hoja de</td></tr><tr><td>embalaje de caucho 6 inx 6 en</td><td>Danco</td><td>Modelo # 59849</td><td></td></tr><tr><td>T fitting</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>15002-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>Barra</td><td></td><td></td> roscada <td>Ya sea una varilla roscada o una barra con extremo roscado. Los subprocesos deben ser 10-32.</td></tr><tr><td>Tubo de uretano</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>URH1-0804-BLT-050</td><td></td></tr></tbody></table>

biselado húmedo de agujas de microinyección que utiliza presión de aire constante para obtener información sobre la apertura de la aguja

Wet Beveling of Microinjection Needles Utilizing Constant Air Pressure for Feedback on Needle Opening

El procedimiento descrito anteriormente produce agujas de microinyección consistentemente afiladas. Las agujas afiladas se caracterizan por ser capaces de insertarse en embriones blandos de insectos corion, como los embriones de mosquitos, con poca o ninguna resistencia de la membrana embrionaria. Cuando los embriones de mosquito se microinyectan para la modificación genética, la membrana embrionaria es relativamente elástica. Empujar una aguja desafilada contra la membrana del embrión hará que se hunda (Figura 4B). Cuando se retira la aguja, la membrana recupera su forma. Con suficiente presión, la aguja desafilada eventualmente romperá la membrana y es probable que el embrioplasma se escape. Cuanto más afilada es la aguja, menos hendidura se produce a medida que la aguja se presiona contra la membrana embrionaria (Figura 4E). En lugar de desgarrar la membrana, una aguja afilada se deslizará a través de la membrana, causando poco o ningún daño al embrión. Con una aguja ideal, casi no habrá hendiduras en la membrana embrionaria a medida que la aguja se desliza dentro del embrión.
El Centro de Transformación de Insectos de la Universidad de Maryland (UM-ITF) es un centro de servicios que crea insectos genéticamente modificados para clientes del mundo académico y la industria. La instalación utiliza agujas biseladas para la microinyección de embriones de mosquitos. Durante el periodo comprendido entre enero de 2023 y diciembre de 2023, la UM-ITF inyectó 12.795 embriones de Aedes en 56 proyectos clientes (Tabla 1). El uso de agujas biseladas ayudó a la UM-ITF a mantener un promedio de eclosión posterior a la inyección del 31% en todos los proyectos (Tabla 2). Además, la UM-ITF fue capaz de mantener una tasa de éxito de inyección del 96%, según lo determinado por el seguimiento posterior al proyecto con los clientes (Tabla 2). El éxito de la inyección es una medida de si los materiales de inyección (guías CRISPR, proteína Cas9, plásmidos vectoriales de transposones, etc.) inyectados se entregaron en los embriones del proyecto de una manera en la que estos materiales pudieron crear una modificación genética, básicamente, si hubo evidencia de creación de CRISPR Indel, inserción del vector basado en transposones de los clientes o inserción de un vector de control de calidad de inyección (el transposón termina con un promotor más un marcador). En otras palabras, si las inyecciones eran lo suficientemente buenas como para producir una modificación genética, si los componentes inyectados funcionaban correctamente. Hay muchos factores que contribuyen al éxito de un proyecto de modificación genética, y las microinyecciones de calidad con agujas afiladas son un factor clave de éxito. El biselado de las agujas utilizando el procedimiento descrito en el protocolo anterior permite a la UM-ITF producir agujas de microinyección afiladas de calidad de manera consistente, lo que permite que la UM-ITF administre inyecciones exitosas de manera consistente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama esquemático de los componentes del sistema de aire y conexión al microcapilar. El aire se suministra a la aguja capilar a través de un sistema de tubos de uretano desde un suministro de aire (ya sea aire de la casa o cilindro de aire). Los tubos de uretano están conectados al regulador (R) y al mango de presión mediante conexiones de manguera (HC), que constan de un conector de manguera y una abrazadera de manguera. La conexión de la manguera se atornilla en una conexión hembra de rosca 10-32 en la base del regulador (R) y el manómetro. Un conector T (T) se conecta al regulador (R) para esparcir el aire entre el manómetro y el soporte de la aguja (NH). El tubo de uretano está conectado al portaagujas mediante un conector luer (LC) que se suministra con el portaagujas (NH). La conexión al suministro de aire variará en función del suministro de aire utilizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig02.jpg"> Figura 2: Piezas del manipulador y configuración de aire. Partes del manipulador: a. perilla de ajuste grueso, b. perilla de ajuste fino, c. pinza, d. soporte de aguja WPI, e. medidor de ángulo, f. abrazadera de retención y clip de guardabarros de bicicleta, g. adaptador luer y conector de manguera luer, y h. tubo de uretano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig03.jpg"> Figura 3: Colocación de la aguja en relación con la rotación de la placa abrasiva. (A) Colocación adecuada de la aguja durante el biselado. La aguja a biselar debe colocarse en la placa abrasiva giratoria orientada en algún lugar entre perpendicular a la rotación y en línea con la rotación, donde la rotación se aleja de la punta de la aguja. (B) Colocación incorrecta de la aguja. La rotación de la placa abrasiva en esta orientación hace que la superficie de la placa abrasiva empuje hacia la punta de la aguja en lugar de debajo y más allá de la punta. En esta orientación, es posible que el biselado no se produzca suavemente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig04.jpg"> Figura 4: Comparación de la inserción de la aguja con agujas afiladas y no afiladas. (A-C) aguja no afilada y (D-F) aguja afilada. (A) y (D) fueron capturados antes de que la aguja entrara en contacto con el embrión; (B) y (E) están en el punto justo antes de que la aguja perfore la membrana embrionaria, y (C) y (F) están justo después de la perforación con aguja. La flecha blanca en (B) indica la hendidura de la membrana embrionaria porque se debe aplicar una mayor presión para que una aguja no afilada perfore. La flecha negra en (E) indica la falta de hendidura debido a la perforación de la aguja realizada fácilmente debido a una aguja afilada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Proyectos Aedes de UM-ITF de enero de 2023 a diciembre de 2023. Listado de proyectos de microinyección de Aedes de UM-ITF con el número de embriones inyectados para cada proyecto, el número de larvas que eclosionaron de estos embriones inyectados y el porcentaje de larvas que eclosionaron por embrión inyectado en total. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Resultados del proyecto Aedes de la UM-ITF. El UM-ITF es un centro de servicios que proporciona servicios de microinyección para la modificación genética de insectos. La tabla muestra el número de proyectos Aedes inyectados por la ITF desde enero de 2023 hasta diciembre de 2023. El número de clientes que respondieron a las solicitudes de seguimiento del proyecto en las que la respuesta indicó el éxito o el fracaso del proyecto de inyección. El número de proyectos exitosos, en los que un proyecto exitoso fue aquel en el que los materiales de inyección se microinyectaron en un momento y lugar en el embrión en desarrollo tal que las inyecciones fueron capaces de producir una modificación genética, y el número de proyectos que se consideraron no exitosos debido a la falta de modificación genética. La tasa media de eclosión de los proyectos de microinyección de Aedes durante el periodo de enero de 2023 a diciembre de 2023. La tasa de éxito del proyecto y la tasa de respuesta del cliente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/table%202_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Biselado húmedo de agujas de microinyección que utiliza presión de aire constante para obtener información sobre la apertura de la aguja

Microinjection needles are a critical tool in the delivery of genome modification reagents, CRISPR components (guide RNAs, Cas9 protein, and donor ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Poland, R. et al. Microinyección de cerebro de roedores para estudiar sustratos moleculares del comportamiento motivado. J. Vis. Exp. (2015)En este video, se utiliza una configuración de microinyección llena de agua que consta de una jeringa y un tubo de microinyección para una administración precisa del medicamento. Una rata con una cánula guía preimplantada se somete a una microinyección cerebral dirigida, lo que permite la administración precisa de agentes terapéuticos en animales...

Administración basada en microinyección de un agente terapéutico en un cerebro de roedor despierto

Fuente: Vanegas, M. I., et al. Sistema Microinjectrode para infusión combinada de fármacos y electrofisiología. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra un dispositivo microfluídico basado en microelectrodos que administra una solución farmacológica a través de un tubo capilar, utilizando una solución marcadora a base de aceite para un seguimiento preciso del volumen y permitiendo el registro neuronal simultáneo y la infusión de fármacos.

Sistema de microinyección basado en microfluidos para infusión combinada de fármacos y electrofisiología

Fuente: Paolone, G., et al. Agujas personalizadas para microinyecciones en el cerebro de roedores. J. Vis. Exp. (2018).Este video muestra una inyección de microagujas de cerebro de roedores utilizando una microaguja de cuarzo con agujeros. La microaguja se conecta a una jeringa y una microbomba para controlar la velocidad de administración. La aguja con la solución inyectable se inserta en el cerebro con la velocidad de administración establecida en baja. Una vez posicionado, se aumenta la...

Microinyección de cerebro de roedores con una microaguja de cuarzo

Los roedores son un modelo apropiado para investigar los sustratos moleculares del comportamiento y los trastornos psiquiátricos complejos. La microinyección cerebral en roedores despiertos se puede utilizar para dilucidar los sustratos de la enfermedad. Se presenta un método de microinyección cerebral eficiente y personalizable, así como la ejecución de un paradigma operante que cuantifica la motivación.

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Describimos aquí un protocolo para la microinyección en el cerebro de roedor que utiliza agujas de cuarzo. Estas agujas no producen daño tisular detectable y asegurar la entrega confiable incluso en regiones profundas. Además, pueden ser adaptados a las necesidades de investigación por diseños personalizados y se pueden volver a utilizarse.

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