Name: Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprende a aislar mitocondrias de pequeñas muestras de tejido y cultivos celulares para analizar supercomplejos respiratorios mediante electroforesis blue native. Este método optimiza el estudio de la biogénesis mitocondrial y el sistema OXPHOS.

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Este trabajo ha contado con el apoyo de la subvención número "PGC2018-095795-B-I00" del Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) y de las subvenciones "Grupo de Referencia: E35_17R" y subvención número "LMP220_21" de la Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) a PF-S y RM-L.

Fraccionamiento mitocondrial en muestras de tejido pequeño para análisis supercomplejo

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
<li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells%3A+structural+versus+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li>
<li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li>
<li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
<li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).</li>
<li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).</li>
<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
<li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFern%C3%A1ndez-Vizarra%2C+E+%22Cell+Biology+%28Third+Edition%29%22">Cell Biology (Third Edition)</a>. , Academic Press. 69-77 (2006).</li>
<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Las adaptaciones metodológicas introducidas en los protocolos aquí descritos están destinadas a evitar pérdidas y aumentar el rendimiento, manteniendo al mismo tiempo las actividades del complejo mitocondrial (lo cual es crucial cuando la disponibilidad de cantidades suficientes de muestras se ve comprometida) y reproducir el patrón esperado de SC del tejido o de la línea celular (ver Figura 2C). Con este propósito y dado que no se requiere una alta pureza mitocondrial para detectar correctamente las SC, se ha reducido el número de pasos, tiempos y volúmenes siempre que ha sido posible.
Así, tras la homogeneización y eliminación de núcleos y células ininterrumpidas por centrifugación a baja velocidad, los sobrenadantes que contienen las mitocondrias se transfieren a tubos de polipropileno de 1,5 mL, y las centrifugaciones posteriores para obtener las fracciones mitocondriales crudas se realizan en un microfuge aumentando la velocidad y reduciendo los tiempos y volúmenes con respecto a los protocolos convencionales. Esto permite el procesamiento de varias muestras en un tiempo relativamente corto: una estimación cercana es que se pueden procesar 10 muestras en ~2-2,5 h (desde el inicio de la homogeneización (paso del protocolo 1.6. o equivalente para tejidos) hasta la obtención de la fracción de SCs lista para ser cargada en un gel (paso del protocolo 3.7) y minimiza las pérdidas mientras se mantienen las actividades. Otro cambio con respecto a los protocolos originales del grupo de Schägger es sustituir, después de la solubilización por membrana para la obtención de la fracción SCs, una etapa de ultracentrifugación por una simple centrifugación de microfuga (paso 3.4 del protocolo).
Hay algunos pasos críticos en el procedimiento. En primer lugar, la eficiencia de la rotura celular, especialmente en el caso de células cultivadas (ver nota después del paso 1.8 del protocolo) y particularmente en el caso de células pequeñas. Los tejidos y las líneas celulares presentan un grado de dificultad variable en la rotura celular: por ejemplo, en el corazón y el músculo, este paso suele ser menos eficiente que en el hígado o el bazo, pero se compensa en rendimiento porque los primeros tienen un mayor contenido mitocondrial. Una alternativa para mejorar el rendimiento mitocondrial cuando se aísla del músculo o del corazón sería el tratamiento de las muestras con tripsina antes de la homogeneización. El cerebro es otro tejido que presenta baja eficiencia en la rotura celular debido a la homogeneización manual, que es más leve y menos eficiente y probablemente también debido a la mayor variación de los tipos celulares en este tejido, como se ha reportado previamente 42. Esto puede compensarse parcialmente con un segundo paso de homogeneización como se sugiere en nuestro protocolo (paso 2.7.4). Por otro lado, si la rotura celular es excesiva, la muestra final que contiene SCs podría estar contaminada con fragmentos de ADN nuclear que pueden interferir con el funcionamiento electroforético. Este problema se muestra como un aumento de la viscosidad de la muestra cuando se añade digitonina para solubilizar las membranas mitocondriales y puede solucionarse mediante el tratamiento con ADNasa I.
En segundo lugar, si la relación detergente-proteína es demasiado baja, eso resultaría en una solubilización de membrana menos eficiente y la posibilidad de formación de agregados. Esto podría mostrarse en los geles como una mala resolución en SCs de alto peso molecular (ver Figura 4) o como CIV dando múltiples bandas correspondientes a oligómeros43. Si la relación es demasiado alta, podría conducir a la desagregación de los SC (principalmente CI-SC). En tercer lugar, es importante evitar calentar las muestras durante todo el procedimiento (ver Figura 4) y evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación, ya que pueden afectar el estado del ensamblaje SC.
En la Tabla 2, se presenta un resumen de los rendimientos esperados para varios tipos de células y muestras de tejido. Los valores son aproximados y dependerán de la eficiencia de rotura de la célula y de la naturaleza de la fuente. En el caso de los tejidos, si el material de partida está congelado tiende a dar un rendimiento mayor que con las muestras frescas. Se presenta una estimación del número de carriles (considerando una carga entre 50 y 60 μg de proteína mitocondrial por carril) que se pueden cargar.
Los protocolos presentados aquí cubren una variedad de tejidos y tipos de células con pequeñas variaciones, se pueden usar con muestras frescas o congeladas y requieren un equipo simple y un costo relativamente bajo, que no implica el uso de costosos kits de purificación o gradientes. Sin embargo, es posible que necesiten algunas adaptaciones para ser utilizados con tipos de células o muestras particulares, así como cuando poblaciones mitocondriales específicas, como las mitocondrias sinápticas cerebrales o las mitocondrias subsarcolemales musculares, por ejemplo, son objeto de análisis.
Dado que aún no se han definido las funciones fisiológicas precisas, así como la posible implicación de las SC en situaciones patológicas, es necesario analizar su dinámica y los factores que afectan a su ensamblaje, estabilidad y función. Nuestros protocolos pueden representar herramientas valiosas que permiten obtener resultados reproducibles sobre los patrones de las SCs con tamaños de muestra pequeños y de una variedad de tipos de células y tejidos, particularmente cuando es necesario comparar múltiples condiciones experimentales29.

Los supercomplejos (SC) son asociaciones supramoleculares entre complejos de cadenas respiratorias individuales 1,2. A partir de la identificación inicial de las SC y la descripción de su composición por el grupo de Schägger 2,3, posteriormente confirmada por otros grupos, se estableció que contienen complejos respiratorios I, III y IV (CI, CIII y CIV, respectivamente) en diferentes estequiometrías. Se pueden definir dos poblaciones principales de SC, las que contienen CI (y CIII solo o CIII y CIV) y con un peso molecular muy alto (MW, comenzando ~1,5 MDa para las SC más pequeñas: CI + CIII2) y las que contienen CIII y CIV pero no CI, con un tamaño mucho menor (como CIII2 + CIV con ~680 kDa). Estas SC coexisten en la membrana mitocondrial interna con complejos libres, también en diferentes proporciones. Así, mientras que el CI se encuentra principalmente en sus formas asociadas (es decir, en las SC: ~80% en el corazón bovino y más del 90% en muchos tipos de células humanas)3, el CIV es muy abundante en su forma libre (más del 80% en el corazón bovino), con CIII mostrando una distribución más equilibrada (~40% en su forma libre más abundante, como un dímero, en corazón bovino).
Si bien su existencia es ahora generalmente aceptada, su papel preciso sigue siendo objeto de debate 4,5,6,7,8,9,10. De acuerdo con el modelo de plasticidad, pueden existir diferentes proporciones de SCs y complejos individuales dependiendo del tipo de célula o del estado metabólico 1,7,11. Esta naturaleza dinámica del ensamblaje permitiría a las células regular el uso de los combustibles disponibles y la eficiencia del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) en respuesta a los cambios ambientales 4,5,7. Las SC también podrían contribuir al control de la tasa de generación de especies reactivas de oxígeno y participar en la estabilización y renovación de complejos individuales 4,12,13,14. Se han descrito modificaciones del estado de ensamblaje del SC en asociación a diferentes situaciones fisiológicas y patológicas15,16 y al proceso de envejecimiento17.
Así, se han descrito cambios en los patrones de SC en levaduras dependiendo de la fuente de carbono utilizada para el crecimiento2 y en células de mamíferos cultivadas cuando la glucosa es sustituida por galactosa4. También se han reportado modificaciones en el hígado de ratón después del ayuno8 y en los astrocitos cuando se bloquea la oxidación de los ácidos grasos mitocondriales18. Además, se ha encontrado una disminución o alteraciones de las SC y OXPHOS en el síndrome de Barth19, la insuficiencia cardíaca20, varios trastornos metabólicos21 y neurológicos 22,23,24 y diferentes tumores 25,26,27,28 . Todavía se investiga si estas alteraciones en el ensamblaje y los niveles de SC son una causa primaria o representan efectos secundarios en estas situaciones patológicas15,16. Diferentes metodologías pueden dar información sobre el ensamblaje y la función de los SC; Estos incluyen mediciones de actividad 8,29, análisis ultraestructural30,31 y proteómica32,33. Una alternativa útil que se está empleando cada vez más y que es el punto de partida de algunas de las metodologías mencionadas anteriormente es la determinación directa del estado de ensamblaje de SC mediante electroforesis nativa azul (BN) desarrollada para este fin por el grupo de Schägger34,35.
Este enfoque requiere procedimientos reproducibles y eficientes para obtener y solubilizar las membranas mitocondriales y puede complementarse con otras técnicas como el análisis de actividad en gel (IGA), la electroforesis de segunda dimensión y el western blot (WB). Una limitación en los estudios sobre la dinámica de las SC mediante electroforesis BN puede ser la cantidad de células de partida o muestras de tejido. Presentamos una serie de protocolos para el análisis del ensamblaje y la función de las SC, adaptados de los métodos del grupo de Schägger, que se pueden aplicar a muestras de células o tejidos frescos o congelados a partir de tan solo 20 mg de tejido.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>Ácido aminocaproico</td><td>Fluka Analytical</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Bis Tris</td><td>Acrons Ensayo de</td><td>327721000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>Biorad 5000002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue R-250</td><td>Merck</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Diamino&nbsp; bencidina (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Libre de ácidos grasos BSA</td><td>Roche</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador Mortero de teflón</td><td>Deltalab 196102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>manitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Labkem</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PanReac</td><td>131404</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1 Anticuerpo monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3 a 12% Mini Geles de Proteínas</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Aditivo tampón catódico (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Running Buffer (20x)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9 Anticuerpo monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue sal de tetrazolio (NBT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PDVF</td><td>Amersham</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>Metasulfato de fenazina (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Sustrato</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA Anticuerpo monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina/penicilina</td><td>PAN biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 Anticuerpo Monoclonal</td><td>Invitrogen</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares 

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

A lo largo de las últimas décadas, la evidencia acumulada sobre la existencia de supercomplejos respiratorios (SCs) ha cambiado nuestra comprensión de la organización de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, dando lugar a la propuesta del "modelo de plasticidad". Este modelo postula la coexistencia de diferentes proporciones de SCs y complejos en función del tejido o del estado metabólico celular. La naturaleza dinámica del ensamblaje en las SC permitiría a las células optimizar el uso de los combustibles disponibles y la eficiencia de la transferencia de electrones, minimizando la generación de especies reactivas de oxígeno y favoreciendo la capacidad de las células para adaptarse a los cambios ambientales. 
Más recientemente, se han descrito anomalías en el ensamblaje de SC en diferentes enfermedades como trastornos neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer y Parkinson), síndrome de Barth, síndrome de Leigh o cáncer. El papel de las alteraciones del ensamblaje de las SC en la progresión de la enfermedad aún debe confirmarse. Sin embargo, la disponibilidad de cantidades suficientes de muestras para determinar el estado del ensamblaje SC es a menudo un desafío. Esto sucede con biopsias o muestras de tejido que son pequeñas o que deben dividirse para múltiples análisis, con cultivos celulares que tienen un crecimiento lento o provienen de dispositivos microfluídicos, con algunos cultivos primarios o células raras, o cuando se debe analizar el efecto de tratamientos costosos particulares (con nanopartículas, compuestos muy caros, etc.). En estos casos, se requiere un método eficiente y fácil de aplicar. En este trabajo se presenta un método adaptado para obtener fracciones mitocondriales enriquecidas a partir de pequeñas cantidades de células o tejidos para analizar la estructura y función de las SC mitocondriales mediante electroforesis nativa seguida de ensayos de actividad in-gel o western blot.

Los rendimientos de mitocondrias obtenidos siguiendo los protocolos descritos anteriormente varían en función de varios factores, como la línea celular o el tipo de tejido, la naturaleza de las muestras (es decir, si se utilizan tejidos frescos o congelados) o la eficiencia del proceso de homogeneización. Los rendimientos esperados de mitocondrias de diferentes líneas celulares y tejidos se recogen en la Tabla 2. Una vez obtenidas las fracciones mitocondriales, el siguiente paso es el análisis del patrón de SCs respiratorias, que se realiza tras la solubilización de la muestra mitocondrial bruta y la separación electroforética por BN-PAGE, seguida de un análisis de IGA o inmunodetección de WB. La Figura 1 muestra el aspecto de los carriles de gel sin teñir justo después de la corrida y el patrón de bandas después de la tinción estándar de Coomassie de una línea celular cultivada y una muestra mitocondrial de hígado de ratón.
En la Figura 2A, B, se pueden observar claras diferencias entre los patrones de ensamblaje de SC en células humanas y de ratón después de usar ensayos de IGA. Por lo tanto, el complejo I libre se observa en las células de ratón, mientras que no es detectable en las mitocondrias humanas. El patrón complejo de IV-IGA es muy similar en ambas líneas celulares humanas (Figura 2B), mientras que presenta diferencias entre las dos líneas celulares de ratón analizadas en la Figura 2A. Estas diferencias se deben al hecho de que las células BL6 expresan una variante mutante de SCAF18.
Los patrones de SC, obtenidos con el protocolo de aislamiento mitocondrial descrito aquí para trabajar con muestras pequeñas, se mantienen con respecto a los protocolos "convencionales" utilizados para muestras más grandes. Esto se puede observar en la Figura 2C, comparando los carriles 1 y 6 (obtenidos tras el aislamiento mitocondrial utilizando un protocolo convencional a partir de 3 g de hígado y 1,1 g de BAT) con, respectivamente, los carriles 2 y 5 (obtenidos utilizando los protocolos aquí presentados a partir de alrededor de 0,1 g de ambos tejidos). Como se propone en el modelo de plasticidad, la proporción relativa de complejos respiratorios y SC varía según el tipo de célula y el estado metabólico. Como se muestra en la Figura 2C,D, los diferentes tejidos muestran diferentes patrones de ensamblaje de SC. Así, las mitocondrias cerebrales muestran niveles muy bajos de complejo I libre y una mayor proporción de SCs en comparación con los otros tejidos, y la MTD se caracteriza por sus bajos niveles de CV (Figura 2A) y altas cantidades de SC III + IV (Figura 2D). Las mitocondrias cardíacas presentan altos niveles de SCs y CVs. Los patrones de ensamblaje de CV son muy similares entre la línea celular cultivada y una muestra mitocondrial de hígado de ratón (Figura 2E).
El ensamblaje de SC también puede ser analizado por WB, como se muestra en la Figura 3 para dos muestras obtenidas de células de control de bazo y tumores. En este caso, 30-50 μg de proteína mitocondrial suelen ser suficientes para detectar los diferentes complejos y SCs con los anticuerpos específicos. La Figura 4 muestra algunos de los principales escollos que pueden ocurrir durante la aplicación de estos protocolos. Los gradientes de gel incorrectos pueden producir patrones de migración anormales y no deseados, como en la Figura 4A, carril 1, donde los SC permanecen cerca del pozo en la parte superior del carril debido a una concentración de acrilamida más alta de lo normal en el gel. La incubación de las muestras, incluso durante tiempos relativamente cortos, a altas temperaturas (en este caso, 37 °C y 40 °C durante 10 min) provoca la degradación de las SC y de la IC (Figura 4A , carriles 2-4). Del mismo modo, la proporción de detergente a proteína es fundamental para obtener buenos resultados y una resolución de gel adecuada. Por debajo de una proporción de 2 g de digitonina/g de proteína, la resolución de la banda se reduce progresivamente y a la concentración más baja (0,5 g/g) solo se aprecia un frotis en el área correspondiente a las SC (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig01.jpg"> Figura 1: Patrón de complejos y supercomplejos mitocondriales después de la separación BNGE de mitocondrias permeabilizadas con digitonina de una línea celular en cultivo (L929Balbc) e hígado de ratón. Los carriles de la izquierda (1 y 2) representan el aspecto del gel sin manchar justo después de la carrera, donde solo se detecta CV, mientras que los carriles de la derecha (3 y 4) muestran el patrón de bandas después de la tinción de Coomassie. Abreviaturas: BNGE = electroforesis en gel Blue Native; CV = complejo V; SCs = supercomplejos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig02.jpg"> Figura 2: Análisis IGA de mitocondrias aisladas de diferentes líneas celulares y tejidos de ratón. (A,B) Actividad en gel de los complejos indicados en mitocondrias aisladas de líneas celulares (A) de ratón o (B) humanas. L929Balbc es una línea celular transmitocondrial generada en nuestro laboratorio mediante la transferencia de mitocondrias de plaquetas de ratón Balb/cJ a células ρ°L929neo como se ha descrito anteriormente40,41. Los fibroblastos BL6 son una línea celular inmortalizada generada en nuestro laboratorio a partir de una biopsia de oreja de un ratón BL6. (C) Patrones de CI-IGA a partir de mitocondrias de ratón aisladas utilizando un método convencional que comienza con 3 g de hígado (carril 1) y con 1,1 g de BAT (carril 6) o el protocolo presentado aquí y que comienza con alrededor de 0,1 g de tejido en todos los casos (carril 2, hígado; carril 3, corazón; carril 4, cerebro y carril 5 BAT). (D) Patrones de CIV-IGA (realizados después de CI-IGA mostrado en el panel 2C, carriles 2-5) en hígado, corazón, cerebro y mitocondrias BAT de ratón. (E) Actividad CV-IGA analizada en células cultivadas de ratón e hígado. Se cargaron alrededor de 60-75 μg de proteína mitocondrial por carril. Abreviaturas: IGA = actividad en gel; SCs = supercomplejos; IC = complejo I; BAT = tejido adiposo marrón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig03.jpg"> Figura 3: Inmunodetección de WB de los diferentes complejos y supercomplejos mitocondriales en muestras de bazo. Después de la separación de Blue Native PAGE de los complejos mitocondriales y los SC obtenidos de muestras de control de bazo (Spleen M9) y tumor (Tumor M9), se transfirieron a una membrana de PVDF y se hibridaron secuencialmente con anticuerpos que reconocen las subunidades CI, CIII, CIV y CII indicadas (paneles A-D, respectivamente). Se cargaron alrededor de 50 μg de proteína mitocondrial por carril. Los asteriscos indican la señal que queda de una mancha occidental anterior. Abreviaturas: SC = supercomplejo; IC = complejo I; CIII = complejo III; CIV = complejo IV; CII = complejo II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig04v2.jpg"> Figura 4: Trampas en el análisis de SC por Blue-Native PAGE. Análisis CI IGA de mitocondrias aisladas de (A) hígado fresco de ratón y (B) hígado de rata congelado en diferentes condiciones de solubilización. (A) Carril 1, concentración de gradiente de gel incorrecta (8-13% en lugar del 3-13% normal). Carriles 2-4, muestras incubadas durante 10 min en hielo o a 37 °C y 40 °C antes de cargar, respectivamente. (B) Patrón después de IGA para IC de mitocondrias obtenidas de hígado de rata congelado utilizando diferentes proporciones de digitonina/proteína para la solubilización. Abreviaturas: SC = supercomplejo; PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida; IC = complejo I; IGA = actividad en gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig04largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Medio</td>
			<td colspan="3">Composición</td>
		</tr><tr><td>Tampón hipotónico</td>
			<td colspan="3">10 mM MOPS, 83 mM de sacarosa, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampón hipertónico</td>
			<td colspan="3">30 mM MOPS, 250 mM de sacarosa, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampón de homogeneización A</td>
			<td colspan="3">10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M sacarosa, pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Tampón de homogeneización AT</td>
			<td colspan="3">225 mM manitol, 1 mM EGTA, 75 mM sacarosa, 0,01% BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>tampón de homogeneización AT2</td>
			<td colspan="3">225 mM manitol, 1 mM EGTA, 75 mM sacarosa, 0,02% BSA pH 7,4</td>
		</tr><tr><td>Tampón de muestra BN</td>
			<td colspan="3">50 mM de NaCl, 50 mM de Imidazol, 2 mM de ácido aminocaproico, 1 mM de EDTA pH 7.0</td>
		</tr><tr><td>Solución Digitonin</td>
			<td colspan="3">10% de digitonina en 50 mM de NaCl, 50 mM de imidazol, 5 mM de aminocaproico, 4 mM de PMSF</td>
		</tr><tr><td>Búfer de carga BN</td>
			<td colspan="3">5% Coomassie Blue G en ácido aminocaproico 0,75 M</td>
		</tr><tr><td>Tampón catódico BN A</td>
			<td colspan="3">50 mM de tricina, 15 mM de Bis-Tris pH =7,0 (4 °C), 0,02% G-250 (Coomassie azul brillante G-250)</td>
		</tr><tr><td>Tampón catódico BN B</td>
			<td colspan="3">50 mM tricina, 15 mM Bis-Tris pH=7,0 (4 °C), 0,002% G-250</td>
		</tr><tr><td>Búfer de ánodo BN</td>
			<td colspan="3">50 mM Bis-Tris, pH=7.0</td>
		</tr><tr><td>Sustrato IGA complejo I</td>
			<td colspan="3">5 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/mL de NADH, 2,5 mg/mL de Nitroblue Tetrazolio (NBT)</td>
		</tr><tr><td>Sustrato IGA del complejo II</td>
			<td colspan="3">50 mM Tampón de fosfato de potasio pH 7,4, 20 mM de succinato de sodio, 0,2 mM de metosulfato de fenazina (PMS), 2,5 mg/mL de NBT</td>
		</tr><tr><td>Sustrato IGA del complejo III</td>
			<td colspan="3">50 mM Tampón de fosfato de potasio pH 7,2, 0,05% diaminobenzidina (DAB)</td>
		</tr><tr><td>Sustrato IGA complejo IV</td>
			<td colspan="3">La misma solución que CIII más 50 μM de citocromo c</td>
		</tr><tr><td>Sustrato Complejo V IGA</td>
			<td colspan="3">35 mM Tris, 270 mM glicina pH 8.3, 14 mM MgSO4, 0.2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP</td>
		</tr><tr><td>Solución de tinción</td>
			<td colspan="3">Colorante Coomassie R-250 al 0,25% en 40% de metanol y 10% de ácido acético</td>
		</tr><tr><td>Solución de decoloración/fijación</td>
			<td colspan="3">40% metanol, 10% ácido acético</td>
		</tr><tr><td>Búfer de transferencia</td>
			<td colspan="3">48 mM de Tris, 39 mM de glicina, 20% de metanol</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Búferes y composición de medios.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tipo de célula/tejido</td>
			<td>Importe inicial</td>
			<td>Rendimiento esperado (μg de proteína mitocondrial)</td>
			<td>Número de carriles (50-60 μg/carril)</td>
		</tr><tr><td>Células cultivadas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>MDA-MB-468</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>6-9</td>
		</tr><tr><td>Derivado de 143B</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>200-350 μg</td>
			<td>4-7</td>
		</tr><tr><td>Fibroblastos de ratón</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>150-200 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>Corazón</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>10-12*</td>
		</tr><tr><td>Músculo esquelético</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>300-400 μg</td>
			<td>8-10*</td>
		</tr><tr><td>Hígado</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>400-500 μg</td>
			<td>8-10</td>
		</tr><tr><td>Bazo</td>
			<td>50 mg</td>
			<td>150-250 μg</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>MURCIÉLAGO</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>200-300 μg</td>
			<td>4-6</td>
		</tr><tr><td>Cerebro</td>
			<td>100 mg</td>
			<td>250-300 μg</td>
			<td>5-8</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Rendimientos esperados de mitocondrias de diferentes tipos de células y tejidos de ratón. Las fracciones mitocondriales obtenidas del corazón o del músculo esquelético son más puras que las obtenidas de otros tejidos. Por lo tanto, se pueden cargar cantidades más pequeñas en los geles (*).

Este protocolo describe una técnica para el análisis de supercomplejos respiratorios cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de muestras.

Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

Nuestra investigación se centra en comprender mejor la biogénesis mitocondrial, en particular, la organización y regulación del sistema OXPHOS, y también en definir el papel que juegan las mitocondrias en enfermedades que van desde el cáncer hasta los trastornos neurodegenerativos. Las mitocondrias desempeñan múltiples y esenciales funciones en la célula, condicionando todo su metabolismo y supervivencia. Poco a poco estamos aumentando nuestro conocimiento de la complejidad mitocondrial y su contribución a los mecanismos de adaptación celular en la salud y la enfermedad.Hemos contribuido a establecer un nuevo modelo de organización para el sistema OXPHOS, el modelo de plasticidad que integra propuestas anteriores y supone la coexistencia de supercomplejos y complejos libres en diferentes proporciones para optimizar su función y permitir adaptaciones celulares. Nuestro protocolo permite, a partir de pequeños tejidos o muestras de cultivo celular, obtener cantidades suficientes de proteínas mitocondriales para analizar supercomplejos, ensamblaje, y estado, y función mediante electroforesis nativa azul u otras técnicas. Podemos hacer esto de manera reproducible en poco tiempo con un equipo simple y relativamente bajo costo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video describe el procedimiento para aislar mitocondrias de tejidos de cáncer de ovario humano utilizando centrifugación de velocidad diferencial en combinación con centrifugación en gradiente de densidad. Las mitocondrias aisladas se pueden utilizar para el análisis proteómico del proteoma mitocondrial del cáncer de ovario humano.

Aislamiento mitocondrial: una técnica para aislar mitocondrias de una muestra de tejido de cáncer de ovario humano

Un método para el rápido aislamiento de las mitocondrias a partir de biopsias de tejido de mamíferos se describe. Preparaciones de hígado de rata o de músculo esquelético se homogeneizaron con un disociador tejido comercial y mitocondrias se aislaron por filtración a través de filtros diferencial de malla de nylon. Tiempo de aislamiento mitocondrial es &lt;30 min frente a 60 - 100 min utilizando métodos alternativos.

Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial

La comparación del potencial de membrana mitocondrial entre muestras proporciona información valiosa sobre el estado celular. Se describen los pasos detallados para aislar las mitocondrias y evaluar la respuesta a los inhibidores y desacopladores mediante fluorescencia. El método y la utilidad de este protocolo se ilustran mediante el uso de un cultivo celular y un modelo animal de estrés celular.

Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Aquí, presentamos una modificación de un método previamente reportado que permite el aislamiento de mitocondrias purificadas y de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento da como resultado mitocondrias altamente acopladas que respiran con alta función durante los ensayos respirometirc basados en microplacas.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Como las mitocondrias son sólo un pequeño porcentaje de la célula de la planta, tienen que ser purificado para una gama de estudios. Las mitocondrias pueden ser aisladas de una variedad de órganos de la planta de homogeneización, seguido de centrifugación gradiente diferencial y densidad para obtener una fracción altamente purificada mitocondrial.

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Las mitocondrias han especializado los ribosomas que divergieron de sus contrapartes bacterianas y citoplasmáticas. Aquí mostramos cómo mitoribosomes puede obtenerse su compartimiento nativo en las células HEK. El método implica el aislamiento de las mitocondrias de las células de suspensión y consiguiente depuración de mitoribosomes.

Aislamiento rápido de la Mitoribosome de las células HEK

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Presentamos un protocolo de dos pasos para el aislamiento de mitocondrias de alta calidad que es compatible con el descubrimiento y cuantificación de proteínas a escala de proteoma. Nuestro protocolo no requiere ingeniería genética y, por lo tanto, es adecuado para estudiar las mitocondrias de cualquier célula y tejido primario.

Aislamiento de dos pasos sin etiquetas de las mitocondrias para mejorar el descubrimiento y la cuantificación de proteínas

Los estudios bioenergéticos y metabolómicos de las mitocondrias han revelado su papel multifacético en muchas enfermedades, pero los métodos de aislamiento de estos orgánulos varían. El método detallado aquí es capaz de purificar mitocondrias de alta calidad a partir de múltiples fuentes de tejidos. La calidad se determina mediante las proporciones de control respiratorio y otras métricas evaluadas con respirometría de alta resolución.

Aislamiento mitocondrial robusto del tejido cardíaco de roedores 

Aprende a aislar mitocondrias de pequeñas muestras de tejido y cultivos celulares para analizar supercomplejos respiratorios mediante electroforesis blue native. Este método optimiza el estudio de la biogénesis mitocondrial y el sistema OXPHOS.

Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares

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