Name: Construcción de un modelo de xenoinjerto ortotópico de cáncer de pulmón de células no pequeñas que imita la progresión de la enfermedad y predice las actividades de los fármacos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Aprende a construir un modelo de xenoinjerto ortotópico de cáncer de pulmón de células no pequeñas usando esferoides multicelulares de A549-iRFP. Este método permite replicar etapas clínicas y evaluar respuestas terapéuticas con cisplatino mediante imagen fluorescente dinámica.

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Este trabajo contó con el apoyo de las subvenciones SAAG y SEED de la Universidad del Pacífico. Agradecemos al Dr. William Chan por otorgar acceso al sistema Odyssey Infrared Imaging 205 y al Dr. John Livesey por otorgar acceso al lector de placas SpectraMax iD3. Agradecemos a la Dra. Melanie Felmlee por el asesoramiento técnico sobre los protocolos con animales.

El estudio en animales se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad del Pacífico (Protocolos Animales 19R10 y 22R10). Para el presente estudio se utilizaron ocho ratones machos desnudos atímicos de 5-6 semanas de edad, con un peso de 20-25 g, criados con la dieta de roedores de referencia y alojados en condiciones libres de patógenos (SPF). Las jaulas, la ropa de cama y el agua potable se esterilizaban en autoclave y se cambiaban regularmente. En la Figura 1 se muestra un esquema de la inoculación tumoral en ratones. Consulte la Tabla de Materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales e instrumentos utilizados en este protocolo.
1. Establecimiento de MCS tridimensional de celdas A549-iRFP
<ol><li>Incubar células A549-iRFP (adenocarcinoma de pulmón humano) en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 °C y cultivarlas en un medio de crecimiento completo DMEM que contenga 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina y 1 μg/mL de puromicina.</li>
	<li>Siembre las células A549-iRFP en una microplaca esferoide de fondo redondo y fijación ultrabaja de 96 pocillos con una densidad de siembra de 4.000 células/pocillo, utilizando 100 μL de medio de crecimiento completo suplementado con colágeno al 0,3%.</li>
	<li>Centrifugar las microplacas a 300 × g durante 7 min a 4 °C para facilitar la formación de MCS. Examinar la morfología de la SQM bajo un microscopio para asegurar la agregación celular después de la centrifugación.</li>
	<li>Después de 48 h, agregue 100 μL de medio de crecimiento completo a cada pocillo para lograr un volumen total de 200 μL de medio de crecimiento por pocillo.</li>
	<li>Reemplace 100 μL de medio de crecimiento en cada pocillo con medio de crecimiento completo nuevo cada dos días.</li>
</ol>2. Caracterización del MCS A549-iRFP
<ol><li>Observe y obtenga imágenes de la morfología del MCS utilizando un microscopio y estime el volumen del MCS mediante simulación con el software de referencia de MATLAB basado en las imágenes del microscopio de contraste de fase.<ol><li>Abra una imagen MCS en el software ImageJ.</li>
		<li>Utilice las selecciones a mano alzada para seleccionar el borde del MCS y agregarlo al Administrador de ROI.</li>
		<li>Haga clic en Editar | Selección | Crear máscara.</li>
		<li>Haga clic en Editar | Invertir.</li>
		<li>Haga clic en Archivo | Guardar como | Tiff.</li>
		<li>Abra el software ReViSP.</li>
		<li>Abra la imagen TIFF guardada haciendo clic en Examinar.</li>
		<li>Haga clic en Iniciar para completar la simulación de MCS.</li>
	</ol></li>
	<li>Mida la señal fluorescente iRFP utilizando el sistema de imágenes infrarrojas en el canal de 700 nm y cuantifique la señal fluorescente utilizando software (por ejemplo, Image Studio).<ol><li>Abra el software Image Studio.</li>
		<li>En la pestaña Canales , seleccione 700 e Intensidad = 5.</li>
		<li>En la pestaña Controles de escaneo , seleccione 84 μm, Medio, 0,0 mm y Voltear imagen. Mantenga todo lo demás como predeterminado.</li>
		<li>Haga clic en Iniciar para iniciar el escaneo.</li>
	</ol></li>
	<li>Evalúe y cuantifique la viabilidad celular utilizando el ensayo de viabilidad celular 3D de acuerdo con el protocolo del proveedor.</li>
	<li>Evalúe y cuantifique la proteína celular utilizando el ensayo BCA de acuerdo con el protocolo del proveedor.</li>
</ol>3. Selección de SQM para la inoculación tumoral
NOTA: Después de sembrar los SQM en microplacas esferoides y cultivarlos durante 2-3 semanas con un intercambio regular del medio de crecimiento, seleccione los SQM con las siguientes características apropiadas para la inoculación del tumor.
<ol><li>Observe la morfología del MCS bajo un microscopio y elija el MCS con una forma redonda con bordes lisos en general, pero con 5-10 yemas rugosas (flechas en la Figura 2F) y un diámetro dentro del rango de 700-800 μm.</li>
	<li>Mida la fluorescencia iRFP (consulte el paso 2.2) y seleccione el MCS cuyas señales fluorescentes estén dentro de una desviación estándar del promedio.</li>
</ol>4. Inoculación intrapulmonar de SQM
NOTA: Utilice alcohol isopropílico en aerosol al 70% para limpiar la estación quirúrgica y las herramientas antes de manipular los animales.
<ol><li>Anestesiar a cada ratón con una inyección IP de 80 mg/kg de ketamina y 12 mg/kg de xilacina; Pellizque las patas del ratón con pinzas para asegurar una anestesia completa.</li>
	<li>Inyecte 10 μL de clorhidrato de buprenorfina (0,3 mg/mL) por vía subcutánea para reducir el dolor.</li>
	<li>Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la sequedad.</li>
	<li>Coloque al ratón en una postura dorsal y asegure las extremidades en una posición de estiramiento con cintas.</li>
	<li>Esterilice la piel de la espalda con hisopos de yodo y alcohol.</li>
	<li>Realice una incisión de 0,5-1 cm con unas tijeras quirúrgicas en el lado posterior izquierdo (Figura 1B). Use fórceps con cuidado para separar el músculo y los tejidos grasos hasta que la pared torácica y el movimiento pulmonar sean visibles.</li>
	<li>Transfiera un MCS seleccionado de una microplaca a una placa de Petri de vidrio que contenga PBS helado, usando una pipeta.</li>
	<li>Coloque una aguja de 20 G en una jeringa de vidrio de 100 μL, preenfríela en hielo y extraiga 20 μL de una mezcla preenfriada de PBS y Matrigel (1:1 v/v).</li>
	<li>Utilice la jeringa para aspirar rápidamente un MCS de la placa de Petri en un volumen mínimo de la mezcla de PBS-Matrigel, manteniendo el MCS en la parte metálica de la aguja. NOTA: Mantenga un agarre firme de la jeringa y el émbolo para evitar que el MCS se salga de la aguja.</li>
	<li>Inserte suavemente la aguja verticalmente entre dos costillas a ~ 3 mm de profundidad e inyecte lentamente todos los 20 μL de PBS y la mezcla de Matrigel que contiene el MCS. NOTA: Evite la fuerza excesiva durante la inserción para evitar daños en el pulmón, la vasculatura o el corazón.</li>
	<li>Retire con cuidado la aguja y aplique una pomada antibiótica triple en la herida.</li>
	<li>Selle la incisión con clips quirúrgicos, que se retirarán después de 2 semanas. NOTA: No sutura la incisión porque las líneas de sutura pueden interferir con las imágenes de fluorescencia. Los ratones desnudos son capaces de sanar de forma natural después de la cirugía.</li>
	<li>Coloque al animal sobre una almohadilla térmica infrarroja y cúbralo con toallitas de laboratorio para mantener la temperatura corporal. Vigile al animal durante al menos 30-60 minutos hasta que se despierte y se mueva correctamente.</li>
	<li>Inyecte 10 μL de clorhidrato de buprenorfina (0,3 mg/mL) por vía subcutánea 3 veces al día durante las primeras 48 h para reducir el dolor.</li>
</ol>5. Seguimiento postquirúrgico
<ol><li>Mide el peso corporal cada 3-4 días.</li>
	<li>Mida la señal fluorescente iRFP del xenoinjerto tumoral cada 3-4 días en un sistema de imágenes de animales pequeños a un canal de 700 nm en cuatro posturas: izquierda, derecha, dorsal y ventral, mientras los ratones se mantienen bajo anestesia por inhalación de isoflurano (caudal: 1,5-2 L/min de oxígeno que contiene 1,5% de isoflurano) durante 2-3 min.</li>
	<li>Cuantificar la intensidad fluorescente neta del cáncer de xenoinjerto in vivo utilizando software (por ejemplo, Image Studio).<ol><li>Utilice un rectángulo fijo (A1, 200 x 125 píxeles) como ventana de muestreo para el área del pecho de los ratones.</li>
		<li>Utilice la función de mano libre para trazar la forma de los ratones dentro del rectángulo (A1) y medir la intensidad fluorescente (F1) en el área A1.</li>
		<li>Utilice otro rectángulo más pequeño (A2, 25 x 40 píxeles) para medir la fluorescencia de fondo (F2) de los ratones en la zona del muslo.</li>
		<li>Utilice la ecuación (1) para calcular la intensidad fluorescente neta del cáncer de xenoinjerto en cada ratón: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66787/66787eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol></li>
</ol>

Inoculación intrapulmonar de esferoides multicelulares para modelar el CPNM ortotópico

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pathologic+classification+of+lung+cancer%3A+Relevance+for+clinical+practice+and+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials.</a> J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).</li>
<li>Ducote, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+artificial+intelligence+to+identify+tumor+microenvironment+heterogeneity+in+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers.</a> Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).</li>
<li>Lim, Z. F., Ma, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+insights+of+tumor+heterogeneity+and+drug+resistance+mechanisms+in+lung+cancer+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 134(2019).</li>
<li>Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+heterogeneity+and+new+strategies+for+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).</li>
<li>Peterson, J. K., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+pharmacology+and+in+vivo+cancer+models+in+preclinical+and+clinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development.</a> Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).</li>
<li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).</li>
<li>Mclemore, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+intrapulmonary+model+for+orthotopic+propagation+of+human+lung+cancers+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice.</a> Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103(2016).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).</li>
<li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Huang, B. W., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+3d+cultured+multicellular+spheroid+tumor+models+in+tumor-targeted+drug+delivery+system+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research.</a> J Control Release. 270, 246-259 (2018).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Sethi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+tumor+tissue+analogs+and+their+orthotopic+implants+for+understanding+tumor-targeting+of+microenvironment-responsive+nanosized+chemotherapy+and+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation.</a> Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).</li>
<li>Valta, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+of+lucap+136+patient-derived+xenograft+enables+versatile+preclinical+models+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapulmonary+inoculation+of+multicellular+spheroids+to+construct+an+orthotopic+lung+cancer+xenograft+model+that+mimics+four+clinical+stages+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. , 10.1016/j.vascn.2020.106885 106885(2020).</li>
<li>Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer%3A+Biology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lung cancer: Biology and treatment options.</a> Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).</li>
<li>Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eighth+edition+lung+cancer+stage+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The eighth edition lung cancer stage classification.</a> Chest. 151 (1), 193-203 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

La construcción de A549-iRFP MCS es un procedimiento de laboratorio sencillo y altamente reproducible y se puede traducir a la formación de MCS para múltiples líneas celulares. El SQM generado con la ayuda de la centrifugación y el colágeno exhibe una estructura más integral y similar a la de un tumor sólido en 3-4 días. Este método asegura la formación de esferoides robustos que mantienen su estructura integral durante períodos prolongados, generalmente de 2 a 3 semanas o incluso más hasta que comienzan a surgir pequeños brotes. Mediante el empleo de centrifugación y colágeno, estandarizamos la formación de MCS, asegurando su consistencia y fiabilidad en nuestro modelo experimental. Este enfoque mejora la reproducibilidad de nuestros resultados y minimiza la variabilidad en la cinética de crecimiento tumoral, proporcionando así una plataforma más sólida para estudiar la biología tumoral y las intervenciones terapéuticas.
A diferencia de los cultivos celulares monocapa 2D tradicionales, el MCS 3D puede crecer durante un período de tiempo mucho más largo, al menos 6 semanas en este estudio. Para monitorear el crecimiento y la progresión del cáncer, una medición cuantitativa dinámica y a largo plazo es muy beneficiosa. Muchos ensayos 3D de MCS existentes son destructivos durante las mediciones, lo que limita su utilidad para las evaluaciones a largo plazo. La naturaleza no destructiva de la medición de las señales fluorescentes iRFP permite un seguimiento continuo y a largo plazo del crecimiento de las células cancerosas en 3D MCS. Esta característica es particularmente valiosa para evaluar los efectos de la exposición crónica a agentes anticancerosos y para capturar la evolución dinámica de las células cancerosas a lo largo del tiempo. Las señales fluorescentes iRFP emitidas por el A549-iRFP 3D MCS mostraron una fuerte correlación con las mediciones cuantitativas tradicionales del crecimiento de esferoides, incluido el volumen de esferoides, la viabilidad celular y los niveles de proteínas celulares. Esto pone de manifiesto la fiabilidad de las señales fluorescentes como indicador para evaluar el crecimiento de las células cancerosas en la SQM. La longitud de onda larga de las señales fluorescentes iRFP permite cuantificar el crecimiento y la progresión del cáncer en animales pequeños, lo cual es fundamental para el desarrollo preclínico de fármacos contra el cáncer.
Para garantizar la consistencia de este modelo ortotópico de CPNM, es necesario seleccionar cuidadosamente la SQM para la inoculación intrapulmonar. Es necesario un tamaño similar y una intensidad fluorescente del MCS para minimizar la variación; la inoculación de SQM más grandes tiende a causar una mayor variación en la progresión del tumor. Además, el control de la rugosidad de la superficie MCS desempeña un papel fundamental en la reducción de la variación. Mientras que algunos MCS mantuvieron sus bordes lisos a medida que crecían, otros mostraron bordes más ásperos a medida que crecían. En nuestras manos, el SQM integral, similar a un tumor sólido, después de 2-3 semanas de crecimiento en cultivo celular con 5-10 yemas en los bordes, produjo un crecimiento tumoral más uniforme en ratones, mientras que aquellos sin bordes ásperos o aquellos con estructuras aflojadas y demasiadas gemaciones produjeron patrones más diversos de crecimiento tumoral después de la inoculación. 
Durante el proceso de transferencia de SQM, es esencial manipular la aguja de 20 G con mucho cuidado. El SQM debe mantenerse dentro del bisel o de la parte metálica de la aguja para limitar el daño potencial. La elección del tamaño de la aguja se hizo deliberadamente para equilibrar entre garantizar la viabilidad de la SQM durante la inoculación y minimizar el daño potencial a los pulmones de los ratones. Los tamaños de aguja más grandes podrían causar daños en los tejidos del ratón. Si el SQM se atasca dentro de la aguja o si se observan múltiples puntos fluorescentes en los primeros días después de la inoculación, puede indicar que el SQM inoculado se ha dañado durante la inoculación. Los ratones que presentaban estas características se excluyeron de los estudios posteriores y se clasificaron como inoculación no exitosa.
Los esferoides multicelulares (SQM) se inocularon en el pulmón izquierdo en lugar del pulmón derecho según consideraciones anatómicas. El pulmón izquierdo tiene dos lóbulos apilados uno encima del otro, lo que proporciona un área objetivo más consistente y accesible en comparación con el pulmón derecho, que tiene tres lóbulos ubicados uno al lado del otro. Así, el pulmón izquierdo permite una inoculación altamente fiable en una zona específica, a saber, el lóbulo superior izquierdo, lo que ayuda a reducir las variaciones en la originación y progresión del tumor. 
Además de la fluorescencia iRFP en el tórax, el peso corporal de los ratones portadores de tumores sirve como un importante indicador corroborador de la carga tumoral. A medida que el cáncer de xenoinjerto progresaba después de la inoculación de SQM, los ratones primero mostraron un comportamiento normal, incluyendo comer, beber y actividades cuando estaban despiertos, hasta aproximadamente el día 40, cuando la pesada carga tumoral, como lo demuestra la fuerte fluorescencia de iRFP en el tórax, resultó en una caída notable en el peso corporal y la pérdida del comportamiento normal. Siguiendo las pautas humanitarias, los animales fueron sacrificados con una pérdida de peso corporal del 15-20%. Si bien el momento de la pérdida de peso varió entre los lotes, coincide con la pérdida del comportamiento normal de los animales y, por lo tanto, también se puede utilizar como un indicador confiable de la salud animal.
La progresión del cáncer en el modelo ortotópico de CPCNP se controló principalmente a través de imágenes fluorescentes del lado izquierdo y ventral, que mostraron un crecimiento tumoral consistente y constante después de la inoculación de SQM. La fluorescencia del lado ventral mostró un aumento más lento que la del lado izquierdo, probablemente debido a (1) la profundidad de la inyección y (2) la presencia de tumores ortotópicos y subcutáneos en estadios avanzados de cáncer. Específicamente, el SQM se inoculó a través de los huesos de las costillas en el tórax, que lo depositó en la superficie dorsal del pulmón izquierdo, lo que requirió un tiempo de retraso para que el SQM creciera hasta la superficie ventral del pulmón izquierdo para obtener imágenes. A medida que el tumor crecía, ocasionalmente se extendía a la superficie interna de la pared torácica, acercándolo así al escáner fluorescente para dar señales más altas para las imágenes del lado izquierdo. Por lo tanto, las imágenes fluorescentes en el lado ventral presentaban con mayor precisión el tumor en el pulmón, pero por lo general tardaban más tiempo en detectarlo. Al final de las imágenes fluorescentes in vivo , los animales fueron sacrificados y sometidos a una disección de tórax abierto e imágenes ex vivo , que no solo confirmaron el establecimiento del tumor ortotópico a partir de la inoculación de MCS, sino que también mostraron múltiples características anatómicas que recapitulaban las cuatro etapas clínicas del NSCLC en humanos. 
En el estudio piloto de eficacia, la fuerte correlación entre las imágenes ex vivo de los pulmones y las imágenes in vivo de ratones portadores de tumores corrobora la fiabilidad de la metodología de imágenes dinámicas de fluorescencia in vivo . El modelo ortotópico de CPCNP respondió de manera confiable a los tratamientos contra el cáncer tanto por el crecimiento más lento del tumor como indicador clave de la eficacia terapéutica como por la pérdida de peso corporal como indicador clave de la toxicidad del fármaco. Dichas respuestas demostraron que el modelo es una herramienta valiosa para la evaluación preclínica y el desarrollo de candidatos a fármacos contra el cáncer. La metástasis, un sello distintivo del cáncer de pulmón, se recapituló fielmente en el modelo y, lo que es más importante, se vio obstaculizada de manera confiable por el medicamento contra el cáncer cisplatino. En este estudio piloto, se observó un crecimiento tumoral más lento con solo dos inyecciones de cisplatino, lo que indica que un efecto anticancerígeno más significativo del cisplatino resultaría de un régimen clínicamente más relevante de cuatro dosis semanales. 
El modelo ortotópico de CPCNP de este informe presenta varias ventajas importantes sobre una serie de modelos animales comunes de cáncer de pulmón. En comparación con los modelos de xenoinjerto subcutáneo de cáncer de pulmón, este modelo ofrece un microambiente tisular más relevante alrededor de los tumores; En comparación con el modelo de ratón modificado genéticamente, este modelo ofrece procedimientos experimentales más convenientes y una progresión tumoral y supervivencia animal más reproducibles. Una comparación completa entre este modelo y otros modelos de cáncer de pulmón está disponible en nuestra publicación anterior18. Al igual que otros modelos animales de xenoinjertos, una limitación de este modelo es la falta de un sistema inmunitario completo, que es un componente importante de los cánceres humanos. Además, los SQM inoculados en este modelo desarrollan ocasionalmente el tumor primario de xenoinjerto en la superficie interna de la pared torácica. Por lo tanto, los procedimientos experimentales para detectar y minimizar fácilmente dicho desarrollo deben incluirse en futuros estudios para mejorar este modelo. Además, se llevarán a cabo estudios en ambos sexos para lograr una comprensión más completa de la biología tumoral y las respuestas al tratamiento en el CPNM. En conclusión, el modelo de xenoinjerto ortotópico murino de cáncer de pulmón de este informe se erige como una herramienta pionera y robusta para recapitular la progresión del cáncer de pulmón y para evaluar los tratamientos contra el cáncer. Este modelo tiene un inmenso potencial para avanzar en nuestra comprensión de la patología del CPNM y para desarrollar las intervenciones terapéuticas correspondientes.

Entre todos los trastornos oncológicos, el cáncer de pulmón no solo inflige la mayor pérdida de vidas, sino que también se cobra el segundo mayor número de nuevos pacientes cada año enlos EE. UU. Esta devastadora neoplasia maligna se erige como un obstáculo importante en la atención sanitaria moderna, lo que exige una comprensión más profunda de su intrincada biología y modalidades terapéuticas más eficaces2. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) representa el 85% de los cánceres de pulmón y tiende a convertirse en tumores sólidos3. Uno de los principales desafíos en el cáncer de pulmón es el microambiente tumoral dinámico y heterogéneo, que influye profundamente en la progresión del cáncer y en las respuestas a las intervenciones terapéuticas 4,5,6. Una comprensión más profunda de la interacción entre las células cancerosas y su microambiente en las diferentes etapas del CPCNP requiere modelos patológicos refinados que recapitulen las características histológicas de la progresión del CPCNP.
En este sentido, los modelos animales ortotópicos emergen como una vía prometedora para la investigación del NSCLC. A diferencia de los modelos de xenoinjertos subcutáneos comúnmente empleados7, los modelos ortotópicos presentan células cancerosas que se inoculan directamente en el órgano de origen. En el caso del cáncer de pulmón, esto significa implantar células cancerosas directamente en el tejido pulmonar 8,9. En consecuencia, los modelos ortotópicos de cáncer de pulmón imitan mejor el microambiente tumoral nativo, incluidos los tejidos, vasos y componentes inmunitarios vecinos, mejorando así su relevancia fisiológica y clínica.
Los esferoides multicelulares tridimensionales (MCS, por sus siglas en inglés) representan otro enfoque prometedor para recapitular las características del entorno tumoral. La mayoría de los cánceres se caracterizan por su complejo microambiente tumoral, que incluye las diversas interacciones célula-célula, la matriz extracelular y los gradientes de oxígeno y nutrientes10,11. Los cultivos celulares 2D tradicionales carecen de la complejidad espacial y estructural necesaria para recapitular estas características específicas del tumor12. Por el contrario, las SQM de tamaño adecuado presentan una estructura heterogénea con un núcleo hipóxico y necrótico, que recapitula no solo el microambiente intratumoral, sino también la barrera fisiológica contra la penetración de fármacos, que es un mecanismo importante de resistencia a los fármacos en la terapia contra el cáncer 13,14,15.
Aprovechando tanto los modelos animales ortotópicos como las técnicas de cultivo de SQM, se ha inoculado SQM a ratones inmunocomprometidos para construir con éxito modelos ortotópicos de cáncer de mama y cáncer de próstata16,17. En este trabajo se presenta la metodología detallada para construir y caracterizar un modelo de xenoinjerto ortotópico murino de cáncer de pulmón. Este método emplea la inoculación intrapulmonar de MCS 3D derivado de células fluorescentes de cáncer de pulmón humano (A549-iRFP)18. Este modelo ofrece una oportunidad excepcional para observar la progresión in vivo del cáncer de pulmón a través de estadios que son muy paralelos a los cuatro estadios clínicos del CPCNP. Además, el cáncer de xenoinjerto de este modelo respondía al fármaco anticancerígeno clínicamente establecido, el cisplatino.

<table><tbody><tr><td>100 y micro; L Jeringa de vidrio</td><td>Hamilton</td><td>Part/REF #80601</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 20 g</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>14 826D</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de esferoide de fijación ultrabaja de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Corning</td><td>15-100-173</td><td></td></tr><tr><td>A549-iRFP</td><td>Imanis Ciencias de la Vida&nbsp;</td><td>CL082-STAN</td><td></td></tr><tr><td>AIN-93M Dieta para roedores maduros&nbsp;</td><td>Dietas de investigación, Inc.</td><td></td><td></td>D10012M</tr><tr><td>Ratón desnudo atímico</td><td>Charles River Laboratories, Inc.</td><td>Código de cepa: 490; homocigoto</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de buprenorfina</td><td>Patterson Número</td><td>NDC veterinario: 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad celular 3D</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno</td><td>Gibco</td><td>A1064401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Herramienta</td><td>de código abierto (https://imagej.net/ij/)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>Versión 5.2</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Número</td><td>NDC veterinario: 17033-0091-25</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Patterson Número</td><td>NDC veterinario: 50989-0161-06</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio&nbsp;</td><td>Keyence</td><td>Número de modelo: BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Infrared Imaging 205 System&nbsp;</td><td>LI-COR Número de</td><td>modelo: 9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS Sistema</td><td>de</td> imágenes para animales pequeños Corning <td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Pearl Trilogy&nbsp;</td><td>LI-COR Número de</td><td>modelo: 9430</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina&nbsp;</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>AAJ67236XF</tr><tr><td>software ReViSP de MATLAB&nbsp;</td><td>Herramienta de código abierto en Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Clips quirúrgicos--AutoClip System</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC Number: 61133-6017-01</td><td></td></tr></tbody></table>

construcción de un modelo de xenoinjerto ortotópico de cáncer de pulmón de células no pequeñas que imita la progresión de la enfermedad y predice las actividades de los fármacos

Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities

El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es una enfermedad altamente letal con un microambiente tumoral complejo y heterogéneo. En la actualidad, los modelos animales comunes basados en la inoculación subcutánea de suspensiones de células cancerosas no recapitulan el microambiente tumoral en el CPCNP. En este trabajo describimos un modelo de xenoinjerto ortotópico murino de cáncer de pulmón que emplea la inoculación intrapulmonar de esferoides multicelulares tridimensionales (MCS). Específicamente, las células fluorescentes de NSCLC humano (A549-iRFP) se cultivaron en microplacas de 96 pocillos de baja adherencia con colágeno durante 3 semanas para formar MCS, que luego se inocularon intercostalmente en el pulmón izquierdo de ratones desnudos atímicos para establecer el modelo de cáncer de pulmón ortotópico.
En comparación con la línea celular A549 original, la MCS de la línea celular A549-iRFP respondió de manera similar a los medicamentos contra el cáncer. La señal fluorescente de longitud de onda larga de las células A549-iRFP se correlacionó fuertemente con marcadores comunes del crecimiento de células cancerosas, incluido el volumen de esferoides, la viabilidad celular y el nivel de proteínas celulares, lo que permitió el monitoreo dinámico del crecimiento del cáncer in vivo mediante imágenes fluorescentes. Después de la inoculación en ratones, el xenoinjerto A549-iRFP MCS progresó de manera confiable a través de fases muy parecidas a las etapas clínicas del NSCLC, incluida la expansión del tumor primario, la aparición de tumores secundarios vecinos y las metástasis de las células cancerosas en el pulmón derecho contralateral y órganos remotos. Además, el modelo respondió al fármaco de referencia contra el cáncer de pulmón, el cisplatino, con la toxicidad prevista y una progresión más lenta del cáncer. Por lo tanto, este modelo de xenoinjerto ortotópico murino de CPNM serviría como plataforma para recapitular la progresión de la enfermedad y facilitar el desarrollo de posibles fármacos contra el cáncer.

Caracterización del MCS A549-iRFP Los MCS A549-iRFP se cultivaron con éxito en microplacas esferoides con la ayuda de colágeno y centrifugación. Cuando la SQM alcanzó un diámetro de aproximadamente 500 μm después de 1 semana, tanto la SQM A549 como la A549-iRFP se expusieron a una variedad de medicamentos y formulaciones contra el cáncer durante 3 días y luego se mantuvieron en un medio de crecimiento sin drogas durante 4 días adicionales. El MCS A549-iRFP exhibió un patrón de respuesta muy similar al de las celdas A549 principales. Los MCS A549 y A549-iRFP mostraron curvas dosis-respuesta y valores de IC50 similares a los del cisplatino, uno de los fármacos anticancerosos de primera línea contra el cáncer de pulmón (Figura 2A). La viabilidad de los MCS A549 y A549-iRFP fue inhibida en grados similares por otros fármacos o formulaciones contra el cáncer (Figura 2B).
El MCS A549-iRFP se monitoreó durante un período de hasta 6 semanas mediante la fluorescencia de iRFP, la viabilidad celular y los niveles de proteínas celulares. El volumen de MCS se estimó mediante simulación de software basada en las imágenes del microscopio de contraste de fase, y la morfología simulada exhibió formas similares a las obstruidas por el microscopio y la señal fluorescente (Figura 2C). La viabilidad celular de A549-iRFP MCS se cuantificó mediante un ensayo de viabilidad celular 3D, y el ensayo se validó con MCS de varios tamaños de 350 a 950 μm de diámetro. No se observaron diferencias significativas en varias relaciones de volumen entre el medio de crecimiento que contenía MCS y el reactivo de ensayo, y entre diferentes tiempos de agitación de 5 minutos y 10 minutos. (Figura suplementaria S1). Los cuatro biomarcadores aumentaron con el tiempo, con mayores variaciones en puntos temporales posteriores (Figura 2D). La fluorescencia de iRFP mostró fuertes correlaciones con las otras tres mediciones cuantitativas más tradicionales de MCS: volumen (Pearson r = 0.9307, p &lt; 0.0001), viabilidad celular (Pearson r = 0.7666, p &lt; 0.0001) y proteína celular (Pearson r = 0.7317, p &lt; 0.0001) (Figura 2E).
Progresión tumoral en ratones Después de crecer durante 2-3 semanas, se seleccionó para la inoculación tumoral el MCS A549-iRFP con características apropiadas, incluyendo morfología, diámetro de MCS, bordes rugosos apropiados y señal fluorescente (para parámetros detallados, ver sección 3 del protocolo). Después de la cirugía de inoculación del tumor, se midió el peso corporal de los ratones portadores de tumores cada 3 días y se presentó como la relación de cambio en comparación con el peso en el día 0 justo antes de la cirugía. El peso corporal del ratón disminuyó ligeramente después de la cirugía y se recuperó rápidamente en 1 semana. Sin tratamiento, el peso corporal aumentó gradualmente hasta el ~día 40, pero disminuyó drásticamente (~15%) en la semana siguiente, lo que llevó a la eutanasia (sobredosis de anestésico triple: 80 mg/kg de ketamina y 12 mg/kg de xilacina mediante inyección IP) de ratones según las directrices de la IACUC (Figura 3A). Se tomaron imágenes de ratones portadores de tumores cada 3 días en cuatro posturas: lado izquierdo, dorsal, derecho y ventral. Entre estas, se seleccionaron la izquierda (donde se inocula el tumor) y la ventral (donde se pueden observar ambos lados de los pulmones) como posturas clave para la cuantificación de la intensidad neta fluorescente de acuerdo con la ecuación (1) (Figura 3B,C). La intensidad neta de fluorescencia de ambas posturas mostró una tendencia similar de progresión tumoral, con una fluorescencia del lado ventral que creció ligeramente más lentamente que la del lado izquierdo.
El xenoinjerto de SQM en este modelo ortotópico progresó a través de distintas fases que reflejan los cuatro estadios clínicos del CPNM (Figura 3D)18,19,20. Alrededor del día 8 después de la inoculación de la SQM, surgió una fluorescencia concentrada en el pulmón izquierdo, lo que significa el establecimiento de un tumor localizado en línea con el CPCNP en etapa 1 en entornos clínicos. Aproximadamente para el día 11, la fluorescencia se intensificó notablemente y/o se dispersó en múltiples sitios en el pulmón izquierdo, lo que indica la presencia de tumores que se asemejan al CPCNP en estadio 2. Posteriormente, aproximadamente al día 18, se observó un aumento de las señales fluorescentes desde el lado ventral, lo que sugiere una progresión del xenoinjerto similar a la etapa 3. Además, el examen anatómico y las imágenes ex vivo revelaron crecimiento tumoral en la superficie del corazón, un sello distintivo importante del CPCNP en estadio 3. Aproximadamente el día 27 después de la inoculación de la SQM, apareció fluorescencia perfundida en ambos lados del pulmón y la anatomía de tórax abierto reveló crecimiento tumoral perfundido en el corazón, la tráquea y los vasos sanguíneos principales, lo que indicaba metástasis de cáncer similar al CPCNP en estadio 4.
Respuesta de ratones portadores de tumores al cisplatino Se llevó a cabo un estudio piloto de eficacia en este modelo murino de cáncer de pulmón ortotópico. Diez días después de la inoculación del tumor, se inyectaron 5 mg/kg de cisplatino o solución salina normal a través de la vena de la cola de ratones portadores de tumores, una inyección por semana, con un total de dos inyecciones. Las imágenes del lado ventral en ratones portadores de tumores se presentan en la Figura 4A. El peso corporal y la fluorescencia tumoral se monitorizaron cada 3-4 días. En comparación con el grupo de solución salina normal, los ratones del grupo de cisplatino perdieron significativamente peso corporal después de cada inyección de cisplatino, pero se recuperaron en las semanas posteriores al tratamiento con cisplatino (Figura 4B). La intensidad neta de fluorescencia en el grupo de cisplatino mostró una tendencia de aumento más lenta que la del grupo de solución salina (Figura 4C). Al final del monitoreo de fluorescencia in vivo, los animales fueron sacrificados y sus pulmones fueron diseccionados y visualizados por fluorescencia. Después de la normalización por la proteína tisular total, se confirmó que la intensidad fluorescente de los pulmones disecados de ratones en el grupo de cisplatino era menor que la del grupo de solución salina normal. (Figura 4E). En las imágenes de fluorescencia ventral (Figura 4A), las imágenes de los rectángulos rojos indican la primera vez que se visualizó la fluorescencia del tumor en los pulmones izquierdo y derecho, lo cual es un indicador clave de metástasis tumoral en el CPCNP en estadio IV. El cisplatino, uno de los fármacos de primera línea contra el cáncer de pulmón, ralentizó la metástasis tumoral desde el pulmón izquierdo hasta el pulmón derecho (Figura 4D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo del estudio. (A) Siembra de células A549-iRFP en microplacas esferoides para formar MCS con la ayuda de colágeno y centrifugación. (B) Inoculación intrapulmonar de A549-iRFP MCS con características apropiadas en el pulmón izquierdo de un ratón para construir el modelo ortotópico de xenoinjerto de cáncer de pulmón, imitando las cuatro etapas del cáncer de pulmón en entornos clínicos. La jeringa blanca que contiene un MCS indica la inoculación del tumor, mientras que las dos jeringas rojas indican un tratamiento farmacológico administrado a través de la vena de la cola. Abreviatura: MCS = esferoide multicelular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig02.jpg"> Figura 2: Caracterización de A549-iRFP MCS. (A) Curvas dosis-respuesta de A549-iRPF MCS y A549 MCS a cisplatino después de 3 días de exposición y 4 días de crecimiento sin fármaco (media ± DE, N = 3-4). (B) Viabilidad celular de A549-iRFP MCS después de 3 días de exposición a tratamientos contra el cáncer (cisplatino, paclitaxel o dos formulaciones de fármacos desarrolladas internamente) y crecimiento sin fármacos a los 4 días (media ± DE, N = 3-4). (C) Estudios morfológicos de MCS A549-iRFP representativo después de 1-6 semanas de cultivo mediante microscopía de fase de contraste (C1, barra de escala = 500 μm), microscopía confocal fluorescente (C2) y simulación de software (C3). (D) Cambio dinámico de la fluorescencia de iRFP, el volumen, la viabilidad celular y la proteína celular de A549-iRFP MCS durante 1-6 semanas (N = 10 para la fluorescencia y el volumen de iRFP; N = 5 para la viabilidad celular y la proteína celular). (E) Correlación de la fluorescencia iRFP de A549-iRFP MCS con las otras tres mediciones tradicionales de crecimiento (volumen, viabilidad celular y proteína celular) durante 1-6 semanas (N = 60). (F) Un ejemplo de MCS A549-iRFP de características apropiadas para la inoculación tumoral (barra de escala = 500 μm). Abreviatura: MCS = esferoide multicelular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig03.jpg"> Figura 3: Progresión tumoral en el modelo ortotópico murino de CPNM. (A) Cambio en el peso corporal de los ratones después de la inoculación tumoral (media ± SEM, N = 5). (B) Cambio dinámico de la intensidad fluorescente neta en ratones portadores de tumores basado en imágenes del lado izquierdo (N = 5). (C) Cambio dinámico de la intensidad fluorescente neta en ratones portadores de tumores basado en imágenes del lado ventral (N = 5). (D) Progresión del cáncer que imita los cuatro estadios clínicos del CPCNP. Imágenes del lado izquierdo, imágenes del lado ventral, observación anatómica (las flechas amarillas indican tumores en el pulmón y en la superficie del corazón) e imágenes ex vivo de ratones representativos portadores de tumores en cuatro etapas. Esta figura está tomada de Huang et al.18. Abreviatura: NSCLC = cáncer de pulmón de células no pequeñas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig04.jpg"> Figura 4: Respuesta de los ratones portadores de tumores al cisplatino. (A) Imágenes del lado ventral de ratones portadores de tumores después del tratamiento con solución salina o cisplatino (las imágenes en rectángulos rojos indican cuándo se puede visualizar por primera vez la fluorescencia del tumor tanto en el pulmón izquierdo como en el derecho). (B) Cambio en el peso corporal de ratones portadores de tumores después de tratamientos con solución salina o cisplatino (media ± SEM, N = 3-4). (C) Cambio dinámico de la intensidad fluorescente neta en ratones portadores de tumores después de tratamientos con solución salina o cisplatino basado en imágenes del lado ventral (media ± SEM, N = 3-4). (D) Porcentaje de ratones que muestran fluorescencia tumoral tanto en el pulmón izquierdo como en el derecho. (E) Intensidad fluorescente normalizada de pulmones diseccionados de ratones sacrificados al final de la obtención de imágenes fluorescentes in vivo (media ± SEM, N = 3-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria S1: Ensayo de viabilidad celular 3D en MCS A549-iRFP de varios diámetros. (A) ~350 μm; (B) ~550 μm; (C) ~750 μm; (D) ~950 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787_Supplementary%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este estudio presenta un modelo ortotópico de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) basado en la inoculación intrapulmonar de esferoides multicelulares de células fluorescentes A549-iRFP. El modelo recapitula los estadios clínicos del CPNM y responde al cisplatino, de acuerdo con la monitorización dinámica in vivo de la fluorescencia de longitud de onda larga.

Construcción de un modelo de xenoinjerto ortotópico de cáncer de pulmón de células no pequeñas que imita la progresión de la enfermedad y predice las actividades de los fármacos

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a highly lethal disease with a complex and heterogeneous tumor microenvironment. Currently, common animal models ...

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