Name: Formación de organoides de timo humano en hidrogeles de fibrina tridimensionales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 31 s
Description: Aprende a generar organoides de timo humano en hidrogeles de fibrina tridimensionales para estudiar autotolerancia y autoinmunidad. Este protocolo permite mantener organoides durante seis semanas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Recreando el microambiente tímico con organoides derivados de iPSC

<ol><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Carpenter, A. C., Bosselut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+checkpoints+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decision checkpoints in the thymus.</a> Nat Immunol. 11 (8), 666-673 (2010).</li>
<li>Miller, J. F. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+thymus+and+its+impact+on+modern+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The function of the thymus and its impact on modern medicine.</a> Science. 369 (6503), eaba2429 (2020).</li>
<li>Haddad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus-colonizing+cells+during+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus-colonizing cells during human development.</a> Immunity. 24 (2), 217-230 (2006).</li>
<li>Cumano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+insights+into+immune+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New molecular insights into immune cell development.</a> Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).</li>
<li>Bautista, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+human+thymic+stroma+uncovers+novel+cellular+heterogeneity+in+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla.</a> Nat Commun. 12 (1), 1096(2021).</li>
<li>Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cell+heterogeneity%3A+TEC+by+TEC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC.</a> Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).</li>
<li>Alves, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+progression+of+cortical+and+medullary+thymic+epithelial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments.</a> Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Tavian, M., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+human+hematopoietic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the human hematopoietic system.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).</li>
<li>Abramson, J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells.</a> Annu Rev Immunol. 35 (1), 85-118 (2017).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Sharma, H., Moroni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+regenerative+approaches+for+thymus+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation.</a> Adv Sci. 8 (14), 2100543(2021).</li>
<li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+all+signals+point+to+cytoskeleton%2C+matrix%2C+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins.</a> Sci STKE. 2002 (119), 6(2002).</li>
<li>Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -J., Boukamp, P., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).</li>
<li>Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+thymic+extracellular+matrix+improves+in+vivo+thymic+organoid+T+cell+output%2C+and+drives+in+vitro+thymic+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation.</a> Biomaterials. 118, 1-15 (2017).</li>
<li>Asnaghi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+extracellular+matrix-derived+scaffolds+support+graft-resident+thymopoiesis+and+long-term+in+vitro+culture+of+adult+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells.</a> Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747(2021).</li>
<li>Villegas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+thymic-derived+cells+display+medullary+thymic+epithelial+cell+phenotype+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality.</a> Front Immunol. 9, 1663(2018).</li>
<li>Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+TGF-%CE%B2+signaling+in+the+establishment+and+function+of+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla.</a> Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Campinoti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+thymus+by+postnatal+stromal+progenitor+cells+and+natural+whole-organ+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds.</a> Nat Commun. 11 (1), 6372(2020).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+thymus+organoids+to+restore+thymic+function+and+induce+donor-specific+immune+tolerance+to+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts.</a> Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).</li>
<li>Provin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatory+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+generates+thymic+epithelium+that+supports+thymic+crosstalk+and+directs+dendritic-+and+CD4%2FCD8+T-cell+full+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development.</a> bioRxiv. 2023, 572664(2023).</li>
<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+that+supports+host+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+thymic+epithelial+progenitor-like+cells+reconstitutes+the+thymic+microenvironment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).</li>
<li>Inami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+to+thymic+epithelial+cells+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype.</a> Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).</li>
<li>Gras-Pena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+thymic+epithelial+cells+enhance+human+T+cell+development+in+a+xenogeneic+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).</li>
<li>Lai, L., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+thymic+epithelial+cell+progenitors+by+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+thymic+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).</li>
<li>Provin, N., Giraud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+thymic+epithelial+cells+and+generation+of+thymic+organoids%3A+Applications+for+therapeutic+strategies+against+APECED%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED.</a> Front Immunol. 13, 930963(2022).</li>
<li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+murine+thymopoiesis+from+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells.</a> Cell Rep. 33 (4), 108320(2020).</li>
<li>Park, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+T+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), 3224(2020).</li>
<li>Flippe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reproducible+differentiation+of+hematopoietic+and+T+cell+progenitors+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 577464(2020).</li>
<li>Padonou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire-dependent+transcripts+escape+Raver2-induced+splice-event+inclusion+in+the+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium.</a> EMBO Rep. 23 (3), e53576(2022).</li>
<li>Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-oxygen+submersion+fetal+thymus+organ+cultures+enable+FOXN1-dependent+and+-independent+support+of+T+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis.</a> Front Immunol. 12, 652665(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-165</td><td></td></tr><tr><td>CCR7 (CD197)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>PE Clone: 3D12; Dilución: 1:200</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>Clon: M5E2; Dilución: 1: 200</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clon: HIB19; Dilución: 1:200</td></tr><tr><td>CD205</td><td>BioLegend</td><td>FITC</td><td>Clon: MG38; Dilución: 1:200</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clon: HIT3a; Dilución: 1:200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>Clon: 8G12; Dilución: 1:100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clon: RPA-T4; Dilución: 1:100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BV711</td><td>Clon: L200; Dilución: 1:200</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>PerCP</td><td>Clon: HI30; Dilución: 1:200</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clon: B159; Dilución: 1:200</td></tr><tr><td>CD62L</td><td>BD Biosciences</td><td>BV605</td><td>Clon: DREG-56; Dilución: 1:200</td></tr><tr><td>CD69</td><td>BD Biosciences</td><td>BV510</td><td>Clon: FN50; Dilución: 1:200</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD Biosciences</td><td>clon APC</td><td>: M-T701; Dilución: 1:200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PeCy7</td><td>Clon: RPA-T8; Dilución: 1: 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clon: HIT8a; Dilución: 1: 200</td></tr><tr><td>Dynabeads Pan Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clon: HEA-125; Dilución: 1: 200</td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>Miltenyi</td><td>BV711</td><td>Clon: EBA-1; Dilución: 1: 200</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Miltenyi</td><td>130-127-858</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Biotechne R& D</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinógeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341578</td><td></td></tr><tr><td>FLT3 L</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-19</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>IGF1</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-886</td><td></td></tr><tr><td>IL7</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-07</td><td></td></tr><tr><td>RANK L</td><td>Biotechne R& D</td><td>6449-TEC</td><td></td></tr><tr><td>Solución de lisis de glóbulos rojos</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-07</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605190</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>2605010</td><td></td></tr><tr><td>XVIVO10</td><td>Lonza</td><td>LONBE04-380Q</td><td></td></tr></tbody></table>

formación de organoides de timo humano en hidrogeles de fibrina tridimensionales

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

El flujo de trabajo del protocolo se resume en la Figura 4. Para este modelo de cultivo de organoides en 3D, adoptamos un hidrogel de trombina y fibrinógeno que había sido utilizado previamente por nuestro equipo para mantener los mTEC primarios de ratón durante un par de días, gracias a las señales físicas y mecánicas que proporcionaba34. Después de la polimerización, el gel debe mostrar una estructura de malla suelta, similar a una esponja (Figura 5).
Después de la fase inicial de siembra y fijación, los organoides crecieron y se desarrollaron progresivamente tanto en la superficie como dentro de las capas superiores del gel. Dependiendo de las propiedades del gel, las condiciones de siembra y el número de organoides sembrados en el gel, los organoides formaron estructuras esféricas a oblongas (Figura 6) y ocasionalmente se fusionaron para formar estructuras más grandes. Después de la primera semana de cultivo, se observaron dos subniveles particulares de la organización dentro de los organoides: en primer lugar, observamos estructuras largas, en forma de proyección en la superficie celular, formadas por células grandes que irradiaban desde los organoides y colonizaban el hidrogel en todas las direcciones (Figura 6 y Figura 7). En segundo lugar, observamos estructuras en forma de cúmulo formadas por células más pequeñas que se concentran alrededor de esas proyecciones celulares. Aunque no hemos sido capaces de aislar ambos tipos de células para confirmar la hipótesis del estudio, este fenómeno recuerda a los arreglos 3D encontrados dentro de la corteza tímica, formados por la interacción de cTECs individuales con un gran número de linfocitos T en desarrollo mucho más pequeños, conocidos como complejos de células nodrizas tímicas11 (Figura 8).
En varios momentos de la fase de cultivo de organoides, evaluamos la composición celular de los organoides tímicos mediante citometría de flujo e identificamos varios compartimentos clave: TEC (caracterizado como EPCAM+ CD45-), timocitos (EPCAM- CD45+ CD3+) (Figura 9), así como un compartimento EPCAM-CD45+ CD3- que comprende subconjuntos de hematopoyéticos tímicos no timocitos. Más detalles se pueden encontrar en Provin et al.23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig01.jpg"> Figura 1: Caracterización de la diferenciación de iPSC a TEP. (A) Ejemplo de diferenciación de iPSC a TEP en D13, microscopio de contraste de fase invertida, 400x. Barra de escala: 500 μm. (B) Ejemplo de diagrama de puntos, la proporción de células EPCAM+ entre las células DAPI- en el día 14 de diferenciación, imagen de FlowJo 10.0.7. (C) Inmunotinción contra DAPI (azul), PAX9 (rojo) y KRT8 (verde), inmunofluorescencia e imágenes confocales en el día 16 de la diferenciación de iPSC a TEP. Las flechas blancas señalan ejemplos de tinción anti-PAX9. Barra de escala: 50 μm (D) Nivel de expresión de FOXN1 (RQ a GAPDH) durante la diferenciación de iPS a TEP. TEC: Referencia de control positivo, TEC humanos primarios aislados de muestras de timo pediátrico. Gráfico de Prism (GraphPad versión 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig02.jpg"> Figura 2: Configuración experimental para la formación de hidrogeles, la siembra de organoides y la distribución del medio de cultivo. (A) Placa de cultivo con hidrogeles fundidos en insertos colgantes colocados en las filas superior e inferior. (B) Siembra de organoides: el cono de pipeta cortado que contiene 1 organoide se coloca sobre el hidrogel sin tocarlo, y el organoide se siembra suavemente en la superficie del gel. (C) El medio de cultivo se deposita en el pozo de cultivo colocando la punta de la pipeta entre los brazos del inserto colgante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig03.jpg"> Figura 3: D0 de cultivo de organoides tímicos antes de la siembra (días 13-15 del protocolo completo). (A) organoide producido con TECs derivados de la línea Lon71.019 iPS. (B) Organoide producido con TECs derivados de la línea MIPS203.003 iPS. Microscopio de contraste de fase invertida, 1000x. Barras de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig04.jpg"> Figura 4: Representación resumida de todos los pasos del protocolo. Se recogieron y disociaron muestras de timo pediátrico, y se clasificaron las ETP primarias de Lin-CD34+ CD7+ mediante citometría de flujo. La diferenciación de las células iPS se llevó a cabo hacia una identidad TEP. Los ETPs y los TEPs derivados de iPS se agruparon y sembraron en placas de 96 pocillos de baja unión y se agregaron en organoides tímicos durante la noche. Los hidrogeles de fibrina se prepararon a partir de aprotinina, fibrinógeno y trombina y se fundieron en insertos colgantes. Después de la polimerización, los organoides se sembraron sobre los hidrogeles y se agregó el medio de cultivo de fase 1 a los pocillos. Los organoides se mantuvieron en cultivo hasta por 6 semanas. Creado en BioRender, licencia de publicación AG26EFCZOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig05.jpg"> Figura 5: Organización y estructura del hidrogel. Microscopio de contraste de fase invertida, 1000x. Barra de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig06.jpg"> Figura 6: Organoides maduros y estructura tridimensional. (A) Organoide tímico en el día 24 de cultivo 3D, línea MIPS203.003 iPS. (B) Imagen compuesta de un organoide tímico en el día 32 de cultivo 3D, línea Lon71.019 iPS. Microscopio de contraste de fase invertida. Barras de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig07.jpg"> Figura 7: Detalle de la estructura de los organoides tímicos. (A) Organoide tímico en el día 32 del cultivo 3D, línea L71.019 iPS. (B) Organoide tímico en el día 27 de cultivo 3D, línea L80.002 iPS. Microscopio de contraste de fase invertida, 400x. Barras de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig08.jpg"> Figura 8: Detalle de la estructura de un organoide tímico en el día 32 de cultivo 3D. Las flechas blancas señalan grupos de pequeños timocitos que proliferan muy cerca de las células TEC. Microscopio de contraste de fase invertida, 400x. Barra de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig09.jpg"> Figura 9: Proporción del compartimento de los linfocitos T dentro de los organoides tímicos. (A) Ejemplo de diagrama de puntos, proporción de células CD45+ CD3+ dentro de las células vivas (DAPI-) en organoides tímicos en el día 35 de cultivo 3D, imagen de FlowJo 10.0.7. La fracción CD45+ CD3- comprende células hematopoyéticas no timocitas. (B) La proporción de células CD45+ CD3+ dentro de las células vivas en organoides tímicos en los días 17, 24/25, 32 y 39/40 de cultivo 3D, n = 2 en duplicado o triplicado técnico, gráfico de Prism (GraphPad versión 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Unidad</td>
			<td>Fase 1: medio: Día 14 hasta el Día 18</td>
			<td>Fase 2 medio Día 19 en adelante</td>
		</tr><tr><td>Base</td>
			<td></td>
			<td>XVIVO10</td>
			<td>XVIVO10</td>
		</tr><tr><td>BMP4</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF8</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF10</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>IGF1</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FEAG</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>RANGO L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>IL7</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FLT3 L</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>SCF</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>Glutamax</td>
			<td>ng/mL</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Suplementos y sus respectivas concentraciones.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Aprotinina (μL)</td>
			<td>Trombina (μL)</td>
			<td>Fibrinógeno (μL)</td>
			<td>Fase 1 medio</td>
			<td>Organoides (unidad)</td>
		</tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td>
			<td>5</td>
			<td>75</td>
			<td>75</td>
			<td>1</td>
			<td>De 3 a 5</td>
		</tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td>
			<td>9.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>1.8</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td>
			<td>16</td>
			<td>240.8</td>
			<td>240.8</td>
			<td>3.2</td>
			<td>De 8 a 9</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Proporciones requeridas de componentes para la preparación de hidrogeles y la siembra de organoides en placas de 6, 12 y 24 pocillos.

Formación de organoides de timo humano en hidrogeles de fibrina tridimensionales

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

formation-human-thymus-organoids-three-dimensional-fibrin

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Investigación

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En este video la preparación de 2-dGuo tratados reaggregate culturas timo se demuestra.

Reaggregate Culturas del timo

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3D organotípicos Co-cultura de apoyo medular tímica epitelial proliferación celular, la diferenciación y la Expresión Génica Promiscuo Modelo

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