Name: Tratamiento sistémico para ratones adultos posnatales, juveniles y revolucionados mediante inyección en el seno retrobulbar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Aprende el protocolo de inyección retrobulbar en ratones para terapia génica en acidemias orgánicas. Este método permite la administración sistémica en animales pequeños y avanza la investigación de tratamientos para trastornos metabólicos.

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Agradecemos la ayuda del personal del Centro de Ratones del NHGRI, del Laboratorio de Patología Molecular del NCI y, especialmente, de Andrew Warner. R.J.C. cuenta con el apoyo del Programa de Investigación Intramuros del NHGRI hasta 1ZIAHG200318-16 y este trabajo fue parcialmente financiado por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NCATS). La Figura 2C se creó con BioRender.

Este protocolo y el video que lo acompaña son para el espacio de inyección retrobulbar de ratones postnatales, juveniles y adultos corridos mediante inyección en el seno retrobulbar; el protocolo ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano bajo el número de protocolo G-03-4. Otras instituciones pueden tener diferentes requisitos y restricciones, y es posible que este protocolo deba modificarse para su aprobación en su instituto. Obtenga la aprobación de la ACUC de su institución antes de realizar este o cualquier otro procedimiento con animales.
1. Preparación previa a la inyección
<ol><li>Diluya el AAV hasta el volumen y la concentración de inyección deseados con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml para cada inyección. Agregue un volumen adicional del 50% para cada inyección para permitir un llenado preciso de la jeringa estéril de un solo uso. NOTA: Aquí diluimos un reportero AAV8-CAG-eGFP para administrar una dosis de 1 × 1013genomas virales por kg de masa corporal (vg/kg) en un volumen de 50 μL. La cantidad de AAV en los 50 μL que se van a inyectar se calcula utilizando el peso del animal en el momento de la inyección. En este video, el AAV se inyecta a través de la vía retrobulbar para replicar la administración sistémica en humanos. Otros vectores de terapia génica (es decir, lentivirus, adenovirus), terapias de ARN y moléculas pequeñas se pueden administrar sistémicamente mediante este procedimiento.</li>
	<li>Asegúrese de que el sistema de anestesia para animales de laboratorio (LAAS) esté configurado y funcione correctamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. NOTA: Si se utiliza un método de anestesia alternativo, asegúrese de preparar la anestesia antes de comenzar las inyecciones. El procedimiento de inyección retrobulbar debe ser compatible con la mayoría de las anestesias (por ejemplo, una restricción química inyectable como la ketamina y la xilacina).</li>
	<li>Antes de llenar la jeringa estéril de un solo uso (en este caso, una jeringa de insulina de 31 g, 8 mm de largo, 3/10 ml de capacidad), mueva el émbolo hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurarse de que el émbolo se pueda presionar suavemente. Luego, llene la jeringa hasta el volumen deseado, asegurándose de que no haya burbujas de aire. NOTA: Se pueden inyectar volúmenes de hasta 150 μL; nuestro laboratorio suele inyectar un volumen de 50 μL.</li>
</ol>2. Sedación en ratones mediante la administración de gas isoflurano con un sistema de anestesia para animales de laboratorio (LAAS)
<ol><li>Asegúrese de que el gas solo fluya a la cámara de inducción. Cierre la llave de paso bidireccional al circuito sin reinhalación (NRB).</li>
	<li>Encienda la perilla verde de flujo de oxígeno en la parte delantera del medidor de flujo para que haya un caudal de 1 L / min.</li>
	<li>Aumente el isoflurano al ≤4% presionando la palanca en la parte superior del vaporizador y girando el dial a la concentración deseada.</li>
	<li>Coloque el mouse en la cámara de inducción transparente. Observe atentamente la respiración y el movimiento del animal. Una vez que el animal esté recostado, baje la perilla del vaporizador hasta un 2-2,5% de isoflurano.</li>
	<li>Abra la llave de paso bidireccional al circuito NRB conectado a la mascarilla y cierre el flujo de gas a la caja de inducción.</li>
	<li>Retire al animal y colóquelo en la mascarilla del circuito NRB.</li>
	<li>Baje el ajuste de concentración de isoflurano a 1.5%-1.75%, según lo determine la reacción a los estímulos (por ejemplo, pellizcar los dedos de los pies o apretar las patas).</li>
	<li>Siempre controle continuamente la respiración del ratón y el color de las membranas mucosas (si es posible). Si la respiración del animal se vuelve dificultosa o el color de la membrana mucosa no es rosado, baje la concentración de anestésico.</li>
	<li>Mantenga al animal caliente durante todo el procedimiento. Use un calentador de manos envuelto en una toalla de papel que se coloca debajo de la almohadilla y se encuentra directamente debajo del mouse.</li>
	<li>Apague el oxígeno y el vaporizador después de completar el procedimiento.</li>
</ol>3. Inyección del animal
<ol><li>Si es diestro, inyecte el ojo derecho del ratón y colóquelo en su lado izquierdo con el hocico apuntando hacia la mano derecha. Si es zurdo, inyecte el ojo izquierdo del ratón y colóquelo en su lado derecho con el hocico apuntando hacia la mano izquierda.</li>
	<li>Aplique una o dos gotas de anestésico oftálmico en el globo ocular, que se va a inyectar. A continuación, retire el exceso de solución anestésica oftálmica con una gasa absorbente estéril. Aplique una presión suave con las yemas de los dedos sobre la piel dorsal y ventral al ojo para sobresalir parcialmente el globo ocular del ratón de la cuenca (Figura 2A, B). NOTA: Tenga cuidado de no aplicar una presión excesiva a los vasos cervicales circundantes al sobresalir el ojo, ya que esto impedirá el flujo sanguíneo y la inyección. Además, aplicar presión a la tráquea podría impedir que el ratón respire. Asegúrese de que el ratón pueda respirar durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Mantenga la aguja en posición biselada hacia abajo en un ángulo de aproximadamente 30° y colóquela en el canto medial (Figura 2C). NOTA: La profundidad de la colocación de la aguja para llegar al seno retrobulbar variará según el tamaño del animal. Tener la aguja en la posición de bisel hacia abajo durante la inyección disminuye el riesgo de daño ocular. Tenga cuidado de no colocar la aguja demasiado profunda y perforar la cuenca del ojo. La inyección debería durar menos de un minuto.</li>
	<li>Aplique presión lenta y suavemente al émbolo de la jeringa para administrar la inyección. Esto reducirá la posibilidad de extravasación.</li>
	<li>Retire la aguja lenta y suavemente.</li>
	<li>Retire la mascarilla del ratón para permitir la recuperación de la anestesia.</li>
</ol>4. Inyección posterior
<ol><li>Apague el oxígeno y el vaporizador después de completar el procedimiento.</li>
	<li>Use una gasa estéril para extraer la sangre si se produce sangrado residual.</li>
	<li>Asegúrese de que el ratón esté en una zona cálida (aproximadamente 37 °C), pero no excesivamente caliente, para evitar la hipotermia durante la recuperación de la anestesia.</li>
	<li>Observe al ratón de forma aislada hasta que se recupere por completo antes de devolverlo a la jaula y al estante. NOTA: Aislar al ratón durante la recuperación evita que los compañeros de jaula lastimen al ratón sedado durante la recuperación.</li>
</ol>

Administración sistémica efectiva en ratones mediante la técnica de inyección retrobulbar

<ol><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+human+disease%3A+An+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Med+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li>
<li>Samelson-Jones, B. J., George, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+therapy+for+hemophilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene therapy for hemophilia.</a> Annu Rev Med. 74, 231-247 (2023).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrobulbar+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retrobulbar injections in mice.</a> Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+for+methylmalonic+acidemia+using+the+novel+adeno-associated+viral+vector+44.9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy for methylmalonic acidemia using the novel adeno-associated viral vector 44.9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 61-72 (2022).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+aav9+gene+therapy+improves+the+lifespan+of+mice+with+niemann-pick+disease%2C+type+c1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Systemic aav9 gene therapy improves the lifespan of mice with niemann-pick disease, type c1.</a> Hum Mol Genet. 26 (1), 52-64 (2017).</li>
<li>Venturoni, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+advantage+of+corrected+hepatocytes+in+a+juvenile+model+of+methylmalonic+acidemia+following+liver+directed+adeno-associated+viral+mediated+nuclease-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Growth advantage of corrected hepatocytes in a juvenile model of methylmalonic acidemia following liver directed adeno-associated viral mediated nuclease-free genome editing.</a> Mol Genet Metab. 137 (1-2), 1-8 (2022).</li>
<li>Ilyinskii, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immtor+nanoparticles+enhance+aav+transgene+expression+after+initial+and+repeat+dosing+in+a+mouse+model+of+methylmalonic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Immtor nanoparticles enhance aav transgene expression after initial and repeat dosing in a mouse model of methylmalonic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 22, 279-292 (2021).</li>
<li>Davidson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+systemic+aav+gene+therapy+with+a+neurotrophic+capsid+in+niemann-pick+disease+type+c1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Improved systemic aav gene therapy with a neurotrophic capsid in niemann-pick disease type c1 mice.</a> Life Sci Alliance. 4 (10), e202101040(2021).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+using+an+aav44.9+vector+rescues+a+neonatal+lethal+mouse+model+of+propionic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy using an aav44.9 vector rescues a neonatal lethal mouse model of propionic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 181-190 (2023).</li>
<li>Rocha-Ferreira, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neonatal+rodent+model+of+retroorbital+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A neonatal rodent model of retroorbital vein injection.</a> J Vis Exp. (204), e65386(2024).</li>
<li>Bohnert, B. N., Artunc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+nephrotic+syndrome+in+mice+by+retrobulbar+injection+of+doxorubicin+and+prevention+of+volume+retention+by+sustained+release+aprotinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of nephrotic syndrome in mice by retrobulbar injection of doxorubicin and prevention of volume retention by sustained release aprotinin.</a> J Vis Exp. (135), e57642(2018).</li>
<li>Bohnert, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrobulbar+sinus+injection+of+doxorubicin+is+more+efficient+than+lateral+tail+vein+injection+at+inducing+experimental+nephrotic+syndrome+in+mice%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study.</a> Lab Anim. 53 (6), 564-576 (2019).</li>
<li>Meijer, M. K., Spruijt, B. M., Van Zutphen, L. F., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+restraint+and+injection+methods+on+heart+rate+and+body+temperature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice.</a> Lab Anim. 40 (4), 382-391 (2006).</li>
<li>Nohara, M., Tohei, A., Sato, T., Amao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+response+to+restraint+stress+by+salivary+corticosterone+levels+in+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of response to restraint stress by salivary corticosterone levels in adult male mice.</a> J Vet Med Sci. 78 (5), 775-780 (2016).</li>
<li>Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+routes+of+antibody+administration+in+pharmacokinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies.</a> Lab Anim (NY). 43 (3), 95-99 (2014).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aav+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of aav serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada relevante para esta publicación que revelar.

Si bien la inyección retrobulbar es un método confiable para administrar moléculas pequeñas, proteínas y terapias genómicas, es necesario practicar la técnica con un tinte para garantizar que se logre una administración sistémica confiable y replicable. Se recomienda encarecidamente el uso de un colorante para practicar inyecciones retrobulbares en ratones antes de utilizar esta vía de administración en experimentos. Los colorantes se pueden comprobar visualmente en los tejidos del ratón para garantizar una administración sistémica constante.
En nuestra demostración de la técnica de inyección retrobulbar, se utilizó gas isoflurano para anestesiar a los ratones antes del procedimiento. Se pueden usar otras formas de anestesia antes del procedimiento, pero es importante asegurarse de que el ratón no se recupere de la sedación antes de que se complete la inyección. Afortunadamente, la inyección real suele tardar menos de un minuto y el tiempo durante el cual el ratón debe estar completamente anestesiado es breve. El ratón debe estar completamente sedado durante la inyección, y se debe volver a administrar la anestesia si el ratón está consciente antes de la inyección. Dado que existen riesgos asociados con el uso de anestesia, se debe minimizar la duración del tiempo que el ratón está sedado. No hemos tenido problemas con el uso de isoflurano para sedar pequeños ratones enfermos con acidemia metilmalónica y propiónica. Sin embargo, algunos modelos de ratón pueden ser más sensibles a la sedación y a cierta anestesia. Este problema potencial debe considerarse antes de intentar utilizar la sedación en un estudio. Por último, el uso de la sedación en combinación con la inyección retrobulbar reduce en gran medida el sufrimiento aparente que presenta el ratón durante el proceso de inyección en comparación con la TVI, donde la sedación no se usa comúnmente.
No hemos observado ningún problema relacionado con la inyección, aunque la infección es un riesgo potencial con cualquier inyección. Para reducir la posibilidad de infección, se utiliza una jeringa desechable estéril de un solo uso y PBS estéril para diluir el AAV purificado. Todos los ratones en nuestras instalaciones para animales son revisados diariamente para detectar signos de posibles problemas de salud y reciben atención veterinaria para abordar cualquier problema de salud cuando se justifica.
La alternativa a la inyección en el seno retrobulbar y el método más utilizado de administración sistémica en ratones jóvenes y adultos es la TVI. La TVI y la inyección en el seno retrobulbar dan lugar a una biodistribución similar en el caso de moléculas pequeñas y anticuerpos, y por extrapolación, se esperaría lo mismo para los vectores virales15,16. Sin embargo, no se han encontrado en la literatura ejemplos que comparen la administración sistémica de vectores de terapia génica por TVI y la inyección en senos retrobulbares. En nuestra opinión, las inyecciones en los senos retrobulbares son más fáciles de realizar en ratones con un fenotipo de crecimiento disminuido y/o letalidad precoz.
A menudo se considera que la TVI es más análoga al parto sistémico en los seres humanos, a pesar de que los humanos tienen un seno retrobulbar pero no tienen cola. En un aspecto, la inyección en el seno retrobulbar es similar a la administración sistémica humana en el sentido de que el inyectante ingresa al sistema venoso superior de la misma manera que si un inyectante se administrara a un ser humano mediante un catéter central insertado periféricamente (línea PICC) o un catéter intravenoso colocado en el brazo. Por el contrario, el inyector ingresa al sistema venoso inferior de un ratón después de la inyección en la vena de la cola. Desafortunadamente, ninguno de estos métodos replica exactamente los métodos utilizados para la administración sistémica en humanos, pero ambos son métodos efectivos de administración sistémica en ratones.

Los modelos murinos de enfermedades genéticas se utilizan comúnmente para demostrar la eficacia de las terapias de moléculas pequeñas, genéticas y celulares1. En ratones, el método más utilizado para replicar la administración sistémica a los humanos es la inyección de la vena de la cola (TVI), que generalmente se realiza en ratones adultos aproximadamente a las 6-8 semanas de edad para garantizar que la vena sea lo suficientemente grande como para acceder a ella. La TVI se ha utilizado con éxito en numerosos estudios preclínicos de prueba de principio de enfermedades genéticas, como la hemofilia, que han respaldado ensayos clínicos en humanos para la terapia génica2. Sin embargo, muchos modelos murinos de enfermedad genética tienen fenotipos de crecimiento y/o letalidad temprana, que les impiden alcanzar la edad o el tamaño de un ratón adulto (Figura 1). El tratamiento de estos ratones a través de TVI puede ser extremadamente difícil, si no imposible, dependiendo de la edad de letalidad y/o del tamaño máximo que puedan alcanzar los animales.
Por el contrario, la administración sistémica de un agente terapéutico mediante inyección sinusal retrobulbar (frecuente e incorrectamente denominada retroorbital) se puede realizar con bastante facilidad en ratones, independientemente de su edado tamaño. Las inyecciones retrobulbares de virus adenoasociados (AAV) se han utilizado con éxito en modelos murinos jóvenes con retraso del crecimiento de enfermedades genéticas, como la acidemia metilmalónica (MMA) y la enfermedad de Niemann-Pick tipo C 4,5,6,7,8. (Este procedimiento también se puede utilizar para inyectar neonatos 3,4,9,10; sin embargo, esta técnica no se detalla en este protocolo ni en el video que lo acompaña). Incluso sustancias altamente tóxicas como la doxorrubicina pueden administrarse de forma segura mediante inyección retrobulbar11,12. A diferencia de la TVI, los ratones son anestesiados durante las inyecciones en los senos retrobulbares, lo que hace que el procedimiento sea menos estresante para el ratón y más fácil para el operador, que no tiene que sujetar físicamente al ratón13,14. Una preocupación adicional es que TVI usa con frecuencia una lámpara de calor para dilatar la vena de la cola, lo que podría causar deshidratación en ratones jóvenes y podría ser problemático en modelos murinos de enfermedades genéticas que son más sospechosas de estrés relacionado con el calor. Otro problema que puede surgir al usar TVI es que la vena de la cola puede ser particularmente difícil de visualizar en ratones altamente pigmentados. Sin embargo, al igual que la TVI, las inyecciones en los senos retrobulbares dan lugar a una amplia biodistribución sistémica15,16.

<table><tbody><tr><td>AAV8-CAG-eGFP</td><td>Univ. Penn. Vector Core Pedido</td><td>especial</td><td>Fuentes alternativas de reporteros AAV y reporteros alternativos AAV están disponibles</td></tr><tr><td>Consejos de barrera (filtro), 20 &mu; Tamaño L</td><td>ThermoFisher</td><td>AM12645</td><td>para diluir AAV para disire el volumen y la concentración de inyección</td></tr><tr><td>Puntas de barrera (filtro), 100 &mu; Tamaño L (estéril)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM12648</td><td>para diluir AAV para disire el volumen y la concentración de inyección</td></tr><tr><td>Circuito de producción dual&nbsp;</td>Se <td>puede utilizar el método de anestesia alternativo</td> <td>VetEquip</td><td>921400</td></tr><tr><td>Gilsen PIPETTEMAN Classic P20</td> pipeta <td>Gilson</td><td>F123600</td><td>para diluir AAV para disire el volumen y la concentración de inyección</td></tr><tr><td>Gilsen PIPETTEMAN Classic&nbsp; Pipeta P100</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td>para diluir AAV para mejorar el volumen y la concentración</td></tr> de la inyección <tr><td>Calentadores de manos (HOTHANDS)</td><td>ULINE</td><td>S-1497B</td><td>para mantener el ratón caliente mientras está anestesiado</td></tr><tr><td>Jeringas de insulina, 31 g de longitud, capacidad de 3/10 ml</td><td>Becton Dickson</td><td>328438</td><td>utiliza en vídeo; una jeringa por inyección</td></tr><tr><td>Isoflurano (Fluriso)</td><td>VETONE</td><td>502017</td><td>Se puede utilizar anestesia alternativa</td></tr><tr><td>Medline Protection Plus Almohadillas desechables</td><td>ThermoFisher</td><td>23-666-062</td><td>para colocar el ratón sobre la inyección</td></tr><tr><td>Contenedor de objetos punzantes de flebotomía Oak Ridge con tapa transparente</td><td>ThermoFisher</td><td>22-730-434</td><td>para la eliminación de agujas</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Para diluir el AAV hasta la concentración y el volumen deseados</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de baja retención con tapón a presión (estériles)</td><td>ThermoFisher</td><td>3451</td><td>para diluir el AAV para disire el volumen y la concentración</td>de la inyección</tr><tr><td>Esponja de gasa estéril 4"x"4</td><td>Covidien</td><td>3033</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de trecaína Oftálmico (0,5%)</td><td>Ocenanside Pharmaceuticals</td><td>AK102D5DS</td><td>local&nbsp; anestésico</td></tr><tr><td>Jeringa de tuberculina con un 27,0 G (o menos)</td><td>Cualquiera</td><td>N/A</td><td>alternativa a la jeringa de insulina utilizada en el vídeo</td></tr><tr><td>VetEquip' s Guía del usuario y manual de operación para el sistema de anestesia de animales de laboratorio de mesa y móvil.</td><td>VetEquip</td><td>chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf</td><td>enlace a la guía del usuario y al manual</td></tr></tbody></table>

tratamiento sistémico para ratones adultos posnatales, juveniles y revolucionados mediante inyección en el seno retrobulbar

Systemic Treatment for Postnatal, Juvenile, and Runted Adult Mice by Retrobulbar Sinus Injection

Si bien las inyecciones en las venas de cola se utilizan con frecuencia como una vía sistémica de administración en ratones adultos, las inyecciones retrobulbares son un método alternativo para la administración sistémica con menos limitaciones. En primer lugar, las inyecciones en las venas de la cola (TVI) se limitan a ratones adultos en los que el tamaño de la vena de la cola es adecuado para el acceso. Limitarse al tratamiento de ratones adultos puede ser problemático cuando se trata de modelos de ratón que no sobreviven hasta la edad adulta. En segundo lugar, los TVI no son factibles para modelos de ratón con fenotipos de retraso del crecimiento en los que los ratones nunca alcanzan el tamaño de los ratones adultos de tipo salvaje. Por lo tanto, las inyecciones retrobulbares se pueden usar con éxito para tratar ratones jóvenes y adultos pequeños. Por último, las inyecciones retrobulbares se realizan bajo anestesia, que es menos estresante para los ratones que las TVI que se realizan comúnmente sin anestesia. Este artículo presenta un protocolo e instrucciones detalladas para las inyecciones retrobulbares que se pueden utilizar para la administración sistémica a ratones pequeños y jóvenes.

La inyección en el seno retrobulbar se ha utilizado con éxito para administrar sistémicamente moléculas pequeñas, anticuerpos y virus adenoasociados (AAV)4,5,9,15,16. En la Figura 3, se muestra el hígado de un ratón tratado con PBS (vehículo) y un hígado de ratón tratado con AAV8 como ejemplo de inyección y expresión de AAV después de una inyección retrobulbar. El AAV8, al igual que muchos vectores naturales de AAV, es hepático trófico. Por lo tanto, se espera una transducción hepática sustancial en un ratón que recibió una dosis sistémica de 5 × 1012vg/kg17. El gran número de hepatocitos que expresan ARN de metilmalonil-CoA mutasa (MMUT) que se observa en la Figura 3, que se expresa por el transgén AAV, indica una inyección retroorbitaria exitosa.
<img alt="Comparación de acidemia propiónica versus ratón de tipo salvaje, diferencia de peso, 4 semanas, resultado de la investigación." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Un ratón con retraso del crecimiento y acidemia propiónica. Este es un ejemplo del retraso extremo del crecimiento que puede ocurrir en modelos murinos de enfermedades genéticas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Proceso de inyección en el ojo del ratón; El diagrama ilustra la configuración de la inyección ocular en un experimento de laboratorio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Imágenes y diagrama de la inyección del seno retrobulbar. (A) Imagen de la colocación del dedo sobre el pelaje para sobresalir del globo ocular (indicado por una flecha blanca). (B) Imagen de la protuberancia del globo ocular (indicada por una flecha blanca) después de la aplicación de presión hacia abajo sobre el pelaje antes de la colocación de la aguja y la inyección. (C) Diagrama de la orientación del bisel de la aguja (bisel hacia abajo en relación con el globo ocular), ángulo de la aguja (30°) y colocación de la aguja en el seno retrobulbar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imagen de microscopio, análisis de estructura celular; inmunohistoquímica; Detección de la expresión de proteínas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Hibridación in situ de ARN tras inyección de seno retrobulbar con AAV8. Imágenes de (A) 10 veces el hígado tratado con un vehículo, (B) 10 veces el hígado tratado con AAV8, (C) 20 veces el hígado tratado con un vehículo y (D) 20 veces el hígado tratado con AAV8 teñido para el ARN MMUT. Los ratones con acidemia metilmalónica se trataron con una dosis de 5 × 1012 vg/kg de AAV8-LPS-MMUT o un control de vehículo (PBS) a 1 mes de edad. El tejido hepático se recolectó 1 mes después del tratamiento. MMUT ARN teñido de color marrón (las flechas negras indican áreas de tinción positiva). Hígado contrateñido con hematoxilina. Barras de escala = 100 μm 10x para imágenes, 50 μm para imágenes 20x (B). Abreviaturas: AAV = virus adenoasociado; LPS = Promotor específico del hígado; MMUT = metilmalonil-CoA mutasa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este artículo proporciona un protocolo y un video adjunto para la inyección en el seno retrobulbar de hasta un volumen total de 150 μL para ratones postnatales, juveniles y adultos corridos. Este procedimiento es particularmente adecuado para la inyección de ratones pequeños (15 g) cuando la inyección en la vena de la cola no es factible.

Tratamiento sistémico para ratones adultos posnatales, juveniles y revolucionados mediante inyección en el seno retrobulbar

While tail vein injections are frequently used as a systemic route of delivery in adult mice, retrobulbar injections are an alternative method for ...

systemic-treatment-for-postnatal-juvenile-runted-adult-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

Aquí demostramos una técnica para la transducción neuronal generalizada mediante inyección intraventricular de virus adenoasociados en el cerebro de ratón neonatal.  Este método proporciona una manera rápida y fácil de lograr la expresión de por vida de los transgenes administrados viralmente.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

Los modelos animales de enfermedad pediátrica pueden experimentar aparición temprana y progresión de la enfermedad agresiva. Clínicamente entrega terapia pertinente a jóvenes modelos de ratón puede ser técnicamente difícil. Este protocolo describe un método de inyección intravenosa no invasivo para ratones recién nacidos dentro de los dos primeros días después del parto de la vida.

Las inyecciones intravenosas en ratones recién nacidos

Aquí, describimos un método simple de inyección intracerebroventricular e intravascular de partículas virales o microperlas fluorescentes en el cerebro de ratón neonatal. El patrón de localización del virus y las nanopartículas podría detectarse mediante evaluación microscópica o mediante hibridación in situ.

Intracerebroventricular y por inyección intravascular de partículas víricas y fluorescentes microperlas en el cerebro neonatal

Las inyecciones subretinianas son la técnica más común para administrar grandes agentes terapéuticos, como proteínas y vectores virales, a los fotorreceptores y al epitelio pigmentario de la retina. Aquí se describe un método alternativo en ratones que se dirige con éxito al espacio subretiniano con un daño colateral mínimo y tiempos de recuperación rápidos.

Un método alternativo de inyección y validado para acceder al espacio subretiniano<i&gt; vía</i&gt; Un enfoque posterior transescleral

Aquí, describimos la inducción del síndrome nefrótico experimental en ratones 129S1/SvImJ por inyección retrobulbar rápido de doxorrubicina. También tratamos ratones nefróticos con gránulos de liberación prolongada que contiene aprotinina para inhibir la actividad de la proteasa de serina urinaria y prevenir la retención de sodio.

Inducción del síndrome nefrótico en ratones por la inyección Retrobulbar de la doxorrubicina y la prevención de la retención de volumen por la aprotinina de liberación sostenida

Este protocolo demuestra un método novedoso para aplicar terapias génicas a subpoblaciones de células en ratas neonatas a edades postnatales de 5 a 10 días mediante la inyección de un modificador quimiogenético anterógrado en la corteza somatomotora y una recombinasa Cre retrógradamente transportable en la médula espinal cervical.

Apuntando al tracto corticoespinal en ratas neonatas con un vector viral doble utilizando cirugía combinada de cerebro y columna vertebral

Este protocolo tiene como objetivo demostrar una vía de administración venosa reproducible que pueda ser utilizada en ratas y ratones durante todo el período neonatal. Este procedimiento es importante para los estudios preclínicos en roedores que desean reflejar la administración de fármacos en las unidades de cuidados neonatales, principalmente mediante la administración intravenosa.

Un modelo neonatal de inyección venosa retroorbitaria en roedores

Se describe un procedimiento quirúrgico para realizar inyecciones en la cisterna lumbar de la rata juvenil. Este enfoque se ha utilizado para la administración intratecal de vectores de terapia génica, pero se prevé que este enfoque se pueda utilizar para una variedad de terapias, incluidas las células y los fármacos.

Administración intratecal de vectores en ratas juveniles mediante inyección en cisterna lumbar

Este estudio presenta una metodología para la administración de terapias en la retina y los nervios ópticos de la rata adulta. Además, se introduce un método único de recuperación de tejido para una colección en bloque de arriba hacia abajo del nervio óptico y la retina en una rata adulta.

Administración Terapéutica Ocular y Recuperación Avanzada de Tejido en Ratas Adultas

Aprende el protocolo de inyección retrobulbar en ratones para terapia génica en acidemias orgánicas. Este método permite la administración sistémica en animales pequeños y avanza la investigación de tratamientos para trastornos metabólicos.

Tratamiento sistémico para ratones adultos posnatales, juveniles y revolucionados mediante inyección en el seno retrobulbar

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