Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares
9 de agosto de 2024
En este trabajo se describen diferentes métodos de formación de esferoides multicelulares para realizar un seguimiento de la microscopía multiparamétrica de células vivas. Mediante el uso de microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM), autofluorescencia celular, colorantes de tinción y nanopartículas, se demuestra el enfoque para el análisis del metabolismo celular, la hipoxia y la muerte celular en cáncer tridimensional vivo (3D) y esferoides derivados de células madre.
En este trabajo, presentamos y comparamos métodos de formación de esferoides que se pueden utilizar para el análisis del metabolismo celular y la distribución de oxígeno utilizando microscopía de células vivas. En los últimos años, la microscopía de imágenes de fluorescencia se ha utilizado ampliamente para investigar biomarcadores metabólicos como NADPH y FAD en células vivas, y se han desarrollado varias nanopartículas fluorescentes para multiplexar tales mediciones con imágenes de oxigenación celular y tisular. Los esferoides multicelulares, los organoides y los órganos en un chip pueden replicar un microambiente complejo similar al in vivo, lo que minimiza la necesidad de investigación con animales.
Para la producción de esferoides, mostramos diferentes métodos de formación, que pueden abarcar desde un rendimiento bajo hasta uno alto. También destacan su accesibilidad óptica, su compatibilidad con el microscopio de fluorescencia y la posibilidad de incluir componentes de la matriz extracelular. Por lo tanto, aunque los modelos in vitro 3D proporcionan un mejor contexto en comparación con los cultivos 2D, su alta variabilidad, baja reproducibilidad e informes experimentales incompletos siguen siendo un problema.
Parámetros como el tamaño del esferoide, la composición de nutrientes, la viscosidad extracelular e incluso los métodos de formación de esferoides pueden conducir a un aumento de la heterogeneidad celular. Con este protocolo, pretendemos armonizar y estandarizar los métodos de producción de esferoides, destacando aspectos clave importantes para el análisis continuo y multiparamétrico de la vida útil de los esferoides mediante microscopía FLIM.
Resumen
Este artículo presenta diversos métodos para formar esferoides multicelulares con el fin de analizar el metabolismo celular y la distribución de oxígeno mediante microscopía de células vivas. El estudio destaca el uso de la microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) para investigar biomarcadores metabólicos en células vivas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Imagenología de células vivas
Antecedentes
- Los esferoides multicelulares y los organoides replican microentornos similares a los in vivo.
- La microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia se utiliza para estudiar biomarcadores metabólicos.
- La alta variabilidad y la baja reproducibilidad son desafíos en los modelos in vitro tridimensionales.
- Pueden emplearse diferentes métodos de formación de esferoides para diversas aplicaciones.
Objetivo del estudio
- Comparar métodos de formación de esferoides para microscopía de células vivas.
- Analizar el metabolismo celular, la hipoxia y la muerte celular en modelos tridimensionales.
- Mejorar la comprensión de la distribución de oxígeno en sistemas multicelulares.
Métodos Utilizados
- Microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM)
- Análisis de autofluorescencia celular
- Uso de colorantes de tinción y nanopartículas fluorescentes
- Diferentes técnicas de formación de esferoides
Resultados principales
- Mostró métodos para analizar el metabolismo celular en esferoides tridimensionales.
- Mostró la compatibilidad de los esferoides con FLIM para estudios metabólicos.
- Destacó la importancia de los componentes de la matriz extracelular en la formación de esferoides.
- Abordó los desafíos en la reproducibilidad y variabilidad de los cultivos tridimensionales.
Conclusiones
- Diferentes métodos de formación de esferoides pueden mejorar el análisis de células vivas.
- La FLIM proporciona información valiosa sobre los procesos metabólicos en modelos 3D.
- El desarrollo continuo de estos métodos puede reducir la dependencia de los modelos animales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La producción estandarizada y el análisis multiparamétrico mediante FLIM de esferoides multicelulares abordan desafíos críticos en la modelización de microentornos tumorales para el descubrimiento de fármacos. La armonización de la formación de esferoides y los flujos de trabajo de microscopía de células vivas mejora la confianza predictiva en lecturas metabólicas y relacionadas con la hipoxia, apoyando una toma de decisiones robusta en fases iniciales. Este enfoque fortalece la continuidad traslacional y reduce el riesgo biológico en carteras de I+D en oncología y células madre.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite el análisis de vías metabólicas y gradientes de oxígeno en modelos tridimensionales fisiológicamente relevantes.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante la cuantificación de biomarcadores de NADPH y FAD en esferoides vivos.
- Facilita la desactivación de riesgos biológicos mediante mediciones multiplexadas de metabolismo e hipoxia.
- Mejora la confianza predictiva para la interacción con dianas y la modulación de vías en sistemas complejos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara modelos reproductibles de esferoides 3D compatibles con plataformas de FLIM de campo amplio, confocal y de dos fotones.
- Normaliza las condiciones del ensayo para reducir la variabilidad y mejorar la fiabilidad de los resultados cuantitativos.
- Permite la realización de cribados escalables y de alto rendimiento de los efectos de compuestos sobre el metabolismo celular y la viabilidad.
- Facilita la evaluación rigurosa de la integración de biosensores y nanosensores para lecturas multiplexadas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea perfiles metabólicos e hipóxicos in vitro con microambientes tumorales relevantes para la enfermedad.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica, minimizando la dependencia de modelos animales.
- Permite decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en datos cuantitativos y multiparamétricos.
- Facilita el desarrollo traslacional de biomarcadores utilizando resultados de FLIM en células vivas.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
Este flujo de trabajo armonizado integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de fármacos líderes y la validación preclínica, aprovechando la producción estandarizada de esferoides y el análisis mediante FLIM.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la aclaración de vías en contextos tridimensionales y semejantes a los in vivo.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles del metabolismo y la hipoxia para la selección de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones multiplexadas de tiempo de vida de fluorescencia para comparaciones robustas entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con modelos preclínicos mediante la recreación de características del microambiente tumoral.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para diversos programas de I+D en oncología y células madre.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en sistemas de modelos 3D.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los flujos de trabajo de imagenología de células vivas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos cuantitativos robustos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos con relevancia biológica validada.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular tridimensional, microscopía de células vivas y análisis de FLIM.
- Exige acceso a instrumentación de FLIM de campo amplio, confocal o de dos fotones, y software de análisis compatible.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de producción de esferoides y de adquisición de imágenes.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes tipos celulares, matrices extracelulares o integración de sensores.
- La variabilidad en el tamaño y la composición de los esferoides puede afectar la reproducibilidad y la interpretación de los datos.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
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Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
