Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares
9 de agosto de 2024
En este trabajo se describen diferentes métodos de formación de esferoides multicelulares para realizar un seguimiento de la microscopía multiparamétrica de células vivas. Mediante el uso de microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM), autofluorescencia celular, colorantes de tinción y nanopartículas, se demuestra el enfoque para el análisis del metabolismo celular, la hipoxia y la muerte celular en cáncer tridimensional vivo (3D) y esferoides derivados de células madre.
En este trabajo, presentamos y comparamos métodos de formación de esferoides que se pueden utilizar para el análisis del metabolismo celular y la distribución de oxígeno utilizando microscopía de células vivas. En los últimos años, la microscopía de imágenes de fluorescencia se ha utilizado ampliamente para investigar biomarcadores metabólicos como NADPH y FAD en células vivas, y se han desarrollado varias nanopartículas fluorescentes para multiplexar tales mediciones con imágenes de oxigenación celular y tisular. Los esferoides multicelulares, los organoides y los órganos en un chip pueden replicar un microambiente complejo similar al in vivo, lo que minimiza la necesidad de investigación con animales.
Para la producción de esferoides, mostramos diferentes métodos de formación, que pueden abarcar desde un rendimiento bajo hasta uno alto. También destacan su accesibilidad óptica, su compatibilidad con el microscopio de fluorescencia y la posibilidad de incluir componentes de la matriz extracelular. Por lo tanto, aunque los modelos in vitro 3D proporcionan un mejor contexto en comparación con los cultivos 2D, su alta variabilidad, baja reproducibilidad e informes experimentales incompletos siguen siendo un problema.
Parámetros como el tamaño del esferoide, la composición de nutrientes, la viscosidad extracelular e incluso los métodos de formación de esferoides pueden conducir a un aumento de la heterogeneidad celular. Con este protocolo, pretendemos armonizar y estandarizar los métodos de producción de esferoides, destacando aspectos clave importantes para el análisis continuo y multiparamétrico de la vida útil de los esferoides mediante microscopía FLIM.
Visión general
Este artículo presenta varios métodos para formar esferoides multicelulares para analizar el metabolismo celular y la distribución de oxígeno mediante microscopía de células vivas. El estudio destaca el uso de microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) para investigar biomarcadores metabólicos en células vivas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Imagen de células vivas
Antecedentes
- Los esferoides multicelulares y organoides replican microambientes similares a los in vivo.
- La microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia se utiliza para estudiar biomarcadores metabólicos.
- La alta variabilidad y la baja reproducibilidad son desafíos en los modelos 3D in vitro.
- Diferentes métodos de formación de esferoides pueden emplearse para varias aplicaciones.
Propósito del estudio
- Comparar métodos de formación de esferoides para microscopía de células vivas.
- Analizar el metabolismo celular, la hipoxia y la muerte celular en modelos 3D.
- Mejorar la comprensión de la distribución de oxígeno en sistemas multicelulares.
Métodos utilizados
- Microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM)
- Análisis de autofluorescencia celular
- Uso de colorantes de tinción y nanopartículas fluorescentes
- Diferentes técnicas de formación de esferoides
Resultados principales
- Demostraron métodos para analizar el metabolismo celular en esferoides 3D.
- Mostraron la compatibilidad de los esferoides con FLIM para estudios metabólicos.
- Destacaron la importancia de los componentes de la matriz extracelular en la formación de esferoides.
- Abordaron los desafíos en la reproducibilidad y variabilidad de los cultivos 3D.
Conclusiones
- Diferentes métodos de formación de esferoides pueden mejorar el análisis de células vivas.
- FLIM proporciona valiosas perspectivas sobre procesos metabólicos en modelos 3D.
- El desarrollo continuo de estos métodos puede reducir la dependencia de modelos animales.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Standardized production and multi-parameter FLIM analysis of multicellular spheroids address critical challenges in modeling tumor microenvironments for drug discovery. Harmonizing spheroid formation and live-cell imaging workflows enhances predictive confidence in metabolic and hypoxia-related readouts, supporting robust early-stage decision-making. This approach strengthens translational continuity and reduces biological risk across oncology and stem cell R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways and oxygen gradients in physiologically relevant 3D models.
- Supports functional target validation by quantifying NADPH and FAD biomarkers in live spheroids.
- Facilitates biological de-risking through multiplexed metabolic and hypoxia measurements.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation in complex systems.
Screening & Assay Development
- Prepares reproducible 3D spheroid models compatible with widefield, confocal, and two-photon FLIM platforms.
- Standardizes assay conditions to reduce variability and enhance quantitative output reliability.
- Enables scalable, high-throughput screening of compound effects on cell metabolism and viability.
- Supports robust evaluation of bio- and nanosensor integration for multiplexed readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro metabolic and hypoxia profiles with disease-relevant tumor microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by minimizing animal model reliance.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative, multiparametric data.
- Facilitates translational biomarker development using live-cell FLIM outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This harmonized workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, leveraging standardized spheroid production and FLIM analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D, in vivo-like contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative metabolic and hypoxia readouts for compound triage.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence lifetime measurements for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by recapitulating tumor microenvironment features.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse oncology and stem cell R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D model systems.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated biological relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, live-cell microscopy, and FLIM analytics.
- Demands access to widefield, confocal, or two-photon FLIM instrumentation and compatible analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid production and imaging protocols.
- May require adaptation for different cell types, extracellular matrices, or sensor integration.
- Variability in spheroid size and composition can impact reproducibility and data interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
