Name: Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a producir esferoides multicelulares para análisis multiparamétrico mediante microscopía FLIM de células vivas. Este método permite estudiar metabolismo celular y distribución de oxígeno en modelos 3D.

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Este trabajo fue financiado por las becas del Fondo Especial de Investigación (BOF) de la Universidad de Gante (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Fundación de Investigación de Flandes (FWO, I001922N) y la Unión Europea, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN Nº 101073507.

Formación de esferoides multicelulares para análisis metabólicos y de hipoxia basados en FLIM

Nada que revelar.

Los esferoides multicelulares se están convirtiendo en un método de elección en los estudios de microentornos de nicho tumorales y de células madre, el descubrimiento de fármacos y el desarrollo de los "bloques de construcción de tejidos" para la biofabricación. La arquitectura interna heterogénea de los esferoides, los gradientes de nutrientes y la oxigenación pueden imitar los de los tejidos y tumores in vivo en un entorno relativamente simplificado y accesible. Con la necesidad de una mayor transparencia metodológica26,28 y estandarización71, se espera que estos protocolos ayuden a los investigadores a elegir el mejor método de formación de esferoides para los experimentos de microscopía de imágenes de fluorescencia cuantitativa en vivo. Los métodos presentados aprovechan los sensores de nanopartículas de tinción celular y la autofluorescencia celular intrínseca, que se pueden combinar fácilmente con la tinción de la muerte celular.
Los pasos más críticos están en el protocolo de formación de esferoides; Por lo tanto, para el método basado en agarosa de alto rendimiento, es esencial equilibrar suficientemente los moldes de agarosa para los medios de cultivo. Un tiempo de equilibrio insuficiente conducirá a la dilución de nutrientes en el PBS restante y traerá factores adicionales para la heterogeneidad de esferoides 21,26,72,73. El molde de agarosa recién hecho también debe revisarse visualmente para detectar la presencia de burbujas de aire, microgrietas y otros defectos.
Aunque es eficiente para la obtención de imágenes, la suspensión de nanopartículas puede mostrar autoagregación y causar la formación de esferoides de forma irregular en métodos de formación de baja adhesión. Esto a menudo se puede mitigar mediante la adición de suero a los medios de cultivo o mediante la tinción previa del cultivo celular monocapa antes de la formación de esferoides. Con frecuencia, durante la compactación de esferoides, la adición de una pequeña cantidad de nanopartículas (por ejemplo, el 10% de la concentración inicial de tinción) también puede ayudar a teñir la zona de proliferación de los esferoides. Por último, es importante utilizar puntas de pipeta estériles "libres de polvo" en todos los métodos de formación.
El impacto potencial de la iluminación en la viabilidad celular siempre debe tenerse en cuenta durante los experimentos de imagen. Por lo tanto, es importante conocer los factores de riesgo que afectan negativamente a cada experimento de imagen en vivo. En general, el fotodaño involucra varios mecanismos: (1) alto aumento local de la temperatura, (2) estrés mecánico y (3) estrés fotoquímico (reacción oxidativa y de radicales libres)74. Dependiendo de la modalidad de imagen (por ejemplo, imágenes confocales de un fotón frente a imágenes multifotónicas, modos de iluminación continua frente a pulsos, la sensibilidad de los detectores y la potencia de la fuente de luz a diferentes longitudes de onda si es posible el ajuste de la excitación), el tipo de célula y tejido (por ejemplo, acumulación dependiente del tipo de tejido de pigmentos que absorben la luz de manera eficiente u otras moléculas de autofluorescencia, organización 3D frente a 2D, crecimiento y composición de los medios de imagen), el origen de la sonda fluorescente (por ejemplo, propiedades fotosensibilizantes) diferentes combinaciones de factores de riesgo pueden provocar fototoxicidad durante la obtención de imágenes. Además, incluso si no se observa un aumento en la muerte celular después de la iluminación, los efectos previos a la muerte dependientes de la energía de la luz sobre las mitocondrias y el metabolismo pueden interferir potencialmente con el análisis y la interpretación del experimento55.
Para excluir el impacto fototóxico en los resultados experimentales, el investigador debe realizar un seguimiento general de la viabilidad celular y los cambios en la morfología celular en comparación con el control intacto o utilizar sondas de muerte celular para estimar el aumento de la tasa de mortalidad celular después de la iluminación. Si se realizan experimentos metabólicos, la optimización de los parámetros de imagen debe realizarse en consecuencia en los experimentos piloto para estimar y minimizar el impacto de la imagen en los parámetros metabólicos medidos. En el caso de las sondas sensibles al oxígeno, la sobredosis de luz puede rastrearse fácilmente mediante un aumento repentino de la vida útil y la intensidad de la fosforescencia del colorante sensible alO2 (cambios correspondientes en la relación de intensidad de referencia al colorante sensible alO2) debido al llamado efecto de "consumo deO2 fotoinducido"53,75. Esto se puede hacer fácilmente mediante el análisis de curvas cinéticas de experimentos de lapso de tiempo con diferentes parámetros de potencia luminosa utilizando, por ejemplo, el siguiente protocolo publicado25. En "defensa" de la iluminación de pulso (por ejemplo, utilizada en la microscopía TCSPC-F(P)LIM), los estudios recientes demostraron su impacto mínimo en la producción de ROS y el fotoblanqueo de la sonda en comparación con las mediciones de iluminación de estado estacionario76,77, lo que apunta a una ventaja adicional de TCSPC-FLIM frente al enfoque convencional de imágenes basado en la intensidad.
La principal limitación de los métodos de formación de esferoides presentados radica en las aplicaciones de monitoreo directo y a largo plazo. Los moldes de agarosa requieren un objetivo de larga distancia de trabajo (o un microscopio vertical adicional o un microscopio estereoscópico de fluorescencia) debido a que la gruesa capa de agarosa y el material de la Spheriplate 5D pueden interferir con las mediciones en canales fluorescentes rojos (sonda deO2 ). El tamaño del esferoide producido por los métodos de alto rendimiento está limitado por el diámetro del micropocillo y requiere un intercambio frecuente de medios para evitar el agotamiento y la acidificación de los medios. Con todas estas limitaciones, recomendamos las placas de Petri 3D (MicroTissue) para experimentos que requieren un alto rendimiento (por ejemplo, para aplicaciones de bioimpresión 3D) y métodos de baja adherencia para estudios básicos de "rendimiento medio", que también requieren un número de células más bajo.
El monitoreo radiométrico de la oxigenación y los experimentos convencionales de microscopía basados en colorantes de fluorescencia de células vivas son asequibles en los microscopios invertidos ampliamente disponibles si están equipados con una cámara sensible al infrarrojo cercano (NIR), excitación basada en diodos emisores de luz (LED) y un objetivo25 adecuado. Para un corte óptico y FLIM más apropiados, se recomiendan los sistemas de microscopio confocal comerciales disponibles en el mercado (como los que se describen aquí). Si bien también describimos un método para detectar la autofluorescencia de NAD(P)H, que requiere un microscopio FLIM de dos fotones más costoso, existen muchos enfoques diferentes, compatibles y útiles para los sistemas FLIM confocal, equipados idealmente con láser de luz blanca y detectores híbridos o SPAD. Estos incluyen la evaluación del metabolismo celular, las proteínas biosensoras FRET-FLIM, la obtención de imágenes de la mecánica celular y tisular, la autofluorescencia de tipos específicos de células y tejidos, y las interacciones receptor-fármaco visualizadas a través de FLIM-FRET31.
El software de adquisición y análisis FLIM proporcionado por el proveedor puede afectar el éxito del experimento, ya que no siempre es posible exportar el IRF o las imágenes en un formato compatible con el análisis de código abierto posterior. El posprocesamiento es una parte importante del flujo de trabajo de análisis FLIM y todavía no está universalmente estandarizado ni aceptado. El ajuste de la curva requiere un mayor número de fotones y más potencia computacional en comparación con el enfoque de fasores. FLIMfit45 (ajuste global y píxel por píxel) y Flimview78 se encuentran entre los programas abiertos utilizados para el análisis de ajuste de curvas, mientras que PAM79, FLUTE64 y AlliGator80 se utilizan para el análisis de fasores. FLIMJ46 es un útil complemento de ImageJ que funciona con ambos enfoques. En conjunto, estas opciones ayudan a mejorar la rutina de posprocesamiento y a hacerla más rápida, versátil y fácil de usar.

Los esferoides multicelulares representan un grupo de modelos de tejidos en 3D obtenidos por la autoagregación de células y que presentan una forma esférica. Son ampliamente utilizados para imitar la interacción célula-célula y célula-matriz in vitro y para reproducir un contexto 3D dentro de una multitud de construcciones derivadas del cáncer y las células madre. Se emplean varias técnicas para reducir la adhesión celular y promover la agregación. Estos incluyen el método de caída colgante que se basa en la tensión superficial1; métodos de repelencia de la fijación de células, como placas de fijación ultrabajas, micromoldes y micropocillos 2,3; enfoque basado en ondas acústicas4; métodos de agregación inducida por flujo (matraces giratorios, biorreactores y dispositivos microfluídicos)5; formación asistida por partículas magnéticas6 y uso de matrices y andamios sintéticos y basados en ECM que promueven la agregación 7,8,9.
En la investigación, desarrollo y validación de nuevas terapias farmacológicas contra el cáncer, los esferoides son un modelo atractivo debido a su capacidad para recapitular los gradientes de difusión espacial limitados de nutrientes, productos de desecho yO2, lo que a menudo conduce a la formación de un núcleo necrótico, típico de los tumores sólidos10,11. Estos modelos in vitro más confiables y sofisticados desafían la necesidad de un uso extensivo de modelos animales (Ley de Modernización de la Administración de Alimentos y Medicamentos [FDA]2.0 12), de acuerdo con el principio de las 3R de la investigación con animales (reemplazo, reducción y refinamiento). Además del cáncer, los esferoides encuentran su aplicación en la investigación con células madre. Por ejemplo, las células madre pluripotentes tienen la capacidad de formar cuerpos embrioides (EB), que pueden utilizarse para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) hacia tipos de células especializadas que son difíciles de obtener directamente de los pacientes, como las células precursoras neurales13 o las células de la granulosa ovárica 13,14. Además, la formación de un EB suele ser el primer paso en el desarrollo de modelos de organoides más complejos, por ejemplo, el neuro15, el retinal16, el cardíaco17, el hígado18, el estómago19 y los organoides intestinales20. Factores como el tamaño, la reproducibilidad, el rendimiento y las aplicaciones posteriores deben tenerse en cuenta a la hora de elegir un método de formación de esferoides adecuado para los experimentos.
El aumento de la complejidad de la cultura 3D puede conducir a una mayor variabilidad en comparación con la cultura 2D. Factores como la composición de nutrientes21, la evaporación del medio22, la viscosidad23, el control del pH24, el método de formación de esferoides e incluso el tiempo en el cultivo25,26 pueden dar lugar a la obtención de esferoides de diferente morfología, tamaños, viabilidad y diferentes quimiorresistencias27,28. Investigaciones recientes demostraron que los gradientes de oxígeno de los esferoides no siempre son estáticos y se ven afectados por el método de formación, el tamaño del esferoide y la viscosidad extracelular, lo que afecta la heterogeneidad de los esferoides29. Para mejorar la reproducibilidad y la accesibilidad a los datos sobre esferoides, se ha desarrollado la base de conocimientos MISpheroID26, identificando la línea celular, el medio de cultivo, el método de formación y el tamaño de los esferoides como la información mínima para un resultado reproducible. Por lo tanto, se realizó una comparación detallada de múltiples métodos de alto rendimiento (SphericalPlate 5D, micromoldes hechos en laboratorio y moldes de microtejidos) y de baja adherencia (es decir, Biofloat y placas de 96 pocillos recubiertas de lipidure, tanto sin andamios como basados en andamios) (Figura 1 y Tabla 1), incluido el tamaño del pocillo (dada una estimación del tamaño máximo del esferoide), los consumibles utilizados, el tiempo de preparación y la posibilidad de monitorear los esferoides sin transportarlos a placas de microscopía. Este último permite estudios a largo plazo, mientras que los esferoides producidos con métodos de alto rendimiento a menudo dan lugar a experimentos de punto final. Todos los métodos, a excepción de las rejillas de la placa 5Dspheri, no aportan autofluorescencia no deseada, lo que permite su uso directo en microscopía.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66845/66845fig01.jpg"> Figura 1: Explicación de los métodos de formación de esferoides. Métodos de alto rendimiento como el SphericalPlate 5D, que ha integrado micropocillos patentados en la placa, mientras que los micromoldes producidos en laboratorio y los moldes MicroTissue utilizan sellos para hacer múltiples micropocillos en agarosa (azul). Las placas de baja adherencia como Lipidure (Amsbio) y Biofloat (Sarstedt) utilizan un recubrimiento no adherente que inhibe la adhesión a la superficie celular y promueve la autoagregación celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66845/66845fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>5D SpheriPlate</td>
			<td>Micromoldes de producción propia</td>
			<td>Microtejido</td>
			<td>Métodos de apego bajo</td>
		</tr><tr><td>Número de esferoides/pocillo</td>
			<td>750</td>
			<td>1589</td>
			<td>81</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Diámetro del pozo</td>
			<td>90 μm</td>
			<td>400 μm</td>
			<td>800 μm</td>
			<td>1 milímetro</td>
		</tr><tr><td>Volumen de cultivo</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr><tr><td>Otros consumibles</td>
			<td>/</td>
			<td>7 mL de agarosa al 3%</td>
			<td>500 μL de agarosa al 2%</td>
			<td>/ *</td>
		</tr><tr><td>Tiempo de preparación</td>
			<td>10 minutos</td>
			<td>2 h + 3 días de adaptación de medios</td>
			<td>0,5 h + 15 min adaptación de medios</td>
			<td>10–30 min + 1 h de secado</td>
		</tr><tr><td>Monitorización</td>
			<td>Sí</td>
			<td>No**</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr><tr><td>Autofluorescente</td>
			<td>Sí</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
			<td>No</td>
		</tr><tr><td>Reutilizable</td>
			<td>No</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>No**</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Costar</td>
			<td rowspan="2">€€</td>
			<td rowspan="2">€</td>
			<td rowspan="2">€€€€</td>
			<td>€€€€: Recubrimiento y Matrigel</td>
		</tr><tr><td>€€: Placa comercial de 96 pocillos</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Algunas líneas celulares necesitan la adición de ECM (es decir, 2%-5% de Matrigel) para formar esferoides compactos.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">**El recubrimiento es reutilizable hasta que se agote. Sin embargo, cada placa consumirá una pequeña cantidad de medio y el polvo puede acumularse con el tiempo. La esterilización del filtro es necesaria regularmente.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Comparación de múltiples métodos de formación de esferoides29. "Monitoreo": la capacidad de monitorear esferoide sin la necesidad de transferirlo a una placa de microscopía. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€€: 150-500€ , €€€€: &gt;500€
La microscopía de fluorescencia permite el seguimiento directo de los aspectos biológicos clave dentro de los esferoides, incluida la muerte celular, la viabilidad, la proliferación, el metabolismo, la viscosidad e incluso las propiedades mecánicas30. La microscopía de imagen de fluorescencia (FLIM) proporciona una dimensión cuantitativa adicional para estudiar las interacciones de las sondas fluorescentes dentro de su (micro)entorno 31,32,33,34, lo que permite resolver los espectros de emisión superpuestos de acuerdo con diferentes tiempos de vida de emisión 35,36 y sondear el metabolismo celular a partir de la autofluorescencia celular intrínseca. Por lo tanto, compuestos autofluorescentes celulares tan extendidos como el fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD(P)H), el mononucleótido de flavina (FMN), el dinucleótido de flavina y adenina (FAD), la protoporfirina IX y otros pueden medirse con FLIM de uno y dos fotones y sirven como "sensores" intrínsecos del catabolismo de la glucosa, la fosforilación oxidativa (OxPhos) y proporcionan una visión general del estado redox celular. El NAD(P)H existe en formas citoplasmáticas libres o en mitocondriales unidas a proteínas37,38. Del mismo modo, el estado oxidado de FAD es fluorescente con una vida útil más larga de la forma libre. Las microscopías de NAD(P)H y FAD generalmente involucran FLIM excitado por dos fotones, con el objetivo de prevenir el fotodaño de la muestra39. Con frecuencia, la "imagen metabólica óptica" FLIM puede combinarse con el uso de sondas basadas en colorantes, biosensores codificados genéticamente, microscopía de imágenes de fosforescencia (PLIM) y mediciones basadas en la intensidad radiométrica para proporcionar una imagen más completa del metabolismo, la oxigenación, la proliferación y la viabilidad celular de esferoides u organoides 29,30,31. Además, FLIM también puede combinarse con el método de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) para medir la variación de la vida útil del fluoróforo donante cuando está en contacto cercano con el aceptor para investigar la unión de un fármaco con su dominio diana33,40,41.
Las imágenes FLIM adquiridas se analizan normalmente para calcular la vida útil píxel por píxel. En la actualidad, existen al menos 3 estrategias comunes utilizadas para obtener la vida útil de la fluorescencia: "FLIM rápido" semicuantitativo42 (a veces denominado "sentido tau"43,44), ajuste de la curva de decaimiento, utilizando un ajuste exponencial de uno, dos o tres elementos, y enfoque "sin ajuste" con transformación de fasores y análisis de diagramas de fasores. Dependiendo del proveedor, se puede utilizar software proporcionado (LAS X, Symphotime, SPCImage, etc.) o de código abierto (por ejemplo, FLIMfit45, FLIMJ46 u otros47) para manejar los datos FLIM medidos. Por lo general, el software proporcionado por el proveedor es útil para el análisis preliminar de datos, mientras que las soluciones de código abierto pueden proporcionar estudios más precisos utilizando, por ejemplo, diagramas de fasores y visualización en 3D.
A pesar de la utilidad y el atractivo de FLIM como método para estudiar esferoides, hay muy pocos protocolos experimentales disponibles, y existe una falta general de conocimiento en la elección del método de formación más apropiado para el éxito de experimentos de microscopía multiparamétrica en vivo con FLIM. Aquí, se presenta una comparación detallada de los protocolos de formación de esferoides comúnmente utilizados en función de su morfología, viabilidad y oxigenación con el nanosensor de detección de oxígeno (MMIR1) de rojo lejano e infrarrojo cercano (NIR) recientemente validado y caracterizado. La nanopartícula catiónica está impregnada con dos colorantes reporteros, el aza-BODIPY insensible al O2 de referencia (excitación 650 nm, emisión 675 nm) y la metaloporfirina sensible al NIR O2, PtTPTBPF (excitación 620 nm, emisión 760 nm). El MMIR1 permite el análisis en tiempo real de los gradientes de oxígeno en un microscopio de fluorescencia convencional (mediante análisis radiométrico) o en un microscopio de fosforescencia (PLIM) sin introducir toxicidad celular y permitiendo señales estables, monitorización a largo plazo y multiplexación25,29. Dependiendo de la necesidad de tinción con colorantes o nanosensores, el rendimiento de los esferoides o el tipo de célula, se puede elegir el protocolo de formación más adecuado. Dado que los estudios de viabilidad y oxigenación de los esferoides son relevantes para los estudios de esferoides derivados del cáncer y de las células madre, los protocolos presentados también incluyen ejemplos y resultados típicos esperados de NAD(P)H-FLIM y FAD-FLIM con estos modelos. Las tuberías de imágenes y análisis presentadas se dirigen a las plataformas de microscopía FLIM basadas en el recuento de fotones individuales correlacionadas en el tiempo más populares.

<table><tbody><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>También disponible en Sigma</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de 10 mL</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>Productos similares también están disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas</td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 12 pocillos, estériles</td><td>Greiner bio-one</td><td>665-180</td><td>También hay productos similares disponibles en Sarstedt, Corning y otras empresas.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de 12 pocillos, extraíble</td><td>Ibidi</td><td>81201</td><td>También disponible en Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific y otros</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml Nerbe</td><td>plus 02-502-3001</td><td></td><td>También hay productos similares disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas</td></tr><tr><td>Micromoldes de placa de Petri 3D Microtissue</td><td></td><td>Z764000-6EA</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 6 pocillos, estériles</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td>También hay productos similares disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas</td></tr><tr><td>Etanol al 70%</td><td>ChemLab</td><td>CL02.0537.5000</td><td></td></tr><tr><td>Biofloat</td><td>Sarstedt</td><td>83.3925.400</td><td>Placa de 96 pocillos revestida disponible en el mercado para la formación de esferoides</td></tr><tr><td>Calcein Green-AM</td><td>Tebubio</td><td>AS-89201</td><td>Aplicar en dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Software CellSens Dimension</td><td>Olympus</td><td>versión 3</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de placenta humana, tipo IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Para la preparación de placas de microscopía recubiertas de colágeno 0,07 mg/mL y 0,03 mg/ml de poli-D-lisina</td></tr><tr><td>Microscopio FLIM confocal Microscopio Leica</td><td>Microsystems</td><td>N/A</td><td>Microscopio invertido Stellaris 8 Falcon con láser de luz blanca, detectores HyD X, cámara de control climática / T (OkoLab), objetivo 25x/0,95 W</td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa</td><td>Merck</td><td>8342</td><td>Prepare 1 M solución madre, 1:100 para la preparación del medio de imagen (concentración final 10 mM)</td></tr>Medio de Eagle <tr><td>modificado de Dulbecco (DMEM), sin rojo de fenol, glucosa, piruvato ni glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030-10X1L</td><td>Para la preparación del medio de imagen</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;( FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-098</td><td>También disponible en Sigma. Necesita ser inactivado por calor antes de su uso.</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>Dilución 1/100 para la preparación del medio de imagen (concentración final 10 mM)Células de cáncer de</td></tr> <tr><td>colon humano HCT116</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>versión 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>versión 4.6.1.27508</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>También disponible en Sigma. Aplicar en dilución 1:100.</td></tr><tr><td>Lipidure-CM5206</td><td>Amsbio</td><td>AMS.52000034GB1G</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A, necesita agregar 1 mM de piruvato de sodio y 10 mM HEPES</td><td>VWR</td><td>392-0420</td><td>Medio de crecimiento estándar para células HCT116</td></tr><tr><td>Sellos PDMS IMPRESOS EN 3D CON MICROPATRONES</td> N<td>/A</td><td>N/A</td><td>Proporcionado por el Centro de Tecnología de Microsistemas, Profesor Dr. Jan Vanfleteren, Universidad de Gante</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Chemlab</td><td>CL00.1429.100</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de corte Neubauer</td><td>Fisher Scientific</td><td>15980396</td><td></td></tr><tr><td>sondas de O2: MMIR1</td><td>N/A</td><td>N/A La</td><td>caracterización completa, la validación y algunas aplicaciones se pueden encontrar en: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher scientific</td><td>Gibco18912014</td><td>Disolver la tableta de PBS en 500 mL de agua destilada.</td></tr><tr><td>Estreptococo en pluma :P enicilina (10.000 U/mL)/estreptomicina (10.000 &mu; g/mL) solución 100x</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>También disponible en Sigma. Aplicar en dilución 1:100.</td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407-5mg</td><td>Para la preparación de placas de microscopía recubiertas de colágeno de 0,07 mg/mL y 0,03 mg/mL de poli-D-lisina</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25535-16-4</td><td>Tinción de muerte celular, uso 1 y micro; g/mL a 1h de incubación</td></tr><tr><td>PVDF filtro de jeringa 0,22 y micro; m</td><td>Novolab</td><td>A35149</td><td>También hay productos similares disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Dilución 1/100 para la preparación de medios de imagen (concentración final 1 mM)</td></tr><tr><td>Placa esférica 5D 24 pocillos</td><td>Kugelmeiers</td><td>SP5D-24W</td><td></td></tr><tr><td>Petridish estéril</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td>También hay productos similares disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo de tejidos (25 cm&sup2; )</td><td>VWR</td><td>734-2311</td><td>También hay productos similares disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo de tejidos (75 cm&sup2;)</td><td>VWR</td><td>734-2313</td><td>Productos similares también están disponibles en Sarstedt, Corning, VWR y otras empresas</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos con fondo en U</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>Productos similares también están disponibles en Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one y otras empresas</td></tr><tr><td>Ultrapure Agarose</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>16500-500</td><td>Otros tipos de Agarosa como Agarosa de bajo punto de fusión (A-9414, Sigma), Agarosa de uso rutinario (A-9539, Sigma)</td></tr><tr><td>Microscopio invertido de fluorescencia de campo amplio</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Microscopio de fluorescencia invertida IX81, con control motorizado del eje Z, CoolLED pE4000 (16 canales, 365-770 nm), cámara cMOS ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu), placa calefactora de vidrio Okolab, software CellSens Dimension v.3 y objetivos de aire 4x/0.13 UPlanFLN y 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Opcional, para imágenes de alta resolución) 60x/1.0 LUMPLFLN agua</td></tr></tbody></table>

microscopía de imagen de por vida (flim) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Los esferoides tumorales multicelulares son un modelo popular de microagregados de tejidos en 3D para reproducir el microambiente tumoral, probar y optimizar terapias farmacológicas y utilizar biosensores y nanosensores en un contexto 3D. Su facilidad de producción, tamaño predecible, crecimiento y gradientes de nutrientes y metabolitos observados son importantes para recapitular el microambiente celular de nicho en 3D. Sin embargo, la heterogeneidad de los esferoides y la variabilidad de sus métodos de producción pueden influir en el metabolismo celular general, la viabilidad y la respuesta a los fármacos. Esto dificulta la elección de la metodología más adecuada, teniendo en cuenta los requisitos en tamaño, variabilidad, necesidades de biofabricación y uso como modelos de tejidos 3D in vitro en biología de células madre y cancerosas. En particular, la producción de esferoides puede influir en su compatibilidad con microscopías cuantitativas en vivo, como las imágenes metabólicas ópticas, la microscopía de imágenes de fluorescencia durante toda la vida útil (FLIM), el seguimiento de la hipoxia de esferoide con nanosensores o la viabilidad. Aquí, se presentan una serie de protocolos convencionales de formación de esferoides, destacando su compatibilidad con las microscopías vivas de campo amplio, confocales y de dos fotones. También se presenta la línea de imágenes de seguimiento para análisis con FLIM de autofluorescencia multiplexada y, utilizando varios tipos de esferoides de células madre y cáncer.

En este trabajo se describen diferentes métodos de formación de esferoides multicelulares para realizar un seguimiento de la microscopía multiparamétrica de células vivas. Mediante el uso de microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM), autofluorescencia celular, colorantes de tinción y nanopartículas, se demuestra el enfoque para el análisis del metabolismo celular, la hipoxia y la muerte celular en cáncer tridimensional vivo (3D) y esferoides derivados de células madre.

Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Imágenes de fluorescencia vida (Flim) ha surgido como una técnica clave para la imagen del medio ambiente y la interacción de proteínas específicas y colorantes en las células vivas. Flim de los rotores moleculares fluorescentes permite el mapeo de la viscosidad en las células vivas.

Imágenes de fluorescencia vida de rotores moleculares en las células vivas

Aquí se presenta un protocolo para la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides. Este dispositivo permite imágenes dinámicas o longitudinales de fluorescencia de esferoides de células cancerosas. El protocolo también ofrece un procedimiento simple de procesamiento de imágenes para el análisis de la invasión de células cancerosas.

Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D

El protocolo describe la generación de esferoides de alto rendimiento para la bioimpresión utilizando el análisis multiparamétrico de su oxigenación y muerte celular en un microscopio de fluorescencia estándar. Este enfoque se puede aplicar para controlar la viabilidad de los esferoides y realizar la estandarización, lo cual es importante en el modelado de tejido 3D, el microambiente tumoral y la biofabricación (micro) tisular exitosa.

Biofabricación asequible asistida por microscopía de oxígeno de esferoides multicelulares

Un método para el montaje de gradientes adhesivas y soluble en una cámara de microscopía para estudios en vivo de células de migración se describe. El entorno de ingeniería combina superficies antiincrustantes y pistas adhesivas con gradientes de solución y por lo tanto permite determinar la importancia relativa de las señales de orientación.

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para visualizar y rastrear receptores individuales en la superficie de las células vivas y, por lo tanto, analizar la movilidad lateral del receptor, el tamaño de los complejos de receptores, así como para visualizar las interacciones transitorias receptor-receptor. Este protocolo puede extenderse a otras proteínas de membrana.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

La distribución espacial y la dinámica temporal de las proteínas y lípidos de la membrana plasmática es un tema candente en biología. En este caso, este problema se aborda mediante un análisis de fluctuación de imagen espacio-temporal que proporciona conceptualmente las mismas cantidades físicas de seguimiento de una sola partícula, pero utiliza etiquetas moleculares pequeñas y configuraciones de microscopía estándar.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

Se desarrolló un novedoso protocolo de imagen utilizando un actuador mecánico accionado por motor personalizado para permitir la medición de las respuestas en tiempo real a la tensión mecánica en células vivas. Relevante para la mecanobiología, el sistema puede aplicar deformaciones de hasta el 20% al tiempo que permite obtener imágenes casi en tiempo real con microscopía confocal o de fuerza atómica.

Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

Un microscopio avanzado que permite rápido y de alta resolución de imagen de la membrana plasmática aislada y el volumen intracelular circundante, se presentará. La integración de microscopía de fluorescencia de reflexión interna disco y total en una configuración de giro permite energizados experimentos de imagen a precios de adquisición alto hasta 3.5 s por grupo imagen.

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

Presentamos un dispositivo microfluídico centrífugo motorizado que puede cultivar esferoides celulares. Usando este dispositivo, los esferoides de uno o varios tipos de células podrían ser fácilmente cocultivos bajo condiciones de alta gravedad.

Plataforma Lab-on-a-CD para generar esferoides tridimensionales multicelulares

El método presentado implica el estiramiento uniaxial de hidrogeles blandos 3D incrustados en caucho de silicona mientras permite la microscopía confocal viva. Se demuestra la caracterización de las cepas de hidrogel externas e internas, así como la alineación de la fibra. El dispositivo y el protocolo desarrollados pueden evaluar la respuesta de las células a diversos regímenes de deformación.

Cepa controlada de hidrogeles 3D bajo imágenes de microscopía en vivo

Aprenda a producir esferoides multicelulares para análisis multiparamétrico mediante microscopía FLIM de células vivas. Este método permite estudiar metabolismo celular y distribución de oxígeno en modelos 3D.

Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares (Video) | JoVE Journal

Microscopía de imagen de por vida (FLIM) de fluorescencia de células vivas multiparamétricas y producción de esferoides multicelulares

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