Name: Método basado en la extracción de apoplastos para mejorar la pureza de la proteína recombinante producida por plantas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Aprende a extraer proteínas recombinantes del apoplasto de Nicotiana benthamiana mediante infiltración al vacío y centrifugación. Este método mejora la pureza hasta un 84,3% sin destruir células, reduciendo costos de purificación.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de la Asociación Juvenil de Promoción de la Innovación CAS (2021084) y el Fondo de Apoyo al Proyecto de Despliegue Clave del Plan de Acción Trienal del Instituto de Microbiología de la Academia China de Ciencias.

1. Preparación de plantas de N. benthamiana 
<ol><li>Coloque los bloques de plántulas en una bandeja, agregue 1 L de agua y remoje durante aproximadamente 2 h hasta que estén completamente saturados.</li>
	<li>Espolvoree uniformemente las semillas de N. benthamiana de tipo silvestre en los bloques de plántulas, cúbralos con una tapa y germine durante 1 semana. Cultivar N. benthamiana en un invernadero con fotoperiodo de 18 h, 24 °C, 45% de humedad relativa y fertilizar cada 2 semanas.</li>
	<li>Una vez que las semillas hayan brotado, use pinzas para quitar suavemente una plántula, teniendo cuidado de no dañar sus raíces. Cava un pequeño hoyo en el centro de una bandeja nueva, coloca la plántula en él y cubre las raíces ligeramente con tierra. Cubra con una tapa y continúe creciendo.</li>
	<li>Crezca hasta que las plántulas tengan tres hojas, con la tapa puesta. Retire la tapa cuando emerja la4ª hoja verdadera.</li>
	<li>Permita que las plantas continúen creciendo durante dos semanas más antes de la agroinfiltración.</li>
</ol>2. Construcción de la GFP-His recombinante
<ol><li>Realizar la optimización y síntesis de codones de N. benthamiana de GFP y PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) a partir de las secuencias de genes.</li>
	<li>Realizar la doble digestión del vector pCAMBIA1300 utilizando las enzimas Xba I y Sac I (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Realice la amplificación de PR1a utilizando cebadores ascendentes (TTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGATT TGTTCTCTTTTC) y cebadores posteriores (TCCTCG CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA GTGGG), amplificación de GFP utilizando cebadores ascendentes (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGTCGACATGGTGAG CAAGGGCGAGGA) y cebadores descendentes (GGGGAAATTCGAGCTCTCAGTGGTGATGGTGGTG GTGAGATCTTCCGGACTTGT).</li>
	<li>Usando recombinación homóloga, clona PR1a y GFP en el vector de expresión de plantas pCAMBIA1300. Después de la transferencia a E. coli, seleccione clones individuales y envíelos a la empresa para su secuenciación. La comparación de los resultados de la secuenciación y el plásmido correcto es el plásmido recombinante pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, denominado p35s-PR1a-GFP-His.</li>
</ol>3. Producción de GFP-His en N. benthamiana
<ol><li>Agregue 1 μL de plásmido GFP en 50 μL de células receptoras Agrobacterium GV3101, mezcle suavemente y agregue a la copa de electrodos, retire después de la electrocución en el electrochoque.</li>
	<li>Esparcir Agrobacterium tumefaciens transformado en una placa de medio sólido LB que contenía 50 μg/mL de kanamicina (Kan) y 50 μg/mL de rifampicina (Rif). Incubar invertido a 28 °C durante 48 h. El vector pCAMBIA1300 es resistente a kan y Agrobacterium es resistente a rif; solo el Agrobacterium correcto puede crecer en placas con Kan y Rif. Los clones monoclonales fueron los transformantes positivos, denominados A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).</li>
	<li>Use un palillo de dientes esterilizado para recoger una cantidad adecuada de AtGPG e inocularla en 4 mL de LB líquido con Kan y Rif. Cultivo a 28 °C, 220-300 rpm durante 24 h.</li>
	<li>Subcultivar bacterias 1:50 en LB fresco (50 μg/mL de Kan, 10 mM de ácido etanosulfónico (MES) 2-(N-Morfolino), 20 μM de acetosiringona (AS)) e incubar a 28 °C, 220-300 rpm durante 10-12 h.</li>
	<li>Recolectar las bacterias por centrifugación a 1500 x g durante 10 min y resuspender el pellet con 1 mL de MMA (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 100 μM AS).</li>
	<li>Mida y ajuste la densidad óptica (OD) de AtGPG a OD600 = 0.8 usando MMA. Incubar las bacterias durante otras 2-4 h a temperatura ambiente. Extraiga la solución bacteriana con una jeringa sin aguja, presiónela ligeramente contra la parte posterior de las hojas y ejerza presión para que la solución penetre en las hojas. Inyecte solo las 3-4 hojas del medio por planta.</li>
	<li>Continúe cultivando N. benthamiana en el invernadero durante 3-4 días antes de cosechar las hojas para la extracción de proteínas.</li>
</ol>4. Observación de la localización subcelular de GFP
<ol><li>Después de 48 h de agroinfiltración, seleccione una hoja plana y utilice un perforador de 6 mm para sujetar la hoja para perforar.</li>
	<li>Gotee la solución de sacarosa al 30% en un portaobjetos de vidrio, coloque la muestra de hoja con el dorso hacia arriba y cúbrala con un cubreobjetos.</li>
	<li>Establezca la longitud de onda de excitación en 488 nm y detecte la fluorescencia verde a 490-550 nm después de un aumento de 400x. Haz la primera foto una vez que la diapositiva esté preparada y otra 10 min después.</li>
</ol>5. Extracción de GFP de la planta
<ol><li>Extracción AWF<ol><li>Recoja las hojas frescas intactas de N. benthamiana que expresan GFP recombinante a los 3 días después de la agroinfiltración. Trate la hoja con suavidad y mantenga la integridad de la hoja para evitar el flujo de proteínas intracelular. Use las hojas recolectadas para el siguiente paso inmediatamente para evitar la degradación de proteínas.</li>
		<li>Enjuague la hoja con ddH2O esterilizado preenfriado para eliminar los desechos.</li>
		<li>Pesar las hojas frescas y sumergir 20 g de hojas (con el lado abaxial hacia abajo) en 100 mL de tampón de fosfato de 100 mM preenfriado (PB 100 mM Na2HPO4 y 100 mM NaH2PO4 se configuraron por separado y se mezclaron en una proporción de 2,2:1 pH 7,0) en un vaso de precipitados de boca ancha de 200 mL. Cubra las hojas con hilo de malla fina de nailon de malla 100 (consulte la tabla de materiales) y un plato de plástico. NOTA: El preenfriamiento evita la degradación de las proteínas. Los volúmenes de tampón se pueden ajustar en función de la escala experimental. Asegúrese de que todas las hojas estén sumergidas.</li>
		<li>Coloque el vaso de precipitados en una bomba de vacío. Aplique una aspiradora de 0,8 MPa durante 1 minuto y, a continuación, restablezca rápidamente la presión atmosférica.</li>
		<li>Retire las hojas del tampón y séquelas suavemente con papel absorbente. Enrolle las hojas, envuélvalas con hilo de malla y coloque 5 g de hojas en cada tubo de centrífuga de 50 ml. Para recoger AWF, coloque las hojas enrolladas con la punta hacia arriba en tubos con hilo de malla sujeto por las tapas de los tubos.</li>
		<li>Centrifugar a 4 °C, 500 x g durante 5 min. Retire las hojas y recoja el AWF en el fondo del tubo con una pipeta. Se pueden obtener aproximadamente 5 mL de AWF de cada tubo. NOTA: Para minimizar la interferencia de las proteínas intracelulares y extraer la máxima cantidad de proteínas AWF, la extracción se puede repetir 2x-3x, pero no más de 3x.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de proteínas solubles totales<ol><li>Muele 20 g de hojas hasta convertirlas en polvo fino en nitrógeno líquido. Agregue tampón de extracción (50 mM de Tris-HCl pH 7.4, 150 mM de NaCl, 10% de glicerol, 1% de Triton X-100, 0.034% de β-mercaptoetanol (ver Tabla de Materiales)) en una proporción de 1:2.</li>
		<li>Agitar homogeneizar en una batidora vertical durante 30 min a 4 °C. Homogeneizar la centrífuga a 13.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y repita la centrifugación durante 15 min. Transfiera el sobrenadante aclarado a otro tubo.</li>
		<li>Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 μm (ver Tabla de Materiales) para obtener extracto de proteína soluble total.</li>
	</ol></li>
</ol>  
6. Purificación de GFP-His con cromatografía de afinidad de níquel (Ni)
NOTA: Realice todos los pasos a 4 °C.
<ol><li>Agregue resina Ni sepharose excel (ver Tabla de materiales) a un tubo en una proporción de 1:1000 en relación con el volumen del extracto de proteína del paso 5.1.6. El volumen de resina es igual a 1/1000del volumen del extracto proteico.</li>
	<li>Lave la resina Ni 3x con un volumen de resina 10x de ddH, 2, O y PB (pH 7.0) por separado, a su vez, y elimine el sobrenadante.</li>
	<li>Incubar el extracto proteico con resina de Ni durante 2 h para permitir una unión completa. Centrifugar a 500 x g durante 5 min para eliminar las proteínas no unidas en el sobrenadante. Lavar 3 veces con un volumen de resina 20x de PB. Centrifugar a 500 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Eluir GFP-His añadiendo 10 veces el volumen de resina de 250 mM de imidazol (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 10% de glicerol, 250 mM de imidazol) y recoger el sobrenadante.</li>
</ol>7. Tinción de proteínas con azul de Coomassie
<ol><li>Añada 10 μL de tampón de carga 5x SDS a 40 μL de muestras de proteína, hierva durante 10 min, luego ejecute en SDS-PAGE al 15% a 110 V durante 60 min.</li>
	<li>Tiñir geles de proteínas con solución de azul de Coomassie (0,1% R-250, 25% isopropanol, 10% ácido acético glacial) durante 2 h.</li>
	<li>Vierta la solución y lave con solución decolorante durante 2 h. Observa el gel; Las proteínas del gel serán de color azul.</li>
</ol>8. Western blot de proteínas
<ol><li>Añada 10 μL de tampón de carga 5x SDS a 40 μL de muestras de proteína, hierva durante 10 min, luego ejecute en SDS-PAGE al 15% a 110 V durante 60 min.</li>
	<li>Transfiere proteínas a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm a 280 mA. Bloquear la membrana con leche desnatada al 5% durante 1 h.</li>
	<li>Diluir los anticuerpos anti-His-tag a 1:5000 e incubar la membrana con los anticuerpos durante 1 h. Use la solución salina tamponada con tris y tween 20 (TBST) para lavar la membrana 4 veces durante 5 minutos.</li>
	<li>Diluir los anticuerpos anti-ratón a 1:10000 e incubar la membrana con los anticuerpos durante 1 h. Use TBST para lavar la membrana 4 veces durante 5 min.</li>
	<li>Mezcle el revelador (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:1. Añadir 400 μL a la membrana y dejar reaccionar durante 1 min. Tome fotografías después de 1 minuto de exposición con un visualizador.</li>
</ol>9. Ensayo de concentración de proteínas
<ol><li>Agregue 5 μL de proteína a 1 mL de reactivo de colorante Bradford 1x y reaccione durante 5 min.</li>
	<li>Determine el valor de OD595 después de la puesta a cero y calcule la concentración de proteínas a partir de la curva estándar.</li>
</ol>10. Cuantificación de proteínas 31
<ol><li>Realice la transferencia occidental de muestras de proteínas junto con estándares.</li>
	<li>Realice la cuantificación de GFP por relación con los estándares utilizando el análisis en escala de grises ImageJ 1.5.0.</li>
</ol>

Extracción y purificación eficiente de GFP-His de hojas de N. benthamiana

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</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

El uso de plantas para producir proteínas terapéuticas se ha expandido rápidamente en los últimos años 1,2,3,4,5,6. Los genes que codifican proteínas se clonan en vectores de expresión y se introducen en los tejidos de las plantas mediante agroinfiltración. Después de la producción por parte de las células vegetales, las proteínas se purifican para aplicaciones posteriores. Por lo general, las proteínas recombinantes se purifican a partir de extractos de TSP. Sin embargo, las abundantes proteínas vegetales y citocromos liberados por las células vegetales durante la extracción pueden dificultar la purificación33. Por un lado, los citocromos de las plantas pueden obstruir las columnas de separación, ralentizando el procesamiento17; por otro lado, proteínas muy abundantes como RuBisCO son difíciles de eliminar, lo que reduce la pureza18,19. Estos problemas se vuelven más problemáticos cuando las proteínas objetivo se expresan en niveles bajos. La purificación de AWF evita estos problemas, lo que permite una mayor pureza (Figura 2J).
Si bien la extracción de AWF se ha utilizado ampliamente en biología vegetal 24,25,26,27, rara vez se explota en las tuberías de cultivo molecular. En este caso, utilizamos un modelo de GFP de origen vegetal para demostrar la purificación de proteínas basada en AWF. La extracción de GFP del AWF se realizó mediante la adición de un péptido señal para permitir la secreción de GFP en el espacio apoplasto. Este método extrae proteínas con mayor homogeneidad y reduce los costos posteriores de procesamiento de proteínas. Varias consideraciones ameritan una investigación futura para implementar la purificación de AWF en biorreactores de plantas. En primer lugar, la secreción eficiente requiere la fusión de péptidos señal N-terminales específicos. En segundo lugar, para preservar la calidad de AWF, las hojas intactas deben procesarse rápidamente después de la cosecha sin congelarse, lo que libera contenidos intracelulares. En tercer lugar, el PB extrae eficazmente las proteínas AWF34, pero el pH tampón y la concentración de sal deben adaptarse a las proteínas recombinantes individuales (Figura 2C-D). En cuarto lugar, logramos proteína purificada a partir de 200 g de N. benthamiana muchas veces en condiciones de laboratorio con una pureza y un rendimiento estables. Para su uso en la fábrica, se solicitan recipientes y bombas de vacío más grandes y un método de purificación más eficaz, y es posible que sea necesario optimizar condiciones como la duración del vacío, el número de recuperaciones, etc.
Este método está limitado por el hecho de que las proteínas exógenas se secretan en el AWF, y las proteínas dentro de la membrana plasmática se abandonan (Figura 2H-I). Aporta el beneficio de obtener proteínas purificadas más altas con la modificación correcta pero a un mayor costo de rendimiento. El principal cuello de botella técnico para la purificación basada en AWF es la mejora del nivel de proteína objetivo dentro de AWF. El acoplamiento con promotores fuertes y sistemas de secreción optimizados mejorará las plataformas de expresión de las plantas para obtener una alta pureza y mayores rendimientos. Para superar este cuello de botella, se pide un sistema de producción más alto y un sistema de secreción más eficaz en los trabajos futuros.

Hoy en día, se están estudiando varias proteínas terapéuticas recombinantes producidas por plantas, incluidos anticuerpos, vacunas, proteínas bioactivas, enzimas y pequeños polipéptidos 1,2,3,4,5,6. Las plantas se están convirtiendo en una plataforma cada vez más utilizada para la producción de proteínas terapéuticas debido a su seguridad, bajo costo y capacidad para escalar rápidamente la producción 7,8. La expresión y modificación de proteínas en los sistemas vegetales, junto con la purificación de proteínas, son factores críticos que determinan la productividad de los biorreactores vegetales 9,10. La mejora de la productividad de las plantas y la obtención de proteínas objetivo de alta pureza son los principales retos a los que se enfrentan los sistemas de producción basados en plantas11,12.
La localización subcelular y la modificación de las proteínas recombinantes dependen del péptido señal específico codificado en el extremo N-terminal, que dirige la proteína a su destino final del orgánulo durante la expresión génica. Las proteínas recombinantes están diseñadas para localizarse en el apoplasto, el retículo endoplásmico (RE), el cloroplasto, la vacuola o el citoplasma, en función de sus propiedades únicas13. Para los antígenos y anticuerpos, se prefieren las proteínas secretadas. Antes de la secreción, las proteínas progresan a través de RE y Golgi para un correcto plegamiento y modificaciones postraduccionales 14,15,16.
Después de la producción en plantas, las proteínas recombinantes deben purificarse a partir de extractos de plantas. Por lo general, las proteínas se purifican a partir de extractos de plantas solubles totales, que contienen abundantes proteínas intracelulares, productos mal plegados y no modificados, y citocromos17. Para eliminar las impurezas, los extractos de plantas se someten a un fraccionamiento extenso, que incluye cromatografía de afinidad específica de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO), precipitación de fitatos, precipitación de polietilenglicol y ajuste de temperatura y pH18,19. Estos pasos de eliminación de impurezas son laboriosos y pueden comprometer la calidad de la proteína.
El compartimento de la célula vegetal más allá de la membrana plasmática se define como el apoplasto, que abarca la pared celular, los espacios intercelulares y el xilema20. La fase acuosa se denomina comúnmente fluido de lavado apoplasto (AWF). AWF contiene moléculas secretadas por las células para regular numerosos avances biológicos como el transporte, el metabolismo de la pared celular y las respuestas al estrés21,22. A diferencia de TSP, los constituyentes moleculares de AWF son menos complejos. La extracción de proteínas recombinantes de AWF puede evitar la contaminación por proteínas intracelulares, productos mal plegados y restos citoplasmáticos. Brevemente, el lípido de extracción ingresa a las hojas a través de los estomas bajo presión negativa, y el AWF se recolecta por centrifugación suave23. Si bien el aislamiento de AWF se emplea ampliamente para estudiar el progreso biológico dentro del apoplasto 24,25,26,27, no se ha explotado en sistemas de producción basados en plantas.
La mejora de la productividad de las plantas y la obtención de proteínas objetivo de alta pureza son desafíos centrales para los sistemas de producción de plantas28. Por lo general, las proteínas se purifican a partir de extractos de plantas solubles totales que contienen grandes cantidades de proteínas intracelulares, productos mal plegados y no modificados, y citocromos29, que requieren grandes costos para su posterior purificación30. El uso de métodos de extracción de proteínas AWF para la extracción de proteínas recombinantes exógenas secretadas en apoplasto puede mejorar eficazmente la homogeneidad de las proteínas recombinantes y reducir el costo de la purificación de proteínas. Aquí, utilizamos un péptido señal PR1a para permitir la secreción de proteínas exógenas en el espacio apoplasto e introducimos un método detallado para la purificación de proteínas recombinantes a partir del AWF de N. benthamiana.

<table><tbody><tr><td>Hilo de malla fina de nailon de malla 100</td><td>Guangzhou Huayu Trading sociedad limitada</td><td>hy-230724-2</td><td>Para la extracción de proteínas AWF</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml</td><td>Vazyme</td><td>TCF00150</td><td>Para centrífuga</td></tr><tr><td>ClonExpress II kit de clonación de un solo paso</td><td>Vazyme</td><td>C112-02</td><td>Para clon</td></tr><tr><td>FastDigest Sac1</td><td>NEB</td><td>R3156S</td><td>Para clon</td></tr><tr><td>FastDigest XbaI</td><td>NEB</td><td>FD0685</td><td>Para clon</td></tr><tr><td>ImageJ 1.5.0</td><td>/</td><td>/</td><td>Para análisis de escala de grises</td></tr><tr><td>Filtro grande</td><td>Thermo Fisher</td><td>NEST</td><td>Para filtrado</td></tr><tr><td>Microscopía confocal de barrido láser</td><td>Leica SP8</td><td></td><td>Para la localización subcelular</td></tr><tr><td>Ni sepharose excel</td><td>Cytiva</td><td>10339806</td><td>Para la purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Proteína prefabricada más gel</td><td>YEASEN</td><td>36246ES10</td><td>Para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Filtro pequeño</td><td>Nalgene</td><td>1660045</td><td>Para filtrar</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Substrate Trial Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>34076</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SCR</td><td>30188928</td><td>Para configurar el tampón de extracción</td></tr><tr><td>Tipo bomba de vacío rotativavang</td><td>Zhejiang taizhouqiujing bomba de vacío limitada</td><td>2XZ-2</td><td>Para infiltración al vacío</td></tr><tr><td>Mezclador vertical</td><td>Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing sociedad limitada</td><td>BE-1200</td><td>Para mezclar</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>SIGMA</td><td></td><td>BCBK8223V Para configurar el tampón de extracción</td></tr></tbody></table>

método basado en la extracción de apoplastos para mejorar la pureza de la proteína recombinante producida por plantas  

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Las plantas son un sistema de expresión eucariota en desarrollo reciente que se está explorando para producir proteínas terapéuticas. La purificación de proteínas recombinantes de plantas es uno de los pasos más críticos en el proceso de producción. Por lo general, las proteínas se purificaron a partir de proteínas solubles totales (TSP), y la presencia de proteínas intracelulares diversas y citocromos plantea desafíos para los pasos posteriores de purificación de proteínas. Además, la mayoría de las proteínas terapéuticas, como los antígenos y los anticuerpos, se secretan para obtener una glicosilación adecuada, y la presencia de proteínas modificadas incompletamente conduce a estructuras de antígenos o anticuerpos inconsistentes. Este trabajo introduce un método más eficaz para obtener proteínas recombinantes altamente purificadas a partir del espacio apoplástico de la planta. La proteína verde fluorescente recombinante (GFP) se diseña para ser secretada en el apoplasto de Nicotiana benthamiana y luego se extrae utilizando un método de infiltración-centrifugación. A continuación, el GFP-His del apoplasto extraído se purifica mediante cromatografía de afinidad de níquel. A diferencia de los métodos tradicionales de TSP, la purificación del apoplasto produce proteínas recombinantes altamente purificadas. Esto representa una importante mejora tecnológica para los sistemas de producción de las plantas.

GFP-His es el objetivo de la secreción en el espacio apoplástico de N. benthamiana GFP se clonó en el plásmido pCAMBIA1300 con un péptido señal PR1a N-terminal para la secreción y una etiqueta His C-terminal para la purificación, generando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). La proteína recombinante se expresó transitoriamente en N. benthamiana y se detectó una banda de 30 kDa mediante Western blot utilizando anticuerpo anti-His a los 3 días después de la agroinfiltración (Figura 1B). La plasmólisis es el tratamiento de las hojas utilizando una solución hipertónica para separar la pared celular de la membrana celular32. Para determinar si la GFP se localiza en el apoplasto, utilizamos sacarosa al 30% para realizar la plasmólisis de las hojas. La microscopía de fluorescencia ilustró la presencia de GFP-His dentro del apoplasto (Figura 1C). Las proteínas AWF extraídas por infiltración-centrifugación al vacío también contenían GFP-His (Figura 1D). Estos resultados demuestran la secreción de GFP-His en el AWF de las hojas de N. benthamiana , de la cual se puede extraer para su purificación posterior.
Purificación de proteínas a partir de AWF La eficacia de la extracción de AWF influye fuertemente en el rendimiento final de GFP. Sobre la base de los protocolos de extracción AWF publicados 24,25,26,27, probamos varias soluciones para optimizar la recuperación de GFP-His secretados. Aquí se examinaron ocho soluciones de extracción: 25 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM de NaH2PO4 (pH 4,5), 50 mM de NaCl (pH 7,1), 40 mM de KCl (pH 7,0), 20 mM de CaCl2 (pH 5,7), 100 mM de PB (pH 7,0), 10 mM de MES (pH 5,6) y ddH2O (pH 7,0). PB extrajo la mayor cantidad de AWF y GFP-His, superando a otras soluciones en más de 4 veces (Figura 2A,B). La comparación de PB a pH variable reveló una mejora en la extracción de AWF y GFP-His en condiciones neutras a ligeramente alcalinas (pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,0; Figura 2C,D). Además, se compararon PB con concentraciones de 50 mM, 100 mM y 150 mM para determinar la eficacia de la extracción. Los resultados indicaron que 100 mM PB mostraron la máxima eficacia para recuperar tanto AWF como GFP-His (Figura 2E,F).
Sobre la base de estos experimentos de optimización, se seleccionaron 100 mM de PB, pH 7.0, para la extracción de AWF a gran escala de N. benthamiana. Con este tampón, se recuperaron 495 μg de proteínas AWF totales por gramo de material de hoja fresca del apoplasto (Figura 2G). El AWF extraído contenía 10 μg de GFP-His (Figura 2H), lo que correspondía aproximadamente al 18% del total de GFP-His en el TSP (Figura 2I). Después de la cromatografía de afinidad de Ni, la pureza de GFP-His alcanzó el 84,3% con la extracción con AWF, sustancialmente más alta que la pureza del 44,9% lograda con la extracción de proteínas solubles totales (Figura 2J).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66852/66852fig01.jpg"> Figura 1: GFP-His se dirige para su secreción en el apoplasto de N. benthamiana. (A) Esquema de la construcción de PR1a-GFP-His en el vector de expresión de plantas pCAMBIA1300. (B) Western blot que detecta la producción de GFP-His en N. benthamiana. Aquí se cargaron y detectaron 10 μL de muestras de proteína. Las hojas de N. benthamiana inyectadas simultáneamente con MMA se utilizaron como control negativo. El mismo volumen de muestras fue examinado y teñido utilizando subunidades grandes de la planta como control de carga (C) Microscopía confocal que muestra la localización subcelular de GFP-His (verde). Las hojas de N. benthamiana se plasmolizaron con 30% de sacarosa. Las líneas discontinuas blancas indican la membrana plasmática. Las flechas rojas denotan la acumulación de GFP-His en el apoplasto. (D) Western blot que demuestra la presencia de GFP-His en el fluido apoplástico extraído. Aquí se cargaron y detectaron 10 μL de muestras de proteína. Las hojas de N. benthamiana inyectadas simultáneamente con MMA se utilizaron como control negativo. Abreviaturas: 35s = 2x Promotor del virus del mosaico de la coliflor 35s; PR1a = péptido señal de proteína 1a relacionado con la patogénesis del tabaco ; Su = 6 veces su etiqueta; Nos = terminador de nopalina sintasa. BS = antes de la plasmólisis; PS = post-plasmólisis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66852/66852fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66852/66852fig02.jpg"> Figura 2: Optimización del método de extracción de proteínas de AWF. (A-B) Extracción de proteínas de AWF utilizando diferentes tampones. Se probaron ocho soluciones para la extracción de proteínas de AWF: 25 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM de NaH2PO4 (pH 4,5), 50 mM de NaCl (pH 7,0), 40 mM de KCl (pH 7,0), 20 mM de CaCl2 (pH 5,7), 100 mM de PB (pH 7,0), 10 mM de MES (pH 5,6) y ddH2O (pH 7,0). La eficiencia de la extracción se analizó mediante SDS-PAGE (A), y GFP-His se detectó mediante Western blot utilizando el anticuerpo anti-His (B). (C-D) Extracción mediante PB a diferentes valores de pH. Para la extracción de AWF se utilizó PB con pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 y 8.0. La eficiencia de extracción se detectó mediante SDS-PAGE (C), y GFP-His se detectó mediante Western blot con anticuerpo anti-His (D). (E-F) Extracción mediante PB a diferentes concentraciones. Se utilizaron PB a 50 mM, 100 mM y 150 mM para la extracción de AWF. La eficiencia de extracción se analizó mediante SDS-PAGE (E), y GFP-His se detectó mediante western blot con anticuerpo anti-His (F). (G-H) Análisis cuantitativo de las proteínas extraídas. Las proteínas se extrajeron utilizando 100 mM de PB (pH 7,0). Se cuantificaron la proteína soluble total (G) y GFP-His (H) para el análisis estadístico. (I) Análisis estadístico de la proporción de la PTF AWF con respecto a la PFP total. (J) Purificación de GFP-His a partir de proteínas solubles totales de N. benthamiana o AWF. Las proteínas se extrajeron utilizando 100 mM de PB (pH 7,0) y el GFP-His se purificó mediante cromatografía de afinidad de Ni. La purificación se analizó mediante SDS-PAGE. El carril más a la derecha es el estándar BSA de 1 μg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66852/66852fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La purificación de proteínas recombinantes de sistemas vegetales generalmente se ve desafiada por las proteínas vegetales. Este trabajo proporciona un método para extraer y purificar eficazmente una proteína recombinante secretada del apoplasto de Nicotiana benthamiana.

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