Name: Transformación mitocondrial en Baker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprende la transformación mitocondrial en levadura para estudiar la síntesis de proteínas y el ensamblaje de complejos respiratorios usando Saccharomyces cerevisiae. Este método permite investigar la función mitocondrial a nivel molecular.

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Esta publicación contó con el apoyo del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 a XP-M]. La UPD es becaria de CONAHCYT (CVU:883299). Queremos agradecer a la Dra. Ariann Mendoza-Martínez por su ayuda técnica con las imágenes del microscopio óptico. Licencias de Biorender: DU26OMVLUU (Figura 2); BK26TH9GXH (Figura 3); GD26TH80R5 (Figura 4); PU26THARYD (Figura 7); ML26THAIFG (Figura 9).

NOTA: Recomendamos realizar seis transformaciones para cada constructo, ya que la eficiencia de la transformación mitocondrial suele ser baja. La composición de los diferentes medios de crecimiento se muestra en la Tabla 2.
1. Preparación de partículas de tungsteno
<ol><li>Pesar 30 mg de partículas de tungsteno de 0,7 μm (WP, microportadores) en un microtubo. Añadir 1,5 mL de etanol al 70% (EtOH) para esterilizar. Agita los WP y déjalos reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar a 13.200 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Lave los WP añadiendo 1,5 mL de agua estéril a las partículas, vórticándolas y centrifugando a 13.200 × g durante 15 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 500 μL de glicerol estéril al 50% (la concentración final es de 60 μg de WPs/μL). NOTA: Los WP pueden almacenarse a -20 °C durante al menos 6 meses. De este caldo, se toma la cantidad necesaria para seis transformaciones (100 μL).</li>
</ol>2. Recubrimiento de ADN WP
<ol><li>Añadir 5 μg del plásmido de 2 μ y 15 μg del plásmido bacteriano que contiene la secuencia mitocondrial a un microtubo en hielo. NOTA: El volumen final no debe exceder los 50 μL para evitar diluir aún más los reactivos necesarios para el recubrimiento del ADN.</li>
	<li>Añadir 100 μL de la suspensión WP y el vórtice durante 5 s (6 mg de WPs).</li>
	<li>Añadir 4 μL de espermidina 1 M. Breve vórtice.</li>
	<li>Añadir 100 μL de CaCl2 2,5 M helado, brevemente en vórtice. Incubar en hielo durante 10 min; Agita brevemente la mezcla cada 3 min. NOTA: La solución de CaCl2 está esterilizada por filtro y no debe esterilizarse en autoclave.</li>
	<li>Centrifugar los WP durante 30 s a 13.200 × g a 4 °C y desechar el sobrenadante. Lave las partículas resuspendiéndolas suavemente en 200 μL de EtOH al 100% a -20 °C.</li>
	<li>Centrifugar los WP durante 30 s a 13.200 × g a 4 °C y desechar el sobrenadante. Repite el lavado.</li>
	<li>Vuelva a suspender los WP en 60-70 μL de EtOH 100% a temperatura ambiente con una punta de pipeta; No haga vórtice. NOTA: Para garantizar la calidad de los plásmidos, el recubrimiento de ADN debe realizarse el mismo día que la transformación biológica.</li>
</ol>3. Preparación de materiales biológicos
<ol><li>Antes del bombardeo, esterilice seis soportes de macroportadores (Figura 5) en un autoclave y séquelos completamente. Alternativamente, sumérjalos en EtOH y esterilícelos con una llama con la ayuda de pinzas. Colócalos en un plato de vidrio estéril.</li>
	<li>Durante la precipitación del ADN (10 minutos de incubación en hielo en el paso 2.4), inserte seis macroportadores (o discos voladores) en cada uno de los seis soportes de macroportadores con la ayuda de pinzas estériles. NOTA: No esterilice los macroportadores.</li>
	<li>Mezcle los WP recubiertos de ADN con la pipeta. Añadir 10 μL de los WP a cada superficie del macroportador y distribuir por toda la superficie con la punta de la pipeta. Si es necesario, agregue algunos microlitros adicionales de 100% EtOH a la superficie del macroportador para hacer una distribución uniforme de los WP. Deje que la suspensión se seque a temperatura ambiente durante ~ 20 min.</li>
</ol>4. Preparación de células de levadura y placas de bombardeo
<ol><li>Inocular la cepa del receptor rho0 en 2 mL de medio YPR (Tabla 2). Cultivar durante una noche a 30 °C en una rueda giratoria.</li>
	<li>Diluir 300 μL del cultivo en 30 mL de medio YPR fresco. Cultivar a 30 °C y 200 rpm en un agitador rotativo durante dos noches hasta que el cultivo esté saturado.</li>
	<li>Centrifugar las células de levadura a 600 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células de levadura en 600 μL de medio YPD (Tabla 2).</li>
	<li>Con un mango de vidrio estéril, extienda 100 μL de la suspensión de células de levadura en una placa sólida de medio de bombardeo. NOTA: El medio de bombardeo debe carecer del marcador de selección del plásmido de 2 μ que se utilizará para la transformación.</li>
	<li>Repita el paso 4.4 para los otros cinco platos.</li>
	<li>Incube durante 1-3 h a temperatura ambiente antes del bombardeo para asegurarse de que el medio líquido se absorba completamente en la superficie de la placa.</li>
</ol>5. Generación de una cepa sintética por transformación biológica
NOTA: Antes de comenzar, asegúrese de leer el manual del usuario del equipo biológico. Describiremos el protocolo de los equipos referenciados (Tabla de Materiales y Figura 5).
<ol><li>Limpie la cámara del sistema de suministro de partículas biológicas con etanol al 70% para evitar la contaminación y déjela reposar durante al menos 10 minutos. Justo antes del bombardeo, limpie la superficie con una toalla de papel limpia.</li>
	<li>Abra las válvulas del tanque de helio para ajustar alrededor de 2,000 psi.</li>
	<li>Encienda el equipo y encienda la fuente de vacío.</li>
	<li>Con pinzas, coloque el macroportador boca abajo en el soporte del macroportador. NOTA: No utilice la pantalla de parada que viene con el equipo.</li>
	<li>Enrosque la tapa del macroportador en la parte superior del macroportador. Todas las partes juntas constituyen el sistema de lanzamiento de microportadores (Figura 5).</li>
	<li>Coloque el sistema de lanzamiento de microportadores dentro de la cámara de vacío en el quinto nivel desde la parte inferior.</li>
	<li>Coloque una de las placas que contienen el césped de cepa rho0 en el segundo nivel desde el fondo de la cámara. Asegúrese de que el plato esté hacia arriba y sin la tapa.</li>
	<li>Con pinzas estériles, coloque un disco de ruptura en la tapa de retención. Enrosque la tapa de retención en el tubo de aceleración; Asegúrese de que la tapa de retención esté ajustada. NOTA: No tratar los discos rotos con isopropanol como se sugiere en el manual ya que hemos observado que la eficiencia de transformación disminuye.</li>
	<li>Cierre la puerta de la cámara de vacío.</li>
	<li>Coloque el interruptor VAC/VENT/HOLD en la posición VAC . Cuando se alcance un vacío de 25-28 inHg , cambie el interruptor VAC/VENT/HOLD a la posición HOLD . NOTA: Tenga en cuenta que el vacío alcanzable puede variar según el nivel del mar. Encontramos éxito alcanzando 25 inHg.</li>
	<li>Presione el interruptor FIRE para disparar los WP. Espere a que la presión se acumule en el tubo de aceleración hasta que alcance los 1,300 psi, momento en que el disco de ruptura se romperá, haciendo un sonido de estallido.</li>
	<li>Inmediatamente después de que se rompe el disco de ruptura, el interruptor FIRE y el vacío se liberan cambiando el interruptor VAC/VENT/HOLD a la posición VENT .</li>
	<li>Con cuidado, con pinzas estériles, retire cualquier residuo del disco de ruptura presente en la superficie de la placa y cubra la placa con su tapa.</li>
	<li>Repita el procedimiento para las cinco placas restantes, colocando un nuevo disco de ruptura y un macroportador en cada ronda.</li>
	<li>Al final, cierre la válvula principal del tanque de helio.</li>
	<li>Cierre la cámara y construya un vacío llevando el interruptor VAC/VENT/HOLD a la posición VAC . Libere el sistema de cualquier presión de helio presionando y soltando el interruptor FIRE varias veces. Repita con la puerta abierta.</li>
	<li>Apague la bomba de vacío y el equipo de bombardeo.</li>
	<li>Limpie el sistema de suministro con 70% de EtOH. Lave los soportes del macroportador con una solución SDS al 0,1%; enjuague con agua destilada estéril y 100% EtOH.</li>
</ol>6. Selección de colonias de rho sintéticas
<ol><li>Incubar las placas de bombardeo durante 5-7 noches a 30 °C. NOTA: Es importante revisar las placas diariamente para ver si están contaminadas. Si es necesario, la región contaminada se puede cortar con una espátula estéril para evitar una mayor contaminación.</li>
	<li>Inocular la cepa de prueba del tipo de apareamiento opuesto en 2 mL de medio YPD durante la noche (vea el ejemplo específico en la Figura 2D, E).</li>
	<li>Inocular 150 μL del cultivo de cepa del probador en una placa YPD. Con un mango de vidrio estéril, extienda el probador de manera uniforme sobre la superficie de la placa. Deje que el plato se seque durante al menos 5 minutos.</li>
	<li>Haz réplicas de las placas de bombardeo usando almohadillas de terciopelo y un sello de réplica.<ol><li>Se replica en una placa de medio de abandono correspondiente al marcador de auxotrofia plasmídica 2 μ transformado. El crecimiento requiere una incubación nocturna a 30 °C. Después, conservar a 4 °C hasta su nuevo uso. Esta placa es la placa maestra.</li>
		<li>Replique en la placa YPD que contiene el césped del probador del paso 6.3. Incubar a 30 °C durante dos noches. Posteriormente, replicar esta placa en el medio selectivo para detectar la presencia del gen mitocondrial de interés, por ejemplo, un medio respiratorio o un medio que carezca de arginina, e incubar durante la noche a 30 °C. Solo las células que albergaban el plásmido bacteriano sintético en las mitocondrias crecerán en el medio selectivo después de aparearse con la cepa de prueba.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifique en la placa maestra (paso 6.4.1) las colonias correspondientes que crecieron en el paso 6.4.2. NOTA: Dado que la placa de bombardeo (y, por lo tanto, la placa maestra) está llena de colonias transformantes, puede ser difícil identificar las colonias positivas observadas en la placa de acoplamiento del probador. Por esta razón, es muy recomendable dibujar un par de líneas pequeñas a cada lado de todas las placas con un rotulador permanente. Dibuja líneas similares en el anillo de la estampilla replicante. Estas líneas serán útiles para orientar y ubicar colonias positivas en la placa maestra (vea el ejemplo en la Figura 2D).</li>
	<li>Purifique las colonias positivas pasándolas de la placa maestra a una segunda placa de abandono selectivo, como en el paso 6.4.1. Incubar durante dos noches a 30 °C. NOTA: Es esencial que el rayado permita el crecimiento de colonias individuales para asegurar una cepa pura.</li>
	<li>Repita el proceso de selección (pasos 6.2-6.5) para confirmar la presencia del plásmido bacteriano en las mitocondrias. NOTA: Por lo general, este proceso se puede repetir dos veces más para seleccionar cepas sintéticas estables.</li>
	<li>Una vez que la cepa sintética mantiene de manera estable el ADN plasmídico en las mitocondrias, seleccione de 3 a 5 colonias positivas diferentes e inocule en 2 mL de YPD. Utilice este cultivo para preparar un stock criovial (mezclando 600 μL de cultivo y 600 μL de glicerol al 50% para conservar a -70 °C) e inserte la secuencia de plásmido en el ADNmt de interés por citoducción (paso 6.7). NOTA: Dado que no hay presión selectiva para mantener el plásmido transformado en las mitocondrias a partir de la cepa sintética, el plásmido puede perderse fácilmente. Por lo tanto, recomendamos realizar la citoducción lo antes posible.</li>
</ol>7. Integración de la construcción presente en la cepa sintética en el sitio objetivo en el genoma mitocondrial por citoducción
<ol><li>Inocular dos tubos con 3 mL de medio YPD, uno con las células donantes (rho-cells sintéticos) y otro con las células aceptoras (celda de levadura donde se espera la construcción final). Incubar durante la noche a 30 °C.</li>
	<li>Mezclar 750 μL de la cepa donante y 250 μL de la cepa receptora en un microtubo estéril (proporción 3:1).</li>
	<li>Centrifugar la mezcla durante 1 min a 13.200 × g; Deseche el sobrenadante. Con una punta de pipeta de 1 ml con el extremo cortado, tome una gota del pellet de celda y colóquela en una placa YPD. Incubar a 30 °C durante 2-4 h. NOTA: Para evitar la contaminación cruzada, no coloque más de dos suspensiones celulares en una sola placa (vea el ejemplo en la Figura 4A).</li>
	<li>Tome una pequeña cantidad de la mezcla de células, vuelva a suspenderla en 15 μL de agua estéril en un portaobjetos y coloque un cubreobjetos. Compruebe bajo un microscopio óptico la presencia de shmoos con un objetivo de 40x o 100x; esta forma característica aparece cuando hay dos tipos de apareamiento presentes (Figura 3B).</li>
	<li>Si hay shmoos, vuelva a suspender una pequeña cantidad (~0,5 mm3) de la masa celular en 2 ml de medio YPD. Incubar durante 2 h a 30 °C en una rueda giratoria para permitir que los cigotos binucleares se recuperen.</li>
	<li>Agitar la mezcla y diluir 10 μL de la suspensión celular en 990 μL de agua estéril (dilución 1:100). Utilice perlas de vidrio o un mango de vidrio estéril para esparcir 100 μL de la dilución celular en un medio de caída donde solo crece la cepa aceptora (y los diploides esporádicos). Incubar durante 2-3 noches a 30 °C.</li>
	<li>Replicar las colonias resultantes en los medios selectivos necesarios como se explica en la introducción (etapa 4; ver Figura 4C para un ejemplo específico).</li>
	<li>Después de la identificación de las colonias positivas, vuelva a colocarlas en el mismo medio selectivo para purificar la cepa haploide que lleva el ADNmt de interés.</li>
	<li>Seleccione al menos dos colonias positivas y cultívelas en 2 mL de medio YPD a 30 °C durante la noche. Haga una copia de seguridad criogénica mezclando 600 μL de glicerol al 50% con 600 μL del cultivo saturado de YPD. Conservar a -70 °C.</li>
	<li>Aislar el ADN de las cepas resultantes 31,32. Amplificar la región deseada por PCR y secuenciar para confirmar la presencia de la mutación mitocondrial. NOTA: Cada colonia positiva es una réplica técnica que debe ser confirmada de forma independiente para asegurar la secuencia correcta en el genoma mitocondrial.</li>
</ol>

Transformación biolística de mitocondrias de levadura para análisis mutagenético

<ol><li>Bonnefoy, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+mutated+initiation+codons+in+the+mitochondrial+COX2+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae+fused+to+the+reporter+gene+ARG8m+reveals+lack+of+downstream+reinitiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation.</a> Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).</li>
<li>Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cox2p+of+yeast+cytochrome+oxidase+assembles+as+a+stand-alone+subunit+with+the+Cox1p+and+Cox3p+modules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules.</a> J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).</li>
<li>Flores-Mireles, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochrome+b+carboxyl+terminal+region+is+necessary+for+mitochondrial+complex+III+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly.</a> Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).</li>
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<li>Rak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+lacking+the+mitochondrial+gene+encoding+the+ATP+synthase+subunit+6+exhibit+a+selective+loss+of+complex+IV+and+unusual+mitochondrial+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology.</a> J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).</li>
<li>Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mss51p+promotes+mitochondrial+Cox1p+synthesis+and+interacts+with+newly+synthesized+Cox1p%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p.</a> EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).</li>
<li>Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mitochondrially+synthesized+Saccharomyces+cerevisiae+Cox2p+and+Cox3p+depends+on+targeting+information+in+untranslated+portions+of+their+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs.</a> EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).</li>
<li>Saracco, S. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cox18p+is+required+for+export+of+the+mitochondrially+encoded+Saccharomyces+cerevisiae+Cox2p+C-tail+and+interacts+with+Pnt1p+and+Mss2p+in+the+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane.</a> Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).</li>
<li>McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+assembly+intermediates+containing+subunit+1+of+yeast+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase.</a> J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).</li>
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</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

El presente trabajo describe cómo transformar con éxito las mitocondrias de la levadura S. cerevisiae . El proceso, desde el bombardeo de microproyectiles a alta velocidad hasta la purificación de la cepa de levadura prevista, dura ~ 8-12 semanas, dependiendo de cuántas rondas de purificación de la cepa sintética sean necesarias. Algunos de los pasos críticos del método son los siguientes. En primer lugar, cuanto más grandes sean las regiones flanqueantes añadidas alrededor del sitio de la mutación en la construcción del gen mitocondrial, mayor será la probabilidad de una integración exitosa de la mutación objetivo. El tamaño mínimo de las regiones flanqueantes es de ~100 nt; Sin embargo, se recomienda encarecidamente el uso de más de 500 NT a cada lado de la mutación. En segundo lugar, al seleccionar las colonias rho sintéticas después de la transformación, se recomienda que no se realicen más de 3-4 rondas de purificación; De lo contrario, existe un alto riesgo de que eventualmente se pierda la construcción mitocondrial, ya que no hay presión selectiva para mantener el plásmido en las mitocondrias. En tercer lugar, para evitar dañar al usuario o al equipo, debe leer detenidamente el manual de la máquina de bombardeo antes de iniciar el procedimiento. Este equipo es delicado y utiliza alta presión y vacío.
Una limitación de este procedimiento es que, hasta el momento, solo la levadura y el alga verde C. reinhardtii son candidatas a transformar las mitocondrias con este método. Sería relevante si pudiéramos introducir mutaciones dirigidas por sitios en el genoma mitocondrial de otros organismos. Otra limitación es que es difícil transformar muchos constructos diferentes en la misma sesión. Se recomienda realizar seis transformaciones para cada construcción, cada una de las cuales debe ser probada, seleccionada y purificada. Esto da como resultado más de 50 placas de medios solo para obtener colonias puras de rho- de una sola mutación mitocondrial.
A pesar de estas limitaciones, la capacidad de manipular el genoma mitocondrial de la levadura ha contribuido significativamente a la comprensión de muchas vías de la biogénesis de los complejos respiratorios. Este enfoque se puede utilizar para introducir genes reporteros para monitorear y cuantificar la traducción mitocondrial 1,7,36,37, interrumpir los genes mitocondriales 38, identificar chaperonas de ensamblaje de complejos respiratorios39, comprender mejor los mecanismos de traducción y ensamblaje mitocondrial acoplado 7,11,12,36y buscar supresores al seguir la expresión de un gen mitocondrial mutado40. Hasta ahora, aunque ciertos enfoques para manipular el genoma mitocondrial en mamíferos se han reportado anteriormente41, no existe un método generalizado para transformar el ADN mitocondrial para estos organismos.

<table><tbody><tr><td>Puntas de pipeta de 1 mL</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Microtubo</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L puntas de pipeta</td><td>Axygen</td><td>T-10-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tubo de fondo cónico&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>SCT-25ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; Puntas de pipeta L</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo de fondo cónico</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>AfiII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>SeaKem</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>OHAUS</td><td>ARA520</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>TOMY</td><td>ES-315</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>BD 211677</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soporte de macroportadores biolisíticos&nbsp;</td><td>Quemador Bunsen BIO-RAD</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>89038-528</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ADE</td><td>Para medio</td><td>DCS0049</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ARG</td><td>Para medio</td><td>DCS0059</td><td></td></tr><tr><td>CSM -LEU</td><td>para medio</td><td>DCS0099</td><td></td></tr><tr><td>CSM -URA</td><td>Para medio</td><td></td><td></td>DCS0169</tr><tr><td>Matraz de vidrio</td><td>para cultivo KIMAX KIMBLE</td><td>25615</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidrio</td><td>para cultivo Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>BD</td><td>215520</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>JT Baker&nbsp;</td><td>9000</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Millipore</td><td>620006</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de vidrio</td><td>Sigma</td><td>Z265926</td><td></td></tr><tr><td>Mango de vidrio</td><td>Sigma</td><td>S4647</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>JT BAKER</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de helio grado 5 (99.99 %)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HSTaq&nbsp; Kit</td><td>PCR Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>022620100</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>New Brunswick scientific</td><td>NB-G25</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000/He TM Sistema de suministro de partículas biolísticas</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (100X10)</td><td>BD</td><td>252777</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Formedium</td><td>RAF03</td><td></td></tr><tr><td>Replica plater</td><td>Scienceware</td><td>Z363391</td><td></td></tr><tr><td>Discos de ruptura 1350 Psi</td><td>BIO-RAD</td><td>1652330</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de cultivo</td><td></td> de tejidos <td>Microportadores</td> de tungsteno Thermo Scientific 88882015 <td></td></tr><tr><td>M10</td><td>BIO-RAD</td><td>1652266</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío de 100L / min de capacidad</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de terciopelo</td><td>Bel-Art</td><td>H37848-0002</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice&nbsp;</td><td>Scientifc Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Barra aplicadora de madera</td><td>PROMA 1820060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Levadura Base nitrogenada sin aminoácidos</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr></tbody></table>

transformación mitocondrial en baker

Mitochondrial Transformation in Baker&#39;s Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly

La levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae se ha utilizado ampliamente para comprender la biología mitocondrial durante décadas. Este modelo ha proporcionado conocimiento sobre las vías mitocondriales esenciales y conservadas entre los eucariotas y las vías específicas de hongos o levaduras. Una de las muchas habilidades de S. cerevisiae es la capacidad de manipular el genoma mitocondrial, que hasta ahora solo es posible en S. cerevisiae y el alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. La transformación biolística de las mitocondrias de levadura nos permite introducir mutaciones dirigidas al sitio, hacer reordenamientos genéticos e introducir reporteros. Estos enfoques se utilizan principalmente para comprender los mecanismos de dos procesos altamente coordinados en las mitocondrias: la traducción por mitoribosomas y el ensamblaje de complejos respiratorios y ATP sintasa. Sin embargo, la transformación mitocondrial puede utilizarse potencialmente para estudiar otras vías. En el presente trabajo, mostramos cómo transformar las mitocondrias de levadura mediante bombardeo de microproyectiles a alta velocidad, seleccionar y purificar el transformador deseado e introducir la mutación deseada en el genoma mitocondrial.

Este trabajo explica cómo transformar las mitocondrias de la levadura utilizando un método biolístico. También mostramos cómo seleccionar y purificar los transformantes y cómo introducir la mutación deseada en la posición objetivo dentro del genoma mitocondrial.

Transformación mitocondrial en Baker

Baker&#180;s yeast Saccharomyces cerevisiae has been widely used to understand mitochondrial biology for decades. This model has provided knowledge about ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

La respiración mitocondrial en células enteras de levadura es un indicador valioso de la bioenergética celular. En este trabajo se presenta un protocolo para cuantificar este fenotipo aplicable a diferentes especies de levaduras.

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Una metodología de alto rendimiento, la producción de protoplastos de tabaco automatizado y se describe la transformación. El sistema robótico permite la expresión de genes masivamente paralelo y el descubrimiento en el sistema modelo BY-2 que debe ser traducible a los cultivos no modelo.

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