Name: Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Aprende la perfusión hepática de rata con collagenasa para aislar hepatocitos primarios viables. Este método optimizado permite cultivar organoides 3D funcionales a largo plazo para estudios hepáticos in vitro.

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<li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01- Inhibidor de ALK5 IV</td><td>doble hélice</td><td>&nbsp; T3031</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Sistema de detección de PCR en tiempo real&nbsp;</td><td>&nbsp; Kit de imagen Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Twin Helix</td><td>T2310</td><td></td></tr><tr><td>Click EdU Alexa 488</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C10499</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno, Tipo I, solución de cola de rata</td><td>Merck</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona&nbsp;</td><td>Merck</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck</td><td>&nbsp; E9644</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>GELTREX LDEV FREE RGF BME</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sódica 25000 UI/5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HGF</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 100-39H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solución de insulina-transferrina-selenio 100x&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>solución de L-glutamina</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp; 17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Medio de perfusión hepática</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>suplemento de N2</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Merck</td><td>&nbsp; N-0636</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Merck</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Aurogene</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer 1X</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0964,9050</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina 100x</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296039A</td> Bomba peristáltica <td></td></tr><tr><td></td><td>Ismatec&comercio; &nbsp;</td><td>MS-4/12 Reglo Bomba Digital TNFa</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo TRI</td><td>Merck</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Tubo&nbsp;</td><td>Ismatec&comercio; &nbsp;</td><td>&nbsp; ID.2,79mm</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E Medium, sin glutamina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Twin Helix</td><td>T1725</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3d de última generación

Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture

Al final de los procedimientos de configuración (paso 6.13), obtuvimos un rendimiento celular de hasta 1 x 108 células por aislamiento del hígado de aproximadamente 300 g de una rata. La viabilidad celular entre el 78% y el 97% se estableció mediante el conteo con azul de tripano.
Como ya se ha descrito en estudios previos 1,18,19, los hepatocitos primarios en cultivo pierden su morfología, funciones hepáticas específicas y mueren a los pocos días.
Es bien sabido en la literatura23,24 que los hepatocitos adultos primarios pierden rápidamente la morfología cuboidal-hexagonal, adquieren una forma "similar a la de un fibroblasto" en pocos días y mueren. La Figura 1 muestra las distintas fases: a las 4 h después de la siembra en una placa recubierta de colágeno, los hepatocitos se adhieren a la superficie, se extienden en una monocapa típica que muestra una morfología cuboidal, los bordes de las células están definidos, las uniones entre las células son lineales y la superficie de las células parece lisa (Figura 1A). En el día 1, los hepatocitos primarios adquieren su forma hexagonal típica y las gotas de lípidos se hacen visibles (Figura 1B). En los días 2-3, las gotas de lípidos aumentan (Figura 1C-1D), mientras que en los días 4-5, las células acumulan fibras de estrés de actina (Figura 1E-F). También evaluamos el porcentaje de células viables en cultivo primario 2D desde el día 1 hasta el día 5 y lo comparamos con la viabilidad antes de la siembra en el día 0 (Figura 2). Es posible observar una reducción drástica de la viabilidad ya en los primeros días de cultivo, alcanzando el 49,5% (DE 12,7) el día 1, que baja al 45,2% (DE 18,2) el día 2 y al 33,5% (DE 0,77) el día 3. El porcentaje de células viables en el día 4 ya es del 16,9% (DE 5,4), mientras que en el día 5 alcanza el 9,1% (DE 0,38). Por lo tanto, es evidente que la pérdida de morfología acompaña a una rápida muerte celular progresiva de los hepatocitos adultos en cultivo 2D.
Los hepatocitos aislados, antes de la siembra (día 0), mostraron una alta expresión de ARNm de genes marcadores hepáticos (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2) evaluados por RT-qPCR (Figura 3). Todos los genes analizados muestran una disminución de la expresión dependiente del tiempo de cultivo ya en el día 1 en cultivo. Los niveles de expresión de ARNm ponen de manifiesto la pérdida funcional y de viabilidad de los hepatocitos primarios durante el tiempo.
Los hepatocitos aislados se sembraron en gotas de matriz 3D y se hizo un seguimiento de las estructuras celulares de organoides en 3D a lo largo del tiempo. En el día 1 del cultivo, los hepatocitos individuales se suspenden en las gotas de la matriz (Figura 4A). La concentración celular se mantiene intencionalmente baja para proporcionar a los hepatocitos un amplio espacio para crecer. Además, esto nos permite seguir visualmente el crecimiento de los organoides. Los hepatocitos primarios mostraron división celular en los primeros días de cultivo (Figura 4C). Además, mientras que en el día 0 se midieron 30 μm de Hep-Orgs, en el día 2 las Hep-Orgs casi duplicaron sus dimensiones, lo que subraya el crecimiento de tamaño que se mantuvo hasta el día 15 (33,08 μm el día 1; 64,86 μm el día 2; 45,06 μm el día 5; 55,19 μm el día 7; 51,93 μm el día 10; 62,90 μm el Fay 15). En cuanto a la forma de las Hep-Orgs, mientras que el día 1 eran redondas, en los días siguientes alcanzaron la "forma de racimo de uvas" (típica de los organoides hepáticos).
Los hepatocitos sembrados en una matriz 3D permanecen vivos en cultivo durante semanas mostrando una viabilidad del 23% ±10% después de 15 días utilizando el ensayo de azul de tripán (Figura 4B, primera fila). Para validar la proliferación de Hep-Orgs en ratas, se realizó una prueba de EdU el día 15 (Figura 4D). Sin embargo, la tinción de Hoechst mostró un alto número de células individuales en lugar de Hep-Orgs, una actividad proliferativa de los hepatocitos (células verdes) estaba presente, incluso si la incorporación de EdU fue baja (9% ± 7%) (Figura 4B, segunda fila).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig01.jpg"> Figura 1: Cultivo 2D de hepatocitos primarios en placas recubiertas de colágeno a lo largo del tiempo. Las imágenes se tomaron con un aumento de 20x con (A) microscopía de contraste de fase a las 4 horas después de la colocación de la placa, (B) Día 1, (C) Día 2, (D) Día 3, (E) Día 4, (F) Día 5. En cada imagen se muestra una barra de escala correspondiente a 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig02.jpg"> Figura 2: Células primarias viables en cultivo 2D en placas recubiertas de colágeno. El gráfico muestra el porcentaje de células viables desde el día 1 hasta el día 5, en comparación con las células viables sembradas en el día 0, considerado como el 100%. Los resultados se informan como réplicas individuales, promedio y SD de 3 experimentos diferentes (* valor p ≤ 0.05; ** valor p ≤ 0.005). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig03.jpg"> Figura 3: Expresión de ARNm de marcadores hepáticos medida por RT-qPCR en hepatocitos primarios. Los resultados se normalizaron en β-actina y/o GAPDH (genes de limpieza) y se expresan en relación con los hepatocitos primarios recolectados antes de la siembra en el día 0, considerado como 1. Los resultados se informan como promedio ± SD de, al menos, 3 experimentos diferentes (**+ valor p ≤ 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig04.jpg"> Figura 4: Cultivo 3D de hepatocitos en gotas de matriz a lo largo del tiempo. (A) Hepatocitos aislados sembrados en gotas de matriz para Hep-Orgs a largo plazo: en la imagen, las gotas de matriz son visibles en la superficie del pocillo (círculo rojo = una gota). (B) Porcentaje de células viables por azul de tripán y células proliferativas por EdU el día 15 antes del paso. La cuantificación de las células positivas para EdU se realizó mediante el software ImageJ2. Los resultados se informan en porcentaje como promedio±SD de, al menos, 3 experimentos diferentes. (C) Imágenes de contraste de fase del cultivo 3D de Hep-Orgs de rata en diferentes días de crecimiento en cultivo 3D: día 1, 2, 5, 7, 10, 15. Aumento de la imagen 20X. En cada imagen se muestra una barra de escala correspondiente a 50 μm. (D) Ensayo de incorporación de EdU de Hep-Orgs de rata el día 15. Aumento de la imagen 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Búferes y composición de medios. La tabla indica el nombre y los componentes (con su concentración final) de todos los tampones y los medios de celda utilizados en el protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08_Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Lista de cebadores para ratas. La tabla muestra la lista de cebadores utilizados para los experimentos de RT-qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08%20Table%202.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un nuevo método para obtener los macrófagos de los cultivos primarios de células de hígado de rata se describe. Este método utiliza la proliferación de los macrófagos en la cultura, seguida de temblor en frascos de cultivo y la purificación por el apego selectivo para platos de plástico. Esta técnica proporciona de manera eficiente los macrófagos del hígado sin necesidad de equipo y habilidades complejas.

Un método simple y eficaz para aislar los macrófagos de la Mezcla de cultivos primarios de células de hígado en adultos

El estudio del hígado de las células endoteliales sinusoidales (segundos) se debe realizar con las células primarias procedentes de los animales que no existen líneas celulares. Este método se basa en la digestión del hígado y centrifugación diferencial para la purificación de la SEC para el cultivo posterior y experimentar.

La endocitosis en vivo de hígado seguido por la purificación de las células hepáticas de la perfusión del hígado

Hepatocitos primarios proporcionará una herramienta valiosa para evaluar las funciones bioquímicas, moleculares y metabólicos en un sistema experimental fisiológicamente relevantes. Se describe un protocolo fiable para la rata en la perfusión del hígado in situ, que constantemente genera hepatocitos viables hasta to1.0 ×...

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Se describe un procedimiento de perfusión con colagenasa de dos etapas modificado para el aislamiento de hepatocitos humanos. Este método también se puede aplicar a otros hígados de mamíferos. Los hepatocitos aislados están disponibles con un alto rendimiento y la viabilidad, por lo que un modelo adecuado para la investigación científica en áreas como la regeneración hepática, farmacocinética y toxicología.

El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

Se describe una técnica para aislar hepatocitos humanos y células hepáticas no parenquimatosas del mismo donante. Los diferentes tipos de células hepáticas constituyen la base para los modelos funcionales de hígado y la ingeniería de tejidos. Este nuevo método tiene como objetivo aislar células hepáticas en un alto rendimiento y viabilidad.

Protocolo para el aislamiento de hepatocitos primarios humanos y la correspondiente principales poblaciones de células hepáticas no parenquimatosas

El objetivo de este protocolo es obtener alta viabilidad y alto rendimiento de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado. Esto se logra por perfundiendo el hígado con una solución de colagenasa tipo IV a través de la vena porta, seguida de centrifugación diferencial para obtener hepatocitos y células endoteliales sinusoidales.

Purificación de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado de ratón de perfusión

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento de hepatocitos de ratón de hígados de ratón adultos utilizando una técnica de perfusión de colagenasa modificada. También se describe el cultivo a largo plazo de hepatocitos en un ajuste de sándwich de colágeno 3D, así como la inmunoetiquetado de los componentes citoesqueléticos para estudiar la formación canalicular biliar y su respuesta al tratamiento.

Aislamiento y cultivo de sándwich de colágeno 3D de hepatocitos primarios de ratón para estudiar el papel del citoesqueleto en la formación canalicular de bilis en Vitro

Los hepatocitos primarios son una herramienta valiosa para estudiar la respuesta hepática y el metabolismo in vitro. Utilizando reactivos disponibles comercialmente, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón.

Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

Este protocolo detalla el uso de un catéter intravenoso especial, tubos desechables estériles estandarizados, control de temperatura complementado con monitoreo en tiempo real y un sistema de alarma para el procedimiento de perfusión de colagenasa de dos pasos para mejorar la consistencia en la viabilidad, el rendimiento y la funcionalidad de los hepatocitos primarios aislados de ratas.

Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

Se estableció un sistema de cultivo de organoides 3D ex vitro a largo plazo a partir de hepatocitos de ratón. Estos organoides pueden ser atravesados y manipulados genéticamente por infección por lentivirus de construcción shRNA/ectópica, transfección de siRNA e ingeniería CRISPR-Cas9.

Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

Aquí, presentamos un método robusto para la perfusión in situ del hígado de ratón para estudiar la regulación aguda y directa del metabolismo hepático sin alterar la arquitectura hepática pero en ausencia de factores extrahepáticos.

Producción hepática de glucosa, ureagénesis y lipólisis cuantificadas mediante el modelo de hígado de ratón perfundido

Aprende la perfusión hepática de rata con collagenasa para aislar hepatocitos primarios viables. Este método optimizado permite cultivar organoides 3D funcionales a largo plazo para estudios hepáticos in vitro.

Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación (Video) | JoVE Journal

Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación

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