Name: Aislamiento de células inmunitarias del cerebro y el cráneo de ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprenda a aislar células inmunitarias del cerebro y la médula ósea del cráneo en ratones tras isquemia cerebral. Estos protocolos preservan perfiles transcriptómicos y proteómicos para avanzar en terapias neuroprotectoras.

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Agradecemos a Kathy Gage por su excelente contribución editorial. Las figuras de ilustración fueron creadas con BioRender.com. Este estudio contó con el apoyo financiero del Departamento de Anestesiología (Centro Médico de la Universidad de Duke) y subvenciones de los NIH NS099590, HL157354 y NS127163.

El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Duke (IACUC). En el presente estudio se utilizaron ratones machos C57Bl/6 (3-4 meses de edad; 22-28 g). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Suspensión unicelular del cerebro de ratón
NOTA: La Figura 1 ilustra la descripción general del protocolo de aislamiento de células cerebrales.
<ol><li>Anestesia, intubar y asegurar el ratón, como se demostró anteriormente11.</li>
	<li>Haz una incisión en la parte superior del abdomen a través de la piel y las capas musculares subyacentes, y corta con cuidado el diafragma y las costillas para crear la abertura en la cavidad torácica.</li>
	<li>Llene una jeringa de 30 ml con PBS frío y conéctela a la aguja de perfusión roma a través de un tubo de silicona. Inserte con cuidado la aguja de perfusión en el ventrículo izquierdo.</li>
	<li>Realice una pequeña incisión en la aurícula derecha para permitir el drenaje de la sangre y luego perfunda12 el ratón a un caudal de ~ 10 mL/min durante 3-4 min. NOTA: Para mejorar la eliminación de sangre en el cerebro, se puede considerar aumentar el volumen de la solución de perfusión y agregar heparina.</li>
	<li>Decapita al ratón y haz una incisión en la línea media a través de la piel en la parte superior de la cabeza para exponer el cráneo.</li>
	<li>Raspe con cuidado cualquier tejido conectivo que cubra el cráneo con pinzas romas.</li>
	<li>Use tijeras de disección afiladas para cortar cuidadosamente las suturas del cráneo a lo largo de la línea media y en ambos lados, creando un colgajo.</li>
	<li>Levanta suavemente el colgajo del cráneo para exponer el cerebro y usa pinzas romas para extraer cuidadosamente el cerebro de la cavidad craneal.</li>
	<li>Sumerja el cerebro en una placa de Petri que contenga PBS helado y elimine los tejidos meningales restantes. NOTA: Para preservar mejor la viabilidad celular, se recomienda realizar todos los pasos siguientes en hielo o a 4 °C.</li>
	<li>Coloque el cerebro en un homogeneizador Dounce de vidrio preenfriado de 15 mL que contiene 20 mL (cerebro entero) o 12 mL (medio cerebro) de tampón HBSS viejo como hielo.</li>
	<li>Use el mortero suelto Dounce para disociar suave y lentamente el tejido cerebral con alrededor de 100-120 golpes en hielo. NOTA: Este paso es fundamental para obtener una gran cantidad de células cerebrales sanas. Este paso dura aproximadamente 10 min. Detenga la homogeneización cuando no haya trozos sustanciales de tejido cerebral visibles en la suspensión. En este punto, el mortero puede moverse fácilmente hacia abajo sin ninguna fuerza.</li>
	<li>Filtre la suspensión de tejido cerebral resultante a través de un filtro de células de 70 μm en un tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
	<li>Enjuague el tubo Dounce con 5 mL de HBSS y proceda con la filtración para maximizar la recolección de células.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión de tejido filtrado a 550 x g durante 6 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire el sobrenadante con un aspirador de vacío y vuelva a suspender el pellet de células en 1 ml de solución de gradiente de densidad isotónica al 30%. NOTA: Para hacer 15 mL de solución de gradiente de densidad isotónica al 30%, mezcle 4.5 mL de medio de gradiente de densidad 100% de stock, 1.5 mL de PBS al 10× y 9 mL de ddH2O.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mL y agregue 9 mL (cerebro completo) o 6 mL (medio cerebro) de solución de gradiente de densidad al 30%.</li>
	<li>Invierta suavemente el tubo para asegurar una mezcla completa.</li>
	<li>Centrifugar inmediatamente el tubo a 845 x g con la aceleración y el freno ajustados en el nivel 3, durante 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire suavemente el tubo de la centrífuga sin agitar y aspire con cuidado la capa superior de mielina con una punta de 1 ml conectada al vacío. NOTA: Es de vital importancia no alterar esta capa. Cualquier mielina restante puede afectar negativamente a la salud celular y comprometer los análisis posteriores.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante, dejando atrás 1-2 mL, y vuelva a suspender el pellet celular con un mínimo de 10 mL de HBSS frío.</li>
	<li>Centrifugar a 550 x g durante 6 min a 4 °C.</li>
	<li>Lavar una vez más con un mínimo de 7 mL de HBSS frío.</li>
	<li>Extraer la mayor cantidad posible de sobrenadante y volver a suspender las células para el análisis de citometría de flujo utilizando 100-200 μL de tampón de citometría de flujo. NOTA: El tampón FACS de citometría de flujo utilizado para este estudio contiene 0,5% de BSA y 2 mM de EDTA en 1× PBS. Se recomienda una placa inferior en V de 96 pocillos para la tinción celular para minimizar la pérdida de células durante los pasos de lavado.</li>
	<li>Realizar análisis de citometría de flujo utilizando un protocolo estándar establecido en laboratorios individuales13.<ol><li>Brevemente, mezcle 80 μL de suspensión celular con 20 μL de la mezcla de anticuerpos en una placa inferior en V de 96 pocillos e incube durante 25 minutos a 4 °C.</li>
		<li>Lavar con 200 μL de tampón FACS y luego resuspender las células con 100 μL de HBSS más reactivo de tinción de viabilidad celular.</li>
		<li>Después de una incubación de 15 minutos a 4 °C, lavar con tampón FACS y resuspender las células en 200 μL de tampón FACS para el análisis de citometría de flujo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación de suspensión unicelular de médula ósea a partir de calvaria de ratón
NOTA: La Figura 2 muestra la descripción general del procedimiento de aislamiento de médula ósea del cráneo.
<ol><li>Perfunda el ratón como se describe en el paso 1.4.</li>
	<li>Decapita al ratón y haz una incisión en la piel de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo.</li>
	<li>Corte a través del cráneo, comenzando desde el foramen magnum y avanzando a lo largo de los lados laterales de la calvaria con tijeras afiladas. Luego, levante y retire la calvaria. NOTA: El cerebro se puede extraer del mismo ratón y procesar mediante el paso 1, lo que permite el análisis de células inmunitarias tanto del cerebro como de la médula ósea del cráneo.</li>
	<li>Retire con cuidado la duramadre del cráneo bajo un microscopio de disección con pinzas romas. NOTA: Es más fácil comenzar en los bordes del hueso occipital, desprenderse lentamente y progresar constantemente hacia el área frontal, trabajando hacia adentro.</li>
	<li>Coloque la calvaria en el plato sobre hielo y use una pipeta de 1 mL para enjuagar la calvaria, asegurando la eliminación de los residuos de sangre de su superficie.</li>
	<li>Transfiera el calvario a un plato nuevo con PBS fresco y frío suficiente para sumergir el calvario.</li>
	<li>Use tijeras estériles para cortar la pantorrilla en fragmentos de aproximadamente 3 mm x 3 mm en PBS frío. NOTA: Los métodos de cultivo pueden afectar la eficiencia de la extracción de médula ósea de calvaria. Se recomienda utilizar el mismo método de cultivo para minimizar la variabilidad. También es importante cortar las suturas. La figura 2B ilustra un enfoque.</li>
	<li>Haga un agujero en el fondo de un tubo de microcentrífuga de 500 μL con una aguja de 18 G.</li>
	<li>Inserte este tubo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 20 μL de PBS frío.</li>
	<li>Transfiera los fragmentos de calvaria al tubo de 500 μL. NOTA: Los fragmentos óseos deben empaquetarse sin apretar para aumentar la eficiencia de la extracción.</li>
	<li>Centrífuga a 10.000 x g durante 30 s a 4 °C. NOTA: Para maximizar la recuperación celular, use una aguja de 18 G para agitar suavemente los fragmentos de calvaria y repita este paso 1-2 veces más.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células de médula ósea de calvaria recogidas en 500 μL de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube a temperatura ambiente durante 30 s.</li>
	<li>Transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 4 mL de PBS frío.</li>
	<li>Centrifugar a 400 x g durante 6 min a 4 °C.</li>
	<li>Lavar una vez más con 5 mL de PBS frío.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet de celda en un tampón adecuado. Para la citometría de flujo, normalmente utilizamos 500 μL de tampón FACS.</li>
	<li>Para el análisis de citometría de flujo, realice el recuento de células y utilice aproximadamente 1 x 106 células para la tinción de anticuerpos. NOTA: Asegúrese de incluir el paso de bloqueo Fc antes de la tinción de anticuerpos13.</li>
</ol>

Obtención de suspensiones unicelulares de la médula ósea del cerebro y el cráneo murinos

<ol><li>Bohr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glymphatic+system%3A+Current+understanding+and+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">The glymphatic system: Current understanding and modeling.</a> iScience. 25 (9), 104987(2022).</li>
<li>Jiang-Xie, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+dynamics+direct+cerebrospinal+fluid+perfusion+and+brain+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance.</a> Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).</li>
<li>Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+compartments+at+the+brain%27s+borders+in+health+and+neurovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Immune compartments at the brain's borders in health and neurovascular diseases.</a> Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).</li>
<li>Herisson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+vascular+channels+connect+skull+bone+marrow+and+the+brain+surface+enabling+myeloid+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration.</a> Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).</li>
<li>Mazzitelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skull+bone+marrow+channels+as+immune+gateways+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system.</a> Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).</li>
<li>Cugurra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skull+and+vertebral+bone+marrow+are+myeloid+cell+reservoirs+for+the+meninges+and+CNS+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma.</a> Science. 373 (6553), 7844(2021).</li>
<li>Brioschi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+meningeal+b+cells+reveals+a+lymphopoietic+niche+at+the+CNS+borders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders.</a> Science. 373 (6553), 9277(2021).</li>
<li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+direct+connections+between+the+dura+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of direct connections between the dura and the brain.</a> Nature. 627, 165-173 (2024).</li>
<li>Mazzitelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+regulates+skull+bone+marrow+niches+via+direct+access+through+dural+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels.</a> Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).</li>
<li>Pulous, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+can+exit+into+the+skull+bone+marrow+and+instruct+cranial+hematopoiesis+in+mice+with+bacterial+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis.</a> Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cardiac+arrest+model+for+brain+imaging+and+brain+physiology+monitoring+during+ischemia+and+resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation.</a> J Vis Exp. (194), e65340(2023).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+novel+mouse+model+of+asphyxial+cardiac+arrest+revealed+severely+impaired+lymphopoiesis+after+resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation.</a> J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142(2021).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+of+the+immune+cell+landscape+in+the+aged+mouse+brain+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke.</a> J Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).</li>
<li>Wang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perk+%28protein+kinase+RNA-like+er+kinase%29+branch+of+the+unfolded+protein+response+confers+neuroprotection+in+ischemic+stroke+by+suppressing+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis.</a> Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).</li>
<li>Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+from+the+ischemic+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain.</a> J Vis Exp. (108), e53658(2016).</li>
<li>Srakocic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+practical+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+microglia+from+the+healthy+adult+mouse+brain%3A+Systematic+review+and+isolation+methods%27+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).</li>
<li>Disano, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+central+nervous+system+tissues+and+associated+meninges+for+the+downstream+analysis+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells.</a> J Vis Exp. (159), e61166(2020).</li>
<li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).</li>
<li>Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+analysis+of+mouse+neutrophil+netosis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100948(2021).</li>
<li>Su, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+immunity+and+neurological+diseases%3A+New+approaches%2C+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights.</a> J Neuroinflammation. 20 (1), 125(2023).</li>
<li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation+of+neonatal+and+adult+mouse+dura+leukocytes+for+flow+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102272(2023).</li>
<li>Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+immunohistochemistry+of+the+mouse+dural+meninges+for+immunological+and+virological+assessments%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102119(2023).</li>
<li>Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+whole+mount+preparation+and+characterization+of+neural+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50(2018).</li>
</ol>

Aquí, se presentan dos protocolos simples pero efectivos para aislar las células inmunitarias del cerebro y la médula ósea del cráneo. Estos protocolos pueden producir de forma fiable una gran cantidad de células inmunitarias viables que pueden ser adecuadas para diversas aplicaciones posteriores, en particular para la citometría de flujo.
Para estudiar la neuroinflamación en diversos trastornos cerebrales, se han establecido muchos protocolos para la preparación de células inmunitarias del cerebro y se han utilizado en diferentes laboratorios 15,16,17. Los enfoques comunes implican la disociación celular basada en enzimas seguida de la separación en gradiente. Por lo general, en estos protocolos, el tejido cerebral se pica y luego se incuba en una solución de digestión enzimática que contiene colagenasa y DNasa durante 30-60 minutos a 37 °C con una agitación suave. Después de la digestión, las células se someten a una disociación adicional utilizando un método mecánico como el pipeteo o la homogeneización de Dounce. Después de pasar a través de un filtro de células (por ejemplo, un filtro de 70 μm), las células se someten a una centrifugación en gradiente (a menudo una solución de gradiente de densidad del 30%/70%) para eliminar la mielina, los glóbulos rojos y los desechos y para enriquecer los leucocitos. Sin embargo, este enfoque requiere una incubación enzimática prolongada a 37 °C que puede alterar sustancialmente el transcriptoma y el proteoma de las células inmunitarias cerebrales. De hecho, una investigación sistemática sugirió que el enfoque enzimático introduce alteraciones profundas en el transcriptoma y el proteotipo de células cerebrales específicas18. Esto podría dar lugar a artefactos en análisis transcriptómicos posteriores, como scRNA-seq. Por el contrario, el protocolo reportado aquí utiliza un enfoque de disociación mecánica a temperaturas frías durante todo el procedimiento, suprimiendo así el metabolismo celular. Esto asegura una mejor preservación del estado transcripcional y proteómico, minimizando los posibles artefactos. Durante el desarrollo del protocolo, nos dimos cuenta de que el uso de un gran homogeneizador Dounce para homogeneizar el tejido cerebral es fundamental para lograr recuentos celulares más altos con una menor muerte celular. Es probable que durante la homogeneización de Dunce, la presencia masiva de matrices extracelulares, restos celulares y componentes citoplasmáticos sea tóxica para las células. El uso de una cantidad excesiva de tampón ayuda a diluir estas sustancias tóxicas y, por lo tanto, mitiga sus efectos nocivos, lo que conduce a una mejor viabilidad celular. Los datos de citometría de flujo confirmaron una tasa de viabilidad aproximada del 85% de las células inmunitarias preparadas con este protocolo. Además, es notable que la centrifugación con solo una solución de gradiente de densidad del 30% enriquece eficazmente las células inmunitarias del cerebro y elimina la mielina. Esto también puede reducir el costo de la preparación de las células.
Los estudios sobre las células inmunitarias en la médula ósea del cráneo aún son limitados. Un método comúnmente utilizado para aislar células del cráneo del ratón consiste en cortar el cráneo en pedazos pequeños y luego triturar mecánicamente los pedazos con un mortero. En el protocolo actual, se utiliza la centrifugación breve. Este método es una adaptación de un protocolo publicado para la preparación de médula ósea a partir de fémures y tibias19. Para estos huesos largos, solo es necesario cortar un extremo del hueso para recolectar la médula ósea por centrifugación. En el caso del cráneo, este paso se modifica cortándolo en varios trozos pequeños para abrir la cavidad de la médula. Se recomienda utilizar un patrón consistente para cortar el cráneo con el fin de obtener recuentos celulares reproducibles. Además, para maximizar la recuperación de las células de la médula ósea, las piezas del cráneo pueden someterse a 2-3 rondas de centrifugación con mezcla entre cada centrifugación.
Ambos protocolos tienen limitaciones. En primer lugar, el uso de la centrifugación en solución de gradiente de densidad al 30% puede no eliminar eficazmente los glóbulos rojos restantes en el cerebro, lo que puede ocurrir debido a una perfusión incompleta. Además, si la estructura de la mielina se modula bajo ciertas condiciones, una solución de gradiente de densidad del 30% puede no ser una concentración óptima para su eliminación. En este caso, es necesario establecer otra concentración de trabajo de la solución de gradiente de densidad. En segundo lugar, aunque el análisis de citometría de flujo indica una buena viabilidad celular de las células inmunitarias cerebrales utilizando el protocolo descrito, aún debe evaluarse para otras aplicaciones, como el análisis transcriptómico en el que se puede utilizar actinomicina D. En tercer lugar, la calvaria se utiliza para preparar la médula ósea del cráneo. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las células inmunitarias existen en muchas otras partes del cráneo. Por último, las meninges, especialmente la duramadre, albergan diversas células inmunitarias y desempeñan un papel en la homeostasis y la disfuncióncerebral. Para el análisis inmunológico de las meninges, se puede adoptar un protocolo publicado en otros lugares 17,21,22,23.
En resumen, se describen dos protocolos robustos para aislar células inmunitarias tanto del cerebro como del cráneo del ratón. Se espera que estos protocolos sean útiles para obtener una gran cantidad de células de alta calidad, adecuadas para diversas aplicaciones posteriores.

El cerebro, el eje central del sistema nervioso, está protegido por el cráneo. Debajo del cráneo hay tres capas de tejido conectivo conocido como meninges: la duramadre, la aracnoides y la piamadre. El líquido cefalorraquídeo (LCR) circula en el espacio subaracnoideo entre la aracnoidea y la piamadre, amortiguando el cerebro y también eliminando los desechos a través del sistema glinfático 1,2. En conjunto, esta arquitectura única proporciona un entorno seguro y de apoyo que mantiene la estabilidad del cerebro y lo protege de posibles lesiones.
Durante mucho tiempo se ha considerado que el cerebro es inmunoprivilegiado. Sin embargo, esta noción ha sido parcialmente abandonada ya que la creciente evidencia indica que, además de la microglía residente en el parénquima, los bordes del cerebro, incluyendo el plexo coroideo y las meninges, albergan una amplia gama de células inmunitarias3. Estas células desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis, la vigilancia de la salud del cerebro y el inicio de la respuesta inmunitaria a las lesiones cerebrales. En particular, los hallazgos recientes indican que el cráneo está involucrado en la inmunidad de las meninges y puede contribuir a la respuesta inmune en el cerebro después de una lesión. En 2018, Herisson et al. realizaron un descubrimiento seminal de los canales vasculares directos que unen la médula ósea del cráneo con las meninges, estableciendo así una ruta anatómica para la migración de leucocitos 4,5. Más tarde, Cugurra et al. demostraron que muchas células mieloides (por ejemplo, monocitos y neutrófilos) y células B en las meninges no se originan en la sangre6. Utilizando técnicas como el trasplante de colgajo óseo de calvaria y los regímenes de irradiación selectiva, los autores proporcionaron pruebas convincentes de que la médula ósea del cráneo sirve como fuente local de células mieloides en las meninges, así como del parénquima del SNC después de una lesión del SNC6. Además, otro estudio propuso que las células B meníngeas son suministradas constantemente por la médula ósea del cráneo7. Más recientemente, se ha identificado una nueva estructura, denominada salida del manguito aracnoideo (ECA), como una puerta de entrada directa entre la duramadre y el cerebro para el tráfico de células inmunitarias8.
Estos emocionantes hallazgos tienen implicaciones importantes para el origen de la infiltración de células inmunitarias en el cerebro lesionado (por ejemplo, después de un accidente cerebrovascular isquémico). Una gran cantidad de evidencia ha indicado que después de un accidente cerebrovascular, muchas células inmunitarias se infiltran en el cerebro, contribuyendo tanto al daño cerebral agudo como a la recuperación crónica del cerebro. La noción convencional es que estas células son leucocitos circulantes en la sangre que se infiltran en el cerebro, lo que se ve facilitado en gran medida por el daño de la barrera hematoencefálica inducido por un accidente cerebrovascular. Sin embargo, esta noción ha sido cuestionada. En un estudio, las células inmunitarias en el cráneo y la tibia de los ratones se etiquetaron de manera diferente, y a las 6 horas después del accidente cerebrovascular, se encontró una disminución significativamente mayor de neutrófilos y monocitos en el cráneo en comparación con el cráneo. la tibia y más neutrófilos derivados del cráneo estaban presentes en el cerebro isquémico. Estos datos sugieren que en la fase aguda del accidente cerebrovascular, los neutrófilos en el cerebro isquémico se originan principalmente en la médula ósea del cráneo4. Curiosamente, la peste porcina clásica puede guiar esta migración. De hecho, dos informes recientes demostraron que el LCR puede transmitir directamente señales de señalización desde el cerebro a la médula ósea del cráneo a través de los canales del cráneo, e instruir la migración celular y la hematopoyesis en la médula ósea del cráneo después de una lesión del SNC 9,10.
A la luz de estos hallazgos recientes, se ha vuelto importante analizar los cambios en las células inmunitarias tanto en el cerebro como en la médula ósea del cráneo, al estudiar la respuesta inmunitaria a los trastornos cerebrales. En este tipo de investigaciones, se necesita un número suficiente de células inmunitarias de alta calidad para los análisis posteriores, como la clasificación de células, el análisis de citometría de flujo y la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). Aquí, el objetivo general es presentar dos procedimientos optimizados para preparar suspensiones unicelulares a partir de tejido cerebral y médula ósea del cráneo. Es importante tener en cuenta que la calvaria (hueso frontal, hueso occipital y huesos parietales) del cráneo se utiliza normalmente para extraer la médula ósea, y esta médula ósea se conoce específicamente como médula ósea del cráneo a lo largo de este estudio.

<table><tbody><tr><td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>76332-066</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>76332-068</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>96-well V-bottom microplate&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1583</td><td></td></tr><tr><td>AURORA&nbsp; flow cytometer</td><td>Cytek bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-AF594</td><td>BioLegend</td><td>101254</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD19-BV785</td><td>BioLegend</td><td>115543</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD19-FITC</td><td>BioLegend</td><td>115506</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD3-APC</td><td>BioLegend</td><td>100312</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD45-Alex 700</td><td>BioLegend</td><td>103128</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD45-BV421</td><td>Biolegend</td><td>103133</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 um</td><td>Avantor</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>Dressing Forceps&nbsp;</td><td>V. Mueller</td><td>NL1410</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N7167</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Ly6G-BV421</td><td>BioLegend</td><td>127628</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Ly6G-PerCp-cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>127615</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>NK1.1-APC-cy7</td><td>BioLegend</td><td>108723</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Percoll (density gradient medium)</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10x)</td><td>BioLegend</td><td>420302</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>SKLAR</td><td>64-1250</td><td></td></tr><tr><td>WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357544</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células inmunitarias del cerebro y el cráneo de ratones

Isolating Immune Cells from Mouse Brain and Skull

Cada vez hay más pruebas de que la respuesta inmunitaria desencadenada por los trastornos cerebrales (por ejemplo, isquemia cerebral y encefalomielitis autoinmunitaria) no sólo se produce en el cerebro, sino también en el cráneo. Un paso clave para analizar los cambios en las poblaciones de células inmunitarias tanto en el cerebro como en la médula ósea del cráneo después de un daño cerebral (por ejemplo, un accidente cerebrovascular) es obtener un número suficiente de células inmunitarias de alta calidad para los análisis posteriores. Aquí, se proporcionan dos protocolos optimizados para aislar las células inmunitarias del cerebro y la médula ósea del cráneo. Las ventajas de ambos protocolos se reflejan en su simplicidad, rapidez y eficacia para producir una gran cantidad de células inmunitarias viables. Estas células pueden ser adecuadas para una serie de aplicaciones posteriores, como la clasificación de células, la citometría de flujo y el análisis transcriptómico. Para demostrar la eficacia de los protocolos, se realizaron experimentos de inmunofenotipado en cerebros de accidente cerebrovascular y médula ósea de cráneo normal mediante análisis de citometría de flujo, y los resultados se alinearon con los hallazgos de los estudios publicados.

Para preparar células inmunitarias a partir del tejido cerebral del ratón, el protocolo generalmente produce células con alta viabilidad (84,1% ± 2,3% [media ± DE]). Aproximadamente el 70%-80% de estas células son CD45 positivas. En el cerebro normal del ratón, casi todas las células CD45+ son microglía (CD45LowCD11b+), como se esperaba. Este protocolo se ha utilizado en el laboratorio para diversas aplicaciones, incluido el análisis de citometría de flujo, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y el análisis scRNA-seq. A modo de ejemplo, se realizó un análisis de citometría de flujo en un modelo de ictus (Figura 3). Los ratones fueron sometidos a un modelo de accidente cerebrovascular transitorio, oclusión de la arteria cerebral media (OAMI) con filamento de 30 min14. El día 3 después del accidente cerebrovascular, se prepararon células de cerebros de ratón y se tiñeron con marcadores de superficie de células inmunitarias comunes. La estrategia de compuerta se muestra en la Figura 3A. De acuerdo con investigaciones previas13,15, se observó un marcado aumento de las célulasaltas CD45 en el hemisferio ipsilateral (Figura 3B,C), lo que indica la infiltración de la célula inmunitaria en el cerebro.
Para el protocolo de médula ósea del cráneo, se logró consistentemente un rendimiento sustancial de células de médula ósea del cráneo (alrededor de 2 x 106 células) con una excelente viabilidad (93,8% ± 1,8% [media ± DE]). Como era de esperar, la mayoría de estas células son CD45 positivas. Para ilustrar la utilidad de este protocolo, se realizó un estudio comparativo para caracterizar la composición de células inmunitarias tanto en el fémur como en la médula ósea del cráneo de ratones naïve (Figura 4). Como se muestra en los gráficos representativos, la composición de células inmunitarias fue similar entre el fémur y la médula ósea del cráneo (Figura 4A,B). Curiosamente, la frecuencia de neutrófilos parece ser mayor en el fémur que en el hueso del cráneo (Figura 4C). Sin embargo, este hallazgo requiere una mayor validación, ya que el tamaño de la muestra fue pequeño para este estudio piloto.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general del protocolo de aislamiento de células cerebrales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig02.jpg"> Figura 2: Protocolo de aislamiento de células de médula ósea de cráneo. (A) Descripción general del procedimiento. (B) El patrón recomendado para el corte del cráneo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig03.jpg"> Figura 3: Análisis representativo de citometría de flujo de las células inmunitarias en el cerebro del ictus. (A) Un ejemplo de la estrategia de compuertas. Los gráficos muestran las siguientes poblaciones de células inmunitarias: microglía (CD45LowCD11b+), células NK (CD45HighNK1.1+), neutrófilos (CD45HighLy6G+), células T (CD45HighCD11b-CD3+) y células B (CD45HighCD11b-CD19+). Este ejemplo representa un análisis de las células inmunitarias cerebrales en el hemisferio ipsilateral el día 3 después de un accidente cerebrovascular. (B,C) Infiltración de células inmunitarias en el cerebro del accidente cerebrovascular. Los ratones machos jóvenes se sometieron a una oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO). El día 3, se recolectaron los cerebros y se dividieron en hemisferios izquierdo (contralateral) y derecho (ipsilateral). Las células cerebrales se prepararon de acuerdo con el protocolo descrito y luego se sometieron a un análisis de citometría de flujo. Los gráficos representativos ilustran el aumento de las células inmunitarias infiltrantes en el hemisferio ipsilateral (célulasaltas CD45; B). Los datos cuantitativos se muestran en los gráficos de barras (C). El número de células se calculó en función del recuento de células y el volumen registrados en los datos de citometría de flujo. Los datos se presentan como media ± SEM. *p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig04.jpg"> Figura 4: Análisis representativo de citometría de flujo de las células de la médula ósea del cráneo. Para la comparación, se incluyó el análisis de las células de la médula ósea del fémur. Los gráficos muestran las siguientes poblaciones de células inmunitarias: células NK (CD45+NK1.1+), neutrófilos (CD45+CD11b+Ly6G+), células T (CD45+CD11b-CD3+) y células B (CD45+CD11b-CD19+). (A) Parcelas representativas de la médula ósea del fémur. (B) Parcelas representativas de la médula ósea del cráneo. (C) Comparación de la composición de células inmunitarias entre el fémur y la médula ósea del cráneo. Los datos se presentan como media ± SEM. *p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Para investigar la respuesta inmunitaria a los trastornos cerebrales, un enfoque común es analizar los cambios en las células inmunitarias. Aquí, se proporcionan dos protocolos simples y efectivos para aislar células inmunitarias del tejido cerebral murino y la médula ósea del cráneo.

Aislamiento de células inmunitarias del cerebro y el cráneo de ratones

Mounting evidence indicates that the immune response triggered by brain disorders (e.g., brain ischemia and autoimmune encephalomyelitis) occurs not only ...

Nuestra investigación se centra en la compleja respuesta inmunitaria tras la isquemia cerebral causada por un ictus isquémico y un paro cardíaco. La isquemia cerebral desencadena la activación de las células inmunitarias residentes en el cerebro y la infiltración de células inmunitarias. Sin embargo, nuestra comprensión de estas células inmunitarias sigue siendo limitada.Nuestro objetivo es diseccionar el estado inmunológico, el origen y las funciones de estas células cerebrales después de la isquemia. Investigaciones recientes destacan el sorprendente papel del cráneo en la respuesta inmunitaria del cerebro después de una lesión. Por lo tanto, es importante analizar los cambios en las células inmunitarias tanto en el tejido cerebral como en la médula ósea del cráneo después de la isquemia cerebral.Con este fin, un paso crítico es obtener un número suficiente de células inmunitarias de alta calidad para su posterior análisis. Nuestros protocolos permiten a los investigadores obtener rápidamente grandes cantidades de células inmunitarias disponibles del cerebro y la médula ósea del cráneo. El protocolo de células inmunitarias cerebrales utiliza un enfoque de disociación mecánica a baja temperatura en todo momento, lo que garantiza una mejor conservación de los perfiles transcripcionales y proteómicos.El protocolo de médula ósea del cráneo es simple, pero efectivo para extraer células de médula ósea del cráneo. Continuaremos nuestra investigación exhaustiva sobre el impacto de la isquemia cerebral en las células inmunitarias del tejido cerebral y el cráneo. Dado que la neuroinflamación juega un papel clave en la fisiopatología de la lesión cerebral después de la isquemia, se espera que nuestra investigación descubra nuevas dianas terapéuticas para la protección del cerebro después de un accidente cerebrovascular isquémico o un paro cardíaco.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

En este video, realizamos el aislamiento de células mononucleares del cerebro de un ratón utilizando centrifugación por gradiente de densidad. La suspensión de célula mononuclear aislada se puede utilizar para análisis posteriores posteriores.

Aislamiento de células mononucleares a partir de cerebro de ratón: una técnica de centrifugación de gradiente de densidad para aislar células mononucleares residentes en el cerebro

El video muestra una técnica para aislar la microglía de la corteza del cerebro de un ratón adulto. En primer lugar, la corteza se somete a segmentación y homogeneización para eliminar las neuronas y otras células gliales, preservando la microglía. Después de eso, la suspensión celular se expone a microesferas magnéticas antimielina y a un campo magnético, separando efectivamente la microglía y las células mieloides de los restos de mielina y las células que contienen mielina.

Aislamiento de la microglía de la corteza del cerebro de un ratón adulto

El video muestra el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica infiltrantes de tumores del cerebro de un ratón utilizando disociación mecánica y digestión enzimática. A esto le sigue la centrifugación en gradiente de densidad para recoger las células inmunitarias para su posterior análisis.

Aislamiento de células inmunitarias infiltrantes de tumores de un cerebro murino

El video muestra la preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de un tejido cerebral murino. Implica la digestión enzimática para liberar células del tejido cerebral, seguida de la centrifugación en gradiente de densidad para aislar las células inmunitarias en función de sus densidades para obtener la suspensión unicelular.

Preparación de una suspensión unicelular de células inmunitarias a partir de tejido cerebral murino

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) están interconectadas por proteínas de unión específicas que forman una barrera altamente regulada que separa la sangre y el sistema nervioso central (SNC), la llamada barrera hematoencefálica (BBB). El aislamiento de las células endoteliales microvasculares primarias del cerebro murino, como se discute en este protocolo, permite estudios detallados in vitro de la BHE.

Aislamiento de células primaria murino cerebro endoteliales microvasculares

La inflamación juega un papel central en la patogénesis del ictus isquémico. Cada vez hay más pruebas que sugieren que actúa como un arma de doble filo que exacerba las lesiones cerebrales tempranas, pero también contribuye a la reparación posterior. Este protocolo describe el aislamiento de células inmunitarias del cerebro isquémico y su posterior fenotipado por citometría de flujo.

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

Este artículo presenta dos protocolos optimizados para examinar las células inmunitarias residentes y derivadas periféricas dentro del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal y las meninges. Cada uno de estos protocolos ayuda a determinar la función y composición de las células que ocupan estos compartimentos en estado estacionario y en condiciones inflamatorias.

Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

Describimos un protocolo para aislar células microgliales del hipotálamo del ratón (o pequeñas estructuras cerebrales equivalentes) utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), en un tiempo relativamente corto. La microglía hipotalámica clasificada por MACS se puede utilizar para análisis ex vivo y se puede sembrar para realizar ensayos in vitro .

Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente  

Aprenda a aislar células inmunitarias del cerebro y la médula ósea del cráneo en ratones tras isquemia cerebral. Estos protocolos preservan perfiles transcriptómicos y proteómicos para avanzar en terapias neuroprotectoras.

Aislamiento de células inmunitarias del cerebro y el cráneo de ratones

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