Name: Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda a medir contactos entre el retículo endoplásmico y mitocondrias en células HEK293T vivas mediante el ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida. Este método cuantitativo facilita el estudio de la comunicación interorganelular.

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<meta charset="utf8"></head><body>Un ensayo sencillo para medir los contactos entre el RE y las mitocondrias en cribados de alto rendimiento

<ol><li>Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites-emerging+intracellular+signaling+hubs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).</li>
<li>Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites%3B+a+multifaceted+factory+for+Ca2%2B+signaling+and+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).</li>
<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+together+to+define+membrane+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).</li>
<li>Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+connection%3A+How+membrane+contact+sites+have+changed+our+view+of+organelle+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology.</a> Cell. 187 (2), 257-270 (2024).</li>
<li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There%27s+something+wrong+with+my+MAM%3B+the+ER-mitochondria+axis+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases.</a> Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).</li>
<li>Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+associated+membranes+%28MAMs%29%3A+emerging+drug+targets+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes.</a> Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).</li>
<li>Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entangled+ER-mitochondrial+axis+as+a+potential+therapeutic+strategy+in+neurodegeneration%3A+A+tangled+duo+unchained%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained.</a> Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).</li>
<li>Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+and+their+critical+role+in+aging+and+age-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).</li>
<li>Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites+in+the+control+of+glucose+homeostasis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update.</a> Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).</li>
<li>Bouguerra, M. D., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+interactions%3A+Both+strength+and+weakness+within+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).</li>
<li>Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+junctions+with+cellular+organelles%3A+Ca2%2B+signalling+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective.</a> Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).</li>
<li>Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+of+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A computational model of motor neuron degeneration.</a> Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).</li>
<li>Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites+reporters%3A+strengths+and+weaknesses+of+the+available+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2%2B+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).</li>
<li>Valm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+systems-level+spectral+imaging+and+analysis+to+reveal+the+organelle+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome.</a> Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).</li>
<li>Csordás, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).</li>
<li>Cieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPLICS%3A+a+split+green+fluorescent+protein-based+contact+site+sensor+for+narrow+and+wide+heterotypic+organelle+juxtaposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition.</a> Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).</li>
<li>Kakimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+multiple+inter-organelle+contact+sites+using+the+organelle-+targeted+split-GFP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system.</a> Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).</li>
<li>Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+diffusion+and+trapping+of+STIM1+and+Orai1+at+ER-plasma+membrane+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+regulates+ER-mitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts.</a> Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Cho, I. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+peroxidase+proximity+labeling+coupled+with+biochemical+fractionation+identifies+promoters+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts.</a> J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia-linked+REEP1+modulates+endoplasmic+reticulum%2Fmitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts.</a> Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).</li>
<li>Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+actomyosin%3A+Partners+in+regulating+epithelial+cell-cell+junction+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function.</a> Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga SafeSeal de 1,7 ml</td><td>Sorenson</td><td>16070</td> Placa de 6 pocillos <td></td></tr><tr><td>tratada TC</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Puntas de pipeta OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L puntas de pipeta OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &mu; L Puntas biseladas OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1210</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo cónico de polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Bastidores de microtubos con aletas de 96 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8770-11</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos TC Tratados&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7596</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Plato tratado con TC</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>1250 &mu; L Tips OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1112-1720</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5910&nbsp; Ri - Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5943000131</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido, anhidro, &ge; 99.9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EHop 016</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>6248</td><td>Disolver en DMSO; almacenar a -70 °C C</td></tr><tr><td>EnduRen Sustrato de celda viva</td><td>Promega</td><td>E6481</td><td>Almacene alícuotas a -70 &deg; C</td></tr><tr><td>Eppendorf 2-20 &mu; L pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 100-1000 &mu; Pipeta L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 1-10 &micro; Pipeta L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 12 canales</td><td>Eppendorf</td><td>3125000028</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 200 &mu; Pipeta L</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>3123000055</tr><tr><td>Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2&nbsp; Incubadora, 184 L, acero inoxidable pulido</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>381</td><td></td></tr><tr><td>Contador manual</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS6594</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T Celdas</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro - Neubauer Bright Line, cámara de doble recuento</td><td>LW Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Invitrogen TE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8019005</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>Rack Multi Tube para tubos cónicos de 50 ml, cónicos de 15 ml y microcentrífugas</td><td>Boekel Scientific</td><td>120008</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Clorhidrato de polietileno lineal de grado de transfección (MW 40,000)</td><td>Polysciences</td><td>24765-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>USA Scientific</td><td>4440-0101</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de rosina</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>5003</td><td>Disolver en DMSO; almacenar a -70 & grados; C</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan LUX lector de microplacas multimodo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2215365</td><td>nivel 8</td></tr><tr><td>Sistema de aspiración al vacío VWR</td><td></td><td>VWR 75870-734</td><td></td></tr><tr><td>ZCL 278</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>4794</td><td>Disolver en DMSO; almacenar a -70 °C; C</td></tr></tbody></table>

ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells

Hemos utilizado el protocolo descrito anteriormente para medir el nivel de contactos ER-mitocondrias tras la adición de tres compuestos conocidos por inhibir GTPasas específicas. CDC42, Rho y RAC son GTPasas que promueven la polimerización de actina28 cuando se activan y son inhibidas por ZCL278, Rhosin y Ehop-016, respectivamente24. HEK293T células transfectadas con Split-Rluc se trataron con DMSO (control), ZCL278 (50 μM), Rhosin (50 μM) o Ehop-016 (25 μM) y se incubaron durante 1 h, 2 h y 5 h. Usando un lector de placas, medimos la actividad de Split-Rluc en puntos de tiempo definidos (Figura 2).
Las células tratadas con rosina (inhibidor de la GTPasa RHO) no mostraron cambios significativos en la actividad de la luciferasa en comparación con las células control tratadas con DMSO a 1 h, 2 h y 5 h del tratamiento (p &gt; 0,9999, p= 0,6956, p &gt; 0,9999) (Figura 2). Estos resultados demuestran que la rhosina no afecta a los contactos entre el RE y las mitocondrias, lo que sugiere que no hay implicación de la actividad de la GTPasa RHO en la regulación de los contactos entre los dos orgánulos.
Por el contrario, el inhibidor de la GTPasa RAC Ehop-016 mostró una actividad de luciferasa significativamente menor que el DMSO a la 1 h, 2 h y 5 h del tratamiento (p = 0,0106, p = 0,0009, p = 0,0024) (Figura 2). Estos datos indican que la actividad de la GTPasa RAC es necesaria para mantener la interacción normal entre el RE y las mitocondrias en la célula.
Finalmente, el inhibidor de CDC42 ZCL278 mostró los cambios más drásticos en la actividad de la luciferasa (Figura 2). Las células tratadas con ZCL278 mostraron una disminución significativa en la actividad de la luciferasa en comparación con el DMSO de control y tuvieron los valores de p más bajos en los tres puntos de tiempo, manteniendo una p &lt; 0,0001 en todo momento. Nuestros datos demuestran una fuerte inhibición del acoplamiento ER-mitocondrias cuando la actividad de la GTPasa CDC42 es bloqueada por ZCL278, lo que es consistente con nuestro informe anterior utilizando el ensayo original de Split-Rluc realizado en células co-transfectadas con dos vectores que codifican cada mitad de la luciferasa dividida por separado24.
Dados los sorprendentes resultados con ZCL278, especialmente en comparación con los otros inhibidores de GTPasa, la actividad de ZCL278 se probó más a fondo a varias concentraciones [0,5 μM, 5 μM, 50 μM] frente a un control DMSO. Las actividades de luciferasa medidas a 1 h, 2 h y 5 h después del tratamiento mostraron una respuesta dependiente de la dosis; 0,5 μM de ZCL278 resultaron en el efecto más débil sobre la actividad de la luciferasa, mientras que 5 μM mostraron una reducción más fuerte y 50 μM mostraron la reducción más fuerte en la actividad de la enzima reconstituida (Figura 3). En conjunto, nuestros resultados muestran que ZCL278 regula a la baja la actividad de Split-Rluc de una manera dependiente de la dosis y, a medida que avanza el tiempo, las concentraciones más altas de ZCL278 (inhibidor de CDC42) aún muestran un cambio significativo en relación con el DMSO de control en comparación con las concentraciones más bajas.
Como una forma de validar nuestro ensayo de Split-Rluc, se pueden realizar ensayos independientes bien establecidos, como el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el monitoreo de la absorción de calcio mitocondrial (Figura 4 y datos no mostrados)24. El isoproterenol, un agonista del receptor adrenérgico β2, que es uno de los compuestos identificados en nuestro cribado de promotores de contacto RE-mitocondrias (Figura 4A), se utilizó para confirmar que la actividad de la luciferasa del Split-Rluc tras el tratamiento con isoproterenol aumentó debido al aumento de los contactos ER-mitocondrias, como lo demuestran los cambios en la intensidad de la señal de PLA, así como la absorción de calcio mitocondrial (Figura 4B-E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig01.jpg"> Figura 1: El ensayo de reensamblaje de Split-R luc. (A) Representación esquemática del ensayo Split-R Luc. Cuando no hay contactos de membrana entre las mitocondrias y el retículo endoplásmico, el Mito-Rluc N y el RlucC-ER no interactúan y, por lo tanto, no hay actividad Rluc8. Sin embargo, la interacción entre el Mito-RlucN y el RlucC-ER, donde el RE y las membranas mitocondriales entran en contacto, da lugar a una actividad enzimática completa, que se detecta mediante la conversión del sustrato en luminiscencia. (B) Mapa esquemático de la construcción de ADN split-Rluc (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry). (C) Diagrama del flujo de trabajo para el ensayo de Split-Rluc en HEK293T celdas. Abreviaturas: Mito = mitocondrias; RE = retículo endoplásmico; IRES: sitio de entrada ribosómica interna; rb_glob pA, señal de poliadenilación de beta-globina de conejo; T2A, una secuencia de péptido 2A que se escinde automáticamente del virus Thosea asigna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig02.jpg"> Figura 2: Las actividades de Split-R luc correspondientes a los niveles de contactos ER-Mito en las células tratadas con inhibidores de la GTPasa. (A-C) Actividades de luciferasa reconstituidas a (A) 1 h, (B) 2 h o (C) 5 h después del tratamiento con DMSO (control), Rhosin [50 μM], Ehop-016 [25 μM] o ZCL278 [50 μM] (n = 12 para cada grupo). Todos los datos se analizaron mediante ANOVA de un factor con comparaciones múltiples. Los valores de p se informan como p &gt; 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Las barras de error indican el error medio ± estándar de medición. Abreviaturas: Mito = mitocondrias; RE = retículo endoplásmico; RLU = unidad de luz relativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig03.jpg"> Figura 3: Las actividades de split-Rluc miden los niveles de contactos ER-Mito en las células tratadas con ZCL278. (A-C) Actividades de luciferasa reconstituidas a (A) 1 h, (B) 2 h o (C) 5 h después de DMSO (control) o ZCL278 a una concentración de [0,5 μM], [5 μM] o [50 μM] (n = 12 para cada grupo). Todos los datos se analizaron mediante ANOVA de un factor con comparaciones múltiples. Los valores de p se informan como p &gt; 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Las barras de error indican el error medio ± estándar de medición. Abreviaturas: Mito = mitocondrias; RE = retículo endoplásmico; RLU = unidad de luz relativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig04.jpg"> Figura 4: Validación del ensayo split-Rluc. (A) Un ejemplo de cuantificación de la actividad de Split-Rluc después de tratar células HEK293T con 11 fármacos, incluido el isoproterenol, identificado en un cribado compuesto para promotores de contacto ER-mitocondrias. (B) Un ejemplo de ensayo de ligadura de proximidad en células HeLa que fueron tratadas con DMSO o isoproterenol (1 μM). La señal PLA (rojo) indica un contacto cercano entre ER y Mito. Sec61-GFP (verde): para etiquetar ER; DAPI (azul): núcleo. (C) Cuantificación de la señal de PLA en A (n = 4 experimentos con 77-97 células cada uno; Prueba de Mann-Whitney). (D) Absorción de calcio mitocondrial en respuesta a la histamina (100 μM). Cambio en la intensidad fluorescente de Mito-R-GECO1 (el promedio se tomó en múltiples células HeLa) graficado cada 2,5 s en células tratadas con DMSO o isoproterenol. La flecha indica la adición de histamina. (E) Izquierda: Pico máximo de absorción de calcio mitocondrial en A. Prueba t de dos colas no apareadas (n = 10, DMOS; 14, isoproterenol). Derecha: Tasa de absorción de calcio mitocondrial (como en A; 7,5 a 12,5 s). Prueba de Mann-Whitney (n = 12, DMSO; 11, isoproterenol). Esta figura es una modificación de Lim et al.24. Abreviaturas: RLU = unidad de luz relativa; PLA = ensayo de ligadura de proximidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Resumen de las técnicas actuales para los contactos ER-mitocondrias. Lista de ventajas y limitaciones de cada método. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R2_updated_Table1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Archivo Suplementario 1: Archivo zip que contiene la secuencia de ADN (formatos PDF y GBK) de pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc CER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R3_plasmidDNAsequence.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S1: Mapa de pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_Supplemental%20Figure%201_PlasmidMap_PrimerSequence_.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid ...

split-luciferase-reassembly-assay-to-measure-endoplasmic-reticulum

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

Aquí se describen los procedimientos para el estudio de los cambios en la fagocitosis inducida por la expresión de genes con un enfoque de luciferasa basado en genes utilizando el sistema de doble GloTM ensayo luciferasa de Promega.

El estudio de biogénesis de la membrana con un ensayo de luciferasa basado en genes

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Ensayo de complementación de luciferasa dividida para identificar interacciones específicas proteína-proteína

El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.

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Se describen los métodos de formación de imágenes que utilizamos para investigar la distribución y la movilidad de las proteínas fluorescentes transfectadas residentes en el retículo endoplásmico (RE) por medio de la imagen confocal de células vivas. También analizamos ultraestructuralmente el efecto de su expresión en la arquitectura de este compartimento subcelular.

Visualización del retículo endoplasmático subdominios en células cultivadas

Las interacciones entre las proteínas son fundamentales para todos los procesos celulares. El uso de bioluminiscencia de transferencia de energía de resonancia, la interacción entre un par de proteínas se puede controlar en células vivas y en tiempo real. Además, los efectos de las mutaciones potencialmente patógenos pueden ser evaluados.

La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

A continuación, describimos un procedimiento para visualizar y cuantificar con alta sensibilidad las interacciones endógenas entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias en las células fijadas. El protocolo cuenta con una optimizada en el ensayo de ligamiento por proximidad situ la orientación del inositol receptor / proteína 1,4,5-trifosfato regulada por glucosa 75 / D compleja canal de aniones / ciclofilina dependiente de la tensión en la interfase membrana de la mitocondria asociada.

Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas

El protocolo presentado aquí está destinado a demostrar la ocurrencia de interacciones heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes en Golgi con N- y/o C-termini expuestas citoplasmáticamente en células vivas de mamíferos utilizando la variante más reciente del ensayo de complementación de luciferasa dividida.

Demostración de complejos heterólogos formados por proteínas de membrana tipo III residentes de Golgi utilizando el ensayo de complementación de luciferasa dividida

La necesidad de nuevos enfoques para estudiar los sitios de contacto de membrana (MCS) ha crecido debido al creciente interés en el estudio de estas estructuras celulares y sus componentes. Aquí, presentamos un protocolo que integra tecnologías de microscopía previamente disponibles para identificar y cuantificar complejos de proteínas intra-orgánulos e inter-orgánulos que residen en los SQM.

Visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad

Este protocolo describe un ensayo basado en BRET para medir las interacciones de la quinasa CRAF con las proteínas 14-3-3 en células vivas. El protocolo describe los pasos para la preparación de las celdas, la lectura de las emisiones BRET y el análisis de datos. También se presenta un ejemplo de resultado con la identificación de los controles adecuados y la resolución de problemas para la optimización del ensayo.

Ensayo basado en transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) para medir las interacciones de CRAF con proteínas 14-3-3 en células vivas

Aprenda a medir contactos entre el retículo endoplásmico y mitocondrias en células HEK293T vivas mediante el ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida. Este método cuantitativo facilita el estudio de la comunicación interorganelular.

Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas (Video) | JoVE Journal

Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

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