Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas
October 11th, 2024
Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.
En mi laboratorio, estudiamos la comunicación interorgánica que toma una forma de contacto con la membrana y sus funciones en el mantenimiento de la salud celular, así como en la patogénesis de la enfermedad. Estamos particularmente interesados en los contactos de membrana entre las mitocondrias y el retículo endoplásmico y tratamos de comprender cómo se regulan y cómo su desregulación puede conducir a la neurodegeneración. Aunque sabemos que los contactos de las mitocondrias del RE son importantes para la salud celular y que su desregulación se asocia con muchas enfermedades, no sabemos mucho sobre cómo se regula su nivel.
El primer paso para abordar esto es establecer un protocolo simple y confiable para medir el nivel de contactos de mitocondrias del RE en las células. Nuestro ensayo de luciferasa dividida ofrece una forma más fácil y rápida de cuantificar los contactos de las mitocondrias del RE en células vivas en comparación con la mayoría de los ensayos. Aprovechamos dos mitades divididas de renilla luciferasa, una mitad dirigida a RE y la otra a las mitocondrias.
Solo se pueden volver a ensamblar donde las membranas del RE y las mitocondrias tienen un contacto cercano, lo que da como resultado luciferasa reconstituida con una actividad enzimática completa. Este método es simple, adecuado para cribados de alto rendimiento y fácilmente accesible para muchos laboratorios. Esperamos que avance en el campo de las enfermedades neurodegenerativas mediante la identificación de moduladores moleculares y genéticos de los contactos de las mitocondrias del RE que puedan convertirse en agentes terapéuticos.
Nuestros resultados han allanado el camino para preguntas importantes, como cómo afectan los diferentes fármacos o combinaciones de fármacos a los contactos de las mitocondrias del RE, y cuáles son los actores moleculares importantes detrás de estos contactos. A partir de estas preguntas, podemos obtener una mejor comprensión del mecanismo de contacto de las mitocondrias del RE y encontrar formas de combatir las enfermedades relacionadas.
Visión general
Este estudio establece un ensayo de reensamblado de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. El protocolo mide cuantitativamente estos acoplamientos entre organelos en células HEK293T bajo tratamiento químico.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Comunicación interorganelar
Antecedentes
- La comunicación interorganelar es vital para la salud celular.
- Los contactos de membrana entre las mitocondrias y el retículo endoplásmico son cruciales.
- La desregulación de estos contactos está vinculada a la neurodegeneración.
- Los métodos actuales para medir estos contactos son complejos y consumen mucho tiempo.
Propósito del estudio
- Establecer un protocolo confiable para medir los contactos entre el RE y las mitocondrias.
- Simplificar la cuantificación de estos contactos en células vivas.
- Mejorar la comprensión de cómo se regulan estos contactos.
Métodos utilizados
- Ensayo de reensamblado de luciferasa dividida.
- Dirección de una mitad de la luciferasa renilla al RE y la otra a las mitocondrias.
- Medición cuantitativa de los acoplamientos entre organelos.
- Uso de células HEK293T bajo condiciones de tratamiento químico.
Principales resultados
- Establecimiento exitoso de un ensayo de luciferasa dividida.
- Datos cuantitativos sobre los contactos entre el RE y las mitocondrias obtenidos.
- Se demostró la eficiencia del ensayo en comparación con los métodos tradicionales.
- Perspectivas sobre la regulación de la comunicación interorganelar.
Conclusiones
- El ensayo de luciferasa dividida es una herramienta confiable para estudiar los contactos entre el RE y las mitocondrias.
- Este método puede facilitar investigaciones adicionales sobre la salud celular y las enfermedades.
- La comprensión de estos contactos puede conducir a perspectivas sobre enfermedades neurodegenerativas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of endoplasmic reticulum-mitochondria contacts is critical for de-risking neurodegenerative disease targets and clarifying cellular mechanisms underlying pathogenesis. The split-luciferase reassembly assay enables high-throughput, live-cell assessment of these contacts, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. This capability strengthens portfolio decisions by enabling systematic evaluation of modulators affecting inter-organelle communication.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of ER-mitochondria contact dynamics in live cells.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying contact modulation in response to candidate compounds.
- Facilitates identification of molecular players regulating inter-organelle coupling relevant to neurodegeneration.
- Provides a quantitative readout for functional target validation and triage.
Screening & Assay Development
- Delivers a scalable, high-throughput assay format for screening chemical or genetic modulators of ER-mitochondria contacts.
- Standardizes measurement of contact-dependent luciferase activity for reproducible assay outputs.
- Enables robust comparison of compound effects across multiple conditions and time points.
- Prepares validated biological systems for downstream mechanistic or phenotypic screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling contact dysregulation implicated in neurodegenerative disorders.
- Supports translational biomarker development by linking contact modulation to cellular health outcomes.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of therapeutic hypotheses targeting inter-organelle communication.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling early hypothesis testing, lead identification, and mechanistic validation of ER-mitochondria contact modulators.
- Discovery Biology: Quantifies contact-dependent luciferase reassembly to clarify pathway regulation and biological risk.
- Screening: Offers high-throughput, reproducible outputs for compound or genetic screening campaigns.
- Analytics: Provides quantitative luminescence measurements for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects contact modulation to disease-relevant phenotypes in neurodegeneration models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for ongoing target validation and mechanistic studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines assay standardization, reproducibility, and scalability for cross-team adoption.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by enabling robust, quantitative readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and therapeutic strategies addressing inter-organelle dysfunction.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell transfection and luminescence assay setup.
- Needs access to luminescence plate readers and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data analysis protocols.
- Adaptable to various cell models but may require optimization for different systems.
- Dependent on validated reagents and controls to ensure assay specificity and reliability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:55
Maintaining and Seeding HEK293T Cells for Split‐Rluc Plasmid Transfection
3:38
Polyethyleneimine (PEI)‐Mediated HEK293T Cell Transfection and Post‐Transfection Cell Seeding
5:55
Chemical Treatment and Luciferase Assay to Measure the Level of ER‐Mitochondria Contacts in Live Cells
