Name: Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende a generar suspensiones de células únicas y núcleos de embriones de ratón en gastrulación para secuenciación de ARN unicelular. Este protocolo facilita el análisis de decisiones tempranas de destino celular en mutantes de linaje.

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Agradecemos al Núcleo de Genómica del Centro Oncológico Fox Chase y a los miembros del laboratorio del Dr. Johnathan Whetstine, Zach Gray, Madison Honer y Benjamin Ferman por su apoyo técnico para los experimentos de secuenciación. Agradecemos a los miembros de laboratorio del Dr. Estaras y Alex Morris, un estudiante graduado de rotación que contribuyó al análisis inicial de los estudios de células individuales. Este trabajo está financiado por las subvenciones de los NIH R01HD106969 y R56HL163146 a Conchi Estaras. Además, Elizabeth Abraham recibió el apoyo de la beca de formación T32 5T32HL091804-12.

Aislamiento y genotipado de embriones de ratón gastruladores para secuenciación unicelular

<ol><li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastruloids%3A+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li>
<li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology%3A+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li>
<li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li>
<li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-embryo%2C+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).</li>
<li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+Coordination+of+tissue+patterning%2C+specification+and+diversification+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617(2020).</li>
<li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li>
<li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li>
<li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: 
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<li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024).</li>
<li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).</li>
<li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo se presenta una sólida cartera de productos para la obtención de suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad a partir de embriones de ratón gastrulados, diseñada específicamente para facilitar los estudios sobre los mecanismos de especificación del destino celular en el desarrollo temprano. Este método aborda una brecha crucial en el campo de la gastrulación al optimizar el análisis de embriones que requieren genotipos, como el sexo o los genes somáticos. Mediante la utilización de modelos de mutación genética en ratones y el empleo de secuenciación de alta resolución de una sola célula en embriones de ratón completos, esta línea puede mejorar aún más la comprensión de los perfiles de expresión génica de la gástrula de ratón temprana. Este método demuestra la viabilidad de utilizar un modelo de ratón de mutación genética mediante un sistema de recombinasa Cre para obtener células y núcleos de alta calidad en puntos de tiempo de desarrollo temprano para ómicas unicelulares. Este método evolucionó a través de múltiples intentos, durante los cuales las muestras no cumplieron con los estándares de calidad requeridos para la preparación y secuenciación de la biblioteca. La metodología explicada genera suficientes células/núcleos a partir de embriones menores que E8 a través de la optimización de tres pasos críticos: (1) embarazos sincronizados cronometrados para aumentar el número de embriones, (2) genotipado en el mismo día para evitar la congelación/descongelación, y (3) evaluación de la viabilidad de las células/núcleos para evitar la secuenciación de las células moribundas. Este protocolo ofrece resultados exitosos con RNASeq de una sola célula, pero las suspensiones celulares o de núcleos obtenidas en este protocolo se pueden procesar en otras plataformas de secuenciación, donde la viabilidad celular es el factor limitante, como smart-seq, drop-seq y cel-seq16.
En el embrión E7, el número de células puede variar según la cepa y el genotipo mutante. Por lo general, un embrión E7 puede variar de cientos a unos pocos miles de células, y obtener embriones con el genotipo deseado es un desafío, ya que solo 1 o 2 embriones por madre embarazada cumplen con los criterios. Este protocolo permite la captura de alrededor de 300 células viables por embrión E7 para su análisis unicelular. Los intentos de aumentar el tamaño de la reserva embrionaria mediante la congelación instantánea de embriones de madres embarazadas en diferentes días resultaron infructuosos, ya que la viabilidad celular se vio gravemente comprometida después de la descongelación, incluso con la adición de agentes criopreservativos. Para hacer frente a este reto, se optimizó la estrategia de cría y sincronización de las madres preñadas. Para aumentar las posibilidades de aislamientos múltiples, se recomienda utilizar ratones hembra que hayan dado a luz 1-2 veces antes de reproducirse para el aislamiento, ya que es más probable que tengan camadas de mayor tamaño. El seguimiento del ciclo estral de la hembra es crucial; Es más probable que el apareamiento ocurra durante las etapas de proestro y celo. Si surgen dificultades de cría, cambiar los compañeros de cría después de cuatro días también ayudará si no se produce un tapón.
Es importante tener en cuenta que este método tiene una limitación: se basa en los tapones observados, e incluso si se observa un tapón, no garantiza el embarazo, sino que solo indica actividad sexual. Por lo tanto, aumentar el número de tapones observados en un día aumentará la probabilidad de tener más de una madre embarazada en un día y más genotipos positivos. Este protocolo demostró la factibilidad de utilizar estadios embrionarios que van desde E7 hasta E7.75 como prueba de concepto durante la gastrulación. Sin embargo, esta tubería se puede aplicar desde embriones E6.5 hasta E8. Para los embriones E6.5, se recomienda aumentar el número de embarazos sincronizados para obtener al menos 7 embriones con el genotipo deseado para agrupar. En cambio, para los embriones E8, aumente la cantidad de tripsina utilizada para disociar cada embrión a ~ 40 μL en lugar de 20 μL. El objetivo es obtener una suspensión de células/núcleos en un rango de concentración de 700-1200 células por μl antes de proceder con la partición.
Tener una buena viabilidad celular es esencial para el éxito de la secuenciación de células individuales. En el diseño de chip microfluídico proporcionado por los fabricantes, las células individuales se dividen en perlas de gel en emulsión (GEM) dentro de un chip que contiene perlas de gel con código de barras conocidas11. Sin embargo, una limitación notable de este proceso es que se pueden particionar tanto células individuales de alta calidad como de mala calidad. Incluso con un número adecuado de células vivas (es decir, 1000 células/μL), si la viabilidad de la suspensión es baja (es decir, 1000 células vivas y 1000 células muertas, lo que resulta en un 50% de viabilidad), es probable que el experimento de secuenciación falle. Para obtener resultados óptimos, se recomienda apuntar a una viabilidad de alrededor del 90%. Si la viabilidad celular se sitúa entre el 60% y el 89%, se pueden tomar medidas específicas para mejorar la viabilidad del experimento. Sin embargo, si la viabilidad celular es inferior al 60%, se desaconseja encarecidamente continuar con el experimento. La razón de esto es que las células moribundas serán "capturadas" en el gel de partición, y la preparación posterior de la biblioteca y los controles de calidad pasarán sin problemas notables. Sin embargo, el experimento de secuenciación real puede fallar por completo, ya que la mayoría de las lecturas de secuenciación mapearán genes mitocondriales, ribosómicos o de apoptosis, lo que indica signos de mala viabilidad celular desde el principio. Los datos presentados en este artículo ilustran un proceso para la secuenciación de una sola célula de embriones de ratón gastrulados con células de alta calidad. Esta metodología se puede aplicar para la comprensión de muchos modelos diferentes de mutaciones genéticas en ratones durante el desarrollo.

La gastrulación es un proceso fundamental necesario para el desarrollo normal. Este proceso rápido y dinámico ocurre cuando las células pluripotentes se convierten en precursores específicos del linaje que definen cómo se forman los órganos. Durante años, la gastrulación se definió como la formación de tres poblaciones en gran medida homogéneas: mesodermo, ectodermo y endodermo. Sin embargo, las tecnologías de alta resolución y un número emergente de modelos de células madre embrionarias 1,2 revelan una heterogeneidad sin precedentes entre las primeras capas germinales 3,4. Esto sugiere que aún queda mucho por descubrir sobre los mecanismos que regulan las distintas poblaciones celulares de la gástrula. El desarrollo embrionario del ratón ha sido uno de los mejores modelos para estudiar las decisiones tempranas sobre el destino celular durante la gastrulación 3,5. La gastrulación en ratones es rápida, ya que todo el proceso de gastrulación ocurre dentro de las 48 h, desde el día embrionario E6.5 hasta el E85.
Los avances recientes en las tecnologías unicelulares han permitido un mapeo detallado del desarrollo embrionario de ratones de tipo salvaje, proporcionando una visión completa de los paisajes celulares y moleculares de los embriones durante la gastrulación 3,4,6,7,8. Sin embargo, el análisis de embriones mutantes en estas etapas es menos común y a menudo se limita a poblaciones clasificadas por FACS 9,10. La escasa literatura refleja los desafíos técnicos asociados con la manipulación y preparación unicelular de embriones gastrulados que requieren genotipado. Capturar el proceso dinámico de la gastrulación puede plantear desafíos debido a su naturaleza rápida, especialmente para comprender los embriones mutantes. El momento y la sincronización de los embarazos son esenciales, ya que incluso las pequeñas diferencias entre los embarazos cronometrados pueden malinterpretarse como un fenotipo de desarrollo resultante del gen mutante. Esto se vuelve particularmente importante cuando el gen mutante influye en el proceso de gastrulación13,14. En este estudio se establecen pautas para obtener embarazos sincronizados a través de la visualización de tapones vaginales (es decir, la masa de líquido seminal coagulado que se forma en la vagina de la hembra después del apareamiento). Además, se diseña una estrategia para obtener datos robustos de una sola célula de embriones mutantes con gastrulación de E6.5 a E8. Esta estrategia está concebida para superar las limitaciones asociadas al bajo número de embriones con el genotipo deseado por embarazo y a la disminución de la viabilidad provocada por la congelación-descongelación de embriones o células.
Este artículo describe una metodología optimizada desde el establecimiento de embarazos cronometrados a través de tapones vaginales hasta la secuenciación final de células/núcleos individuales. Este método explica cómo aumentar el número de embarazos sincronizados para obtener un mayor número de embriones con el genotipo deseado, aislamientos de células/núcleos para mejorar la viabilidad de las células y un protocolo de genotipado en el mismo día. Este manuscrito también describe el proceso de aislamiento embrionario en diferentes momentos de gastrulación. La metodología ayuda a aumentar el número de células/núcleos de embriones viables finales para la secuenciación, lo que garantiza datos de secuenciación de alta calidad. Por lo tanto, este método abrirá las puertas a estudios unicelulares de embriones gastrulados que requieran genotipado.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Punta de barrera de alcance</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-430</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L Punta de barrera</td><td>de alcance Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro; L Punta de barrera de alcance</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-415</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro; m Filtro reversible, pequeña</td><td>Célula madre</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Placa de Petri</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR de 8 tiras</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-125U</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Apex Bioresearch Product</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini Baño Seco</td><td>Genesee</td><td>31-437</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle Microcentrífuga</td><td>refrigerada Genesee</td><td>33-759R</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Controller</td><td>10X</td><td>PN-1000127</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1</td><td>10X</td><td>PN-1000269</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Contador de células automatizado</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AMQAX2000</tr><tr><td>Countess Cell Couning Chamber Portaobjetos</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reactivos</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR saco vitelino</td><td>Viagen</td><td>201-Y</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol ( TDT)</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific R0861</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubo 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>GenClone</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000 Sistema de Imagen</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Finas - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Green Master Mix Promega</td><td></td><td>M7823</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzas</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Termociclador</td><td>Biosystems Applied Biosystems</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 1000/2000 P2 Reactivos (100 ciclos) v3</td><td>Illumina</td><td>20046811</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Nikon SMZ 1000</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nondiedt P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>GenClone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>Tubo óptico 8x Tira (401428)</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de tubo óptico 8x Tira (401425)</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Poseidon 31-511, Microcentrífuga HS24, con rotor de 24 x 1,5/2,0 mL, 1 centrífuga/unidad</td><td>Genesee</td><td>31-511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kits de ensayo</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 3</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la RNasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de patrón estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Estación de cinta Puntas de carga</td><td>Agilent</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td></td> G2992AA <td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td><td>Calidad Biológica</td><td>351-007-101</td><td></td></tr><tr><td>Tinte azul tripán 0.4%Theromo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice IKA MS3 con adaptador de placa de muestra de 96 pocillos</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

secuenciación de arn unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Durante la última década, los enfoques unicelulares se han convertido en el estándar de oro para estudiar la dinámica de la expresión génica, la heterogeneidad celular y los estados celulares dentro de las muestras. Antes de los avances de una sola célula, la viabilidad de capturar el paisaje celular dinámico y las transiciones celulares rápidas durante el desarrollo temprano era limitada. En este trabajo, se diseñó una tubería robusta para realizar análisis de células individuales y núcleos en embriones de ratón desde el día embrionario E6.5 hasta E8, correspondiente al inicio y finalización de la gastrulación. La gastrulación es un proceso fundamental durante el desarrollo que establece las tres capas germinales: mesodermo, ectodermo y endodermo, que son esenciales para la organogénesis. Se dispone de una amplia bibliografía sobre ómicas unicelulares aplicadas a embriones perigastruladores de tipo salvaje. Sin embargo, el análisis de embriones mutantes de una sola célula sigue siendo escaso y, a menudo, se limita a poblaciones clasificadas por FACS. Esto se debe en parte a las limitaciones técnicas asociadas con la necesidad de genotipado, embarazos cronometrados, el recuento de embriones con genotipos deseados por embarazo y el número de células por embrión en estas etapas. Aquí, se presenta una metodología diseñada para superar estas limitaciones. Este método establece pautas de reproducción y embarazo cronometrado para lograr una mayor probabilidad de embarazos sincronizados con los genotipos deseados. Los pasos de optimización en el proceso de aislamiento embrionario, junto con un protocolo de genotipado en el mismo día (3 h), permiten realizar una sola célula basada en microgotas en el mismo día, lo que garantiza una alta viabilidad de las células y resultados sólidos. Este método incluye además pautas para el aislamiento óptimo de los núcleos de los embriones. Por lo tanto, estos enfoques aumentan la viabilidad de los enfoques unicelulares de embriones mutantes en la etapa de gastrulación. Anticipamos que este método facilitará el análisis de cómo las mutaciones dan forma al paisaje celular de la gástrula.

La metodología diseñada en este trabajo está específicamente destinada a mejorar la preparación de muestras de embriones para ómicas unicelulares desde E6.5 hasta E8. Esta sólida cartera consta de cinco pasos principales: embarazos cronometrados sincronizados, aislamientos de embriones, genotipado en el mismo día, disociación celular y evaluación de la viabilidad celular (Figura 1A). Si bien los datos presentados se centran en los puntos temporales de E7 a E7.5, se pueden aplicar a embriones de hasta E8 (Figura 1B) con pequeñas variaciones en el procedimiento (a las que se hace referencia en las notas a lo largo del protocolo). Los embarazos cronometrados sincronizados se lograron colocando dos ratones hembra en una jaula con un ratón macho. Los tapones vaginales se revisaron todas las mañanas antes de las 10 de la mañana, y si se observaba un tapón, se consideró E0,5 al mediodía de ese día (Figura 2A). En este estudio, las condiciones óptimas para los tapones requerían que un ratón hembra en la etapa de estro o proestro se emparejara con un macho con un historial de colocación exitosa de varios tapones durante la reproducción previa (Figura 2B). Solo se consideraron tapones obvios para los aislamientos embrionarios (Figura 2C).
El tiempo de desarrollo se estimó siguiendo el cronograma de la Figura 2A. Para E7.5, la disección embrionaria comenzó a las 12 p.m. del7º día siguiente al día de la detección de un tapón. La Figura 3 ejemplifica un aislamiento exitoso de embriones en E7.5. Después de la eutanasia de la madre embarazada, se diseccionó el cuerno uterino, se cortó individualmente la hinchazón decidual, revelando el embrión, y se aisló el saco vitelino para su genotipado (Figura 3).
El genotipado en el mismo día se realizó dentro de las 3 h posteriores al aislamiento embrionario siguiendo los pasos de la Figura 4A. Los embriones se mantuvieron en hielo durante el proceso de genotipado para preservar su integridad. No congeles los embriones, ya que disminuirá el número de células viables por embrión. La figura 4B,C muestra el saco vitelino visceral, el saco endodérmico parietal y el cono ectoplacentario con sangre materna asociada. Para el genotipado se utilizó el saco vitelino visceral (Figura 4C). Después de digerir el saco vitelino, se preparó la mezcla de PCR y se realizó la reacción de PCR. A continuación, el producto de PCR resultante se separó en un gel de agarosa. La Figura 4D muestra los tamaños de fragmentos esperados para los alelos LoxP y de tipo salvaje (597 pb y 498 pb, respectivamente) y el alelo Cre (650 pb). En la Figura 4E, se presenta un ejemplo de genotipado del saco vitelino de 6 embriones obtenidos de parejas reproductoras portadoras de los alelos Cre y LoxP (flox). Los geles representan los productos de PCR de los alelos Cre y LoxP en los 6 embriones analizados. Los embriones número 2 y número 5 llevan 2 alelos flox y 1 alelo cre; por lo tanto, se consideran embriones KO condicionales (Figura 4E, puntos rojos). Los embriones 1 y 3 tienen 2 alelos flox pero son negativos para Cre; por lo tanto, se consideran controles flox. El embrión 4 tiene 2 alelos flox y una banda tenue para el alelo Cre, lo que resulta en un genotipo "poco claro". Este embrión no fue procesado posteriormente (alternativamente, el experimentalista puede considerar repetir el genotipado o realizar una validación secundaria del KO condicional utilizando células que expresan Cre). Es importante tener en cuenta que el impulsor de Cre utilizado en este experimento no se expresa en el saco vitelinovisceral 15; por lo tanto, los alelos LoxP no aparecen desplazados en el gel de los embriones Cre-positivos en comparación con los Cre-negativos.
El recuento de células y una buena viabilidad son necesarios para el éxito de un experimento con una sola célula. Las suspensiones con baja viabilidad celular, un alto porcentaje de células muertas, aglomeraciones o residuos significativos no son adecuadas para un procesamiento posterior. Las condiciones óptimas son de 700-1200 células vivas por microlitro y un &gt;90% de viabilidad. La Figura 5A presenta un panel que ilustra la viabilidad celular buena y subóptima. Los mismos criterios también se pueden aplicar para el aislamiento de núcleos, como se muestra en la Figura 5B. Sin embargo, es crucial tener en cuenta que la evaluación del azul de tripán difiere de las células y los núcleos: las células viables no incorporan azul de tripano, mientras que los núcleos viables sí. Si la suspensión de células/núcleos es óptima (&gt;90% de viabilidad), se proceda a la partición de una sola célula utilizando un chip microfluídico siguiendo los procedimientos del fabricante11. Se proporcionan opciones de solución de problemas para suspensiones en las que la viabilidad de las células/núcleos está entre el 60 % y el 89 %, como se muestra en la Figura 5C. Si la viabilidad, independientemente del número total de células, cae por debajo del 60%, considere detener el experimento.
Todo el proceso, desde el sacrificio de la presa embarazada hasta la construcción de la biblioteca, toma un total de 8 horas el mismo día (es decir, los pasos del protocolo 2 a 6 deben realizarse el mismo día). Siguiendo los procedimientos descritos por los procedimientos de los fabricantes de células individuales11, se prepararon construcciones de bibliotecas para la secuenciación de ARN de células individuales utilizando células obtenidas de embriones E7, con una viabilidad celular que oscila entre condiciones subóptimas y óptimas, con el objetivo de una recuperación objetivo estimada de 2000 células (Figura 6). La Figura 6A muestra una distribución representativa del tamaño de los fragmentos de las bibliotecas scRNAseq para condiciones subóptimas y óptimas, lo que indica que la viabilidad celular no afecta significativamente todo el proceso de partición de una sola célula. La distribución del tamaño de los fragmentos osciló entre 400 y 500 pb. Esto indica que las condiciones subóptimas no afectan el proceso de preparación de la biblioteca. La Figura 6B muestra los resultados de los experimentos de RNAseq de una sola célula exitosos y subóptimos. Después de la secuenciación, se llevaron a cabo controles de calidad en las muestras y se observó que, en los casos en que la viabilidad celular no era óptima, solo el 10% de las células se secuenciaron con éxito. Por el contrario, las muestras óptimas mostraron un mayor porcentaje, con el 91% del total de células secuenciadas. Esto se demuestra aún más mediante gráficos de códigos de barras, lo que indica que las condiciones subóptimas tienen un ruido de fondo mayor en comparación con las condiciones óptimas. Se realizó un análisis de agrupamiento para ambos experimentos y reveló 9 conglomerados en las condiciones óptimas y 4 en las subóptimas. La anotación de los conglomerados utilizando marcadores conocidos3 reveló los tipos de células esperados en los embriones E7, incluyendo el epiblasto y la raya primitiva (Figura 6B). Las anotaciones de conglomerados en el experimento subóptimo no fueron posibles debido a la falta de enriquecimiento en los marcadores conocidos para cada conglomerado. Esto pone de manifiesto la importancia de contar con células de alta calidad necesarias para la representación adecuada de los datos durante estas etapas de desarrollo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2.jpg"> Figura 1: Optimización de la gastruación de embriones enteros de ratón para la secuenciación de ARN de una sola célula. (A) Esquema de flujo de trabajo para la obtención de células y/o núcleos de alta calidad a partir de embriones gastrulantes. (B) Imágenes representativas de campo claro y esquema3 adaptado de embriones de ratón durante la gastrulación de E7 a E8. Barra de escala: 125 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2.jpg"> Figura 2: Estrategia para embarazos cronometrados sincronizados eficientes para el aislamiento de embriones durante la gastrulación. (A) Diagrama esquemático que indica el proceso para los embarazos cronometrados y un cronograma que describe los tiempos desde la detección del tapón hasta el aislamiento del embrión para el análisis de fases específicas de gastrulación. (B) Imágenes representativas de las fases del ciclo estral de ratones hembra. Se indican las fases más receptivas a la cría. (C) Diagrama esquemático que ilustra cómo verificar si hay tapones vaginales y ejemplos de aberturas vaginales sin tapón, un tapón parcial o un buen tapón a considerar para el aislamiento de embriones. Las aberturas vaginales se amplían debajo de cada imagen. El tapón (semen coagulado en la abertura de la vagina) se resalta con una flecha roja que apunta hacia él. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig03.jpg"> Figura 3: Disección y genotipado de embriones E7.5 para secuenciación de ARN unicelular. Diagramas esquemáticos e imágenes del proceso de aislamiento de embriones E7.5 y disección del saco vitelino visceral. La flecha amarilla indica el útero de la madre embarazada y el círculo amarillo discontinuo delinea la ubicación del embrión. Las líneas discontinuas representan las áreas que se cortaron durante la disección. "M" denota el extremo del mesometrial, mientras que "AM" denota el extremo anti-mesometrial. Las barras de escala en las imágenes estereoscópicas son de 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig04.jpg"> Figura 4: Genotipado en el mismo día de sacos vitelinos de embriones de ratón gastrulados. (A) Esquema de flujo de trabajo para el genotipado en el mismo día de sacos vitelino. (B) Imagen representativa del saco endodérmico parietal y cono ectoplacentario con sangre materna asociada. (C) Saco vitelino visceral en embriones E7.5 resaltado por la línea discontinua. Barra de escala: 200 μm. (D) Geles representativos de tipo salvaje (+/+), heterocigotos (Flox/+) y homocigotos flox (Flox/Flox), y genotipado de Cre (Mesp1cre15) con tamaños de fragmentos de ADN observados. (E) Se proporcionan los resultados del genotipado en el mismo día para los alelos Cre y flox de sacos vitelinos de 6 embriones (1-6). Los dos embriones con genotipado flox/flox y Cre negativo (-) son controles flox (puntos azules), mientras que aquellos con genotipado flox/flox y Cre positivo (+) son KO condicionales (puntos rojos). El embrión 4 no es óptimo debido a la tenue banda de Cre (flox/flox y Cre-unclear) y, por lo tanto, se excluye del procesamiento posterior. Los embriones con el mismo genotipo se agrupan y procesan para la secuenciación de ARN de una sola célula. Nótese que la presencia del alelo Cre en el saco vitelino no afecta al tamaño de las bandas flox, ya que el Cre utilizado (Mesp1cre) no se expresa en el saco vitelino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig05.jpg"> Figura 5: Evaluación de la calidad celular y la viabilidad de los núcleos. (A) Imágenes representativas de las condiciones óptimas y subóptimas de viabilidad celular de embriones E7.5. (B) Imágenes representativas de las condiciones óptimas y subóptimas de viabilidad de los núcleos de embriones E8 (C) Esquema de solución de problemas que indique posibles soluciones para ayudar a aumentar la viabilidad de las células antes de comenzar la partición de una sola célula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig06.jpg"> Figura 6: Secuenciación de ARN unicelular de embriones de ratón E7. (A) Traza representativa de la distribución del tamaño de los fragmentos para bibliotecas de secuenciación de ARN unicelular de embriones de ratón E7 para condiciones subóptimas y óptimas de viabilidad celular, con el pico principal cerca de 400-500 pb. Tenga en cuenta que las trazas son similares entre estas condiciones, lo que indica que la viabilidad de la celda no afecta a los controles de calidad de la biblioteca. (B) Análisis de los resultados de la secuenciación de ARN de una sola célula para embriones de ratón E7 en condiciones subóptimas y óptimas que muestran la recuperación de objetivos observada, la clasificación de códigos de barras y la agrupación de tipos de células a través de una distribución uniforme de aproximación y proyección de variedades (UMAP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Tampón de lisis</td>
		</tr><tr><td>Nombre del reactivo</td>
			<td>Concentración de existencias</td>
			<td>Concentración final</td>
			<td>Volumen total 1 mL</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>0,1 M</td>
			<td>3 mM</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr><tr><td>Preadolescente-20</td>
			<td>20%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Nondeadt P40</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Digitonin</td>
			<td>5%</td>
			<td>0.01%</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>TDT</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr><tr><td>Inhibidor de la ARNasa</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>1 U/μL</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>924 μL</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampón de lavado</td>
		</tr><tr><td>Nombre del reactivo</td>
			<td>Concentración de existencias</td>
			<td>Concentración final</td>
			<td>Volumen total 1 mL</td>
		</tr><tr><td>BSA en PBS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>900 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Composición del tampón de lisis de aislamiento de núcleos y del tampón de lavado.

Este artículo establece una línea para suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad de embriones de ratón gastrulados para la secuenciación de células individuales y núcleos.

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Investigación

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