Name: El implante DREAM: un sistema de implantes ligero, modular y rentable para la electrofisiología crónica en ratones de cabeza fija y de comportamiento libre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a utilizar el implante DREAM para electrofisiología crónica en ratones y macacos mediante tareas de realidad virtual. Este sistema modular y rentable facilita la grabación de actividad neuronal durante comportamientos naturalistas.

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Este trabajo contó con el apoyo del Consejo Holandés de Investigación (NWO; Programa Crossover 17619 "INTENSE", TS) y ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) en virtud del acuerdo de subvención nº 600925 (Neuroseeker, TS, FB, PT), así como de la Sociedad Max Planck.

Un sistema de implante de sonda rentable y versátil para electrofisiología en ratones

<ol><li>Epsztein, J., Brecht, M., Lee, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+determinants+of+hippocampal+CA1+place+and+silent+cell+activity+in+a+novel+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intracellular determinants of hippocampal CA1 place and silent cell activity in a novel environment.</a> Neuron. 70 (1), 109-120 (2011).</li>
<li>Okun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+coupling+of+neurons+to+populations+in+sensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Diverse coupling of neurons to populations in sensory cortex.</a> Nature. 521 (7553), 511-515 (2015).</li>
<li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).</li>
<li>Znamenskiy, P., Kim, M. -H., Muir, D. R., Iacaruso, M. F., Hofer, S. B., Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specificity+of+recurrent+inhibition+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional specificity of recurrent inhibition in visual cortex.</a> Neuron. 112 (6), 991-1000 (2024).</li>
<li>Rowland, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+activity+through+the+cortical+hierarchy+and+perception+are+determined+by+neural+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of activity through the cortical hierarchy and perception are determined by neural variability.</a> Nat Neurosci. 26 (9), 1584-1594 (2023).</li>
<li>Roth, M. M., Dahmen, J. C., Muir, D. R., Imhof, F., Martini, F. J., Hofer, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+nuclei+convey+diverse+contextual+information+to+layer+1+of+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamic nuclei convey diverse contextual information to layer 1 of visual cortex.</a> Nat Neurosci. 19 (2), 299-307 (2016).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256 (2022).</li>
<li>Demas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed%2C+cortex-wide+volumetric+recording+of+neuroactivity+at+cellular+resolution+using+light+beads+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed, cortex-wide volumetric recording of neuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy.</a> Nat Methods. 18 (9), 1103-1111 (2021).</li>
<li>Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+extracellular+fields+and+currents+EEG%2C+ECoG%2C+LFP+and+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin of extracellular fields and currents EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).</li>
<li>Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+brain+tissue+to+chronically+implanted+neural+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes.</a> J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).</li>
<li>Savya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+spatiotemporal+dynamics+of+astrocyte+reactivity+following+neural+electrode+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo spatiotemporal dynamics of astrocyte reactivity following neural electrode implantation.</a> Biomaterials. 289, 121784(2022).</li>
<li>Perge, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-day+signal+instabilities+affect+decoding+performance+in+an+intracortical+neural+interface+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Intra-day signal instabilities affect decoding performance in an intracortical neural interface system.</a> J Neural Eng. 10 (3), 036004(2013).</li>
<li>Pachitariu, M., Steinmetz, N., Kadir, S., Carandini, M., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilosort%3A+realtime+spike-sorting+for+extracellular+electrophysiology+with+hundreds+of+channels%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Kilosort: realtime spike-sorting for extracellular electrophysiology with hundreds of channels.</a> bioRxiv. , 061481(2016).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neuronal ensembles.</a> Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).</li>
<li>Kloosterman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+Drive+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: Drive fabrication.</a> J Vis Exp. (26), e1094(2009).</li>
<li>Jacobs, T., Darch, H., Holtzman, T., De Zeeuw, C. I., Romano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+operating+protocol%3A+Implantation+of+Cambrige+NeuroTech+chronic+silicon+probe+and+mini-amp-64+digital+headstage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Standard operating protocol: Implantation of Cambrige NeuroTech chronic silicon probe and mini-amp-64 digital headstage in mice.</a> Protocol Exchange. , (2023).</li>
<li>Juavinett, A. L., Bekheet, G., Churchland, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptable%2C+reusable%2C+and+light+implant+for+chronic+Neuropixels+probes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Kozai, T. D. Y., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tissue+responses+to+neural+implants+impact+signal+sensitivity+and+intervention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies.</a> ACS Chem Neurosci. 6 (1), 48-67 (2015).</li>
<li>Nguyen, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+array+for+chronic+in+vivo+recording%3A+tetrode+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-drive array for chronic in vivo recording: tetrode assembly.</a> J Vis Exp. (26), e1098(2009).</li>
<li>Biran, R., Martin, D. C., Tresco, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+loss+accompanies+the+brain+tissue+response+to+chronically+implanted+silicon+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell loss accompanies the brain tissue response to chronically implanted silicon microelectrode arrays.</a> Exp Neurol. 195 (1), 115-126 (2005).</li>
<li>Vöröslakos, M., Petersen, P. C., Vöröslakos, B., Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+microdrive+and+head+cap+system+for+silicon+probe+recovery+in+freely+moving+rodent%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Metal microdrive and head cap system for silicon probe recovery in freely moving rodent.</a> eLife. 10, e65859(2021).</li>
<li>IMEC Neuropixels 1.0 User Manual V1.0.8. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neuropixels.org/_files/ugd/328966_ca209d53ffb346b3bf98be39b903efa9.pdf">https://www.neuropixels.org/_files/ugd/328966_ca209d53ffb346b3bf98be39b903efa9.pdf</a> (2023).</li>
<li>Baranauskas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotube+composite+coating+of+neural+microelectrodes+preferentially+improves+the+multiunit+signal-to-noise+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotube composite coating of neural microelectrodes preferentially improves the multiunit signal-to-noise ratio.</a> J Neural Eng. 8 (6), 066013(2011).</li>
<li>Niell, C. M., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+visual+responses+by+behavioral+state+in+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of visual responses by behavioral state in mouse visual cortex.</a> Neuron. 65 (4), 472-479 (2010).</li>
<li>Okun, M., Carandini, M., Harris, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+immobile+silicon+probes+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with immobile silicon probes in the mouse cortex.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-drive+and+headgear+for+chronic+implant+and+recovery+of+optoelectronic+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes.</a> Sci Rep. 7 (1), 2773(2017).</li>
<li>Bimbard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptable%2C+reusable%2C+and+light+implant+for+chronic+Neuropixels+probes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An adaptable, reusable, and light implant for chronic Neuropixels probes.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
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<li>Neuronexus Products - dDrive. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neuronexus.com/products/accessories/microdrives/ddrive/">https://www.neuronexus.com/products/accessories/microdrives/ddrive/</a> (2024).</li>
<li>van Daal, R. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+Neuropixels+probes+for+chronic+recording+of+neuronal+activity+in+freely+behaving+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Implantation of Neuropixels probes for chronic recording of neuronal activity in freely behaving mice and rats.</a> Nat Protoc. 16 (7), 3322-3347 (2021).</li>
<li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+behavioral+experiments+in+head-fixed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice.</a> PLoS One. 9 (2), e88678(2014).</li>
<li>Groblewski, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+head-fixation+system+for+performing+large-scale%2C+in+vivo+physiological+recordings+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A standardized head-fixation system for performing large-scale, in vivo physiological recordings in mice.</a> J Neurosci Methods. 346, 108922(2020).</li>
<li>Vasilev, D., Raposo, I., Totah, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brightness+illusions+evoke+pupil+constriction+preceded+by+a+primary+visual+cortex+response+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Brightness illusions evoke pupil constriction preceded by a primary visual cortex response in rats.</a> Cereb Cortex. 33 (12), 7952-7959 (2023).</li>
</ol>

TS, AN y MNH son cofundadores de 3Dneuro B.V., que fabrica los microdrives de código abierto y las coronas de Faraday utilizados en este protocolo. FB y PT forman parte del consejo asesor científico de 33Dneuro B.V. FB y PT no reciben ninguna compensación económica por este puesto.

Este manuscrito presenta un protocolo para la implantación rápida, segura y estandarizada de sondas, que también permite la recuperación y reutilización de la sonda al final del experimento. El enfoque hace uso de un sistema modular de componentes del implante, específicamente un microdrive, que es compatible con todas las sondas de silicona y sistemas de registro comunes, una placa de cabeza que se puede usar para experimentos de comportamiento con la cabeza fija y una jaula de Faraday portátil para proteger el implante. Esta constelación permite a los usuarios adaptar de forma flexible su implante a diferentes paradigmas experimentales, como el comportamiento fijo en la cabeza frente al comportamiento de movimiento libre o la miniaturización del implante (sin jaula de Faraday) frente a una mayor robustez de la señal a largo plazo (con la jaula de Faraday), sin tener que sacrificar la estandarización del implante en el proceso.
Este enfoque hace que los registros electrofisiológicos crónicos sean más estandarizados (a través de elementos prefabricados que no requieren ensamblaje a mano), menos costosos (a través de la recuperación de la sonda), menos lentos (al simplificar los pasos quirúrgicos) y más fácilmente compatibles con el bienestar y el comportamiento animal (a través de la disminución del tamaño del implante y la fijación de la cabeza sin estrés). Como tal, este protocolo tiene como objetivo hacer que los implantes electrofisiológicos en roedores que se comportan sean alcanzables para una gama más amplia de investigadores más allá de los laboratorios pioneros a la vanguardia del campo.
Para lograr este objetivo, el protocolo presentado aquí minimiza el equilibrio entre varios aspectos a menudo igualmente cruciales de los implantes de microdrive, a saber, la flexibilidad, la modularidad, la facilidad de implantación, la estabilidad, el costo general, la compatibilidad con el comportamiento y la reutilización de la sonda. En la actualidad, los enfoques disponibles a menudo sobresalen en algunos de estos aspectos, pero a un alto costo para otras características. Por ejemplo, para casos de uso que exigen una estabilidad absoluta del implante durante largos períodos de tiempo, el mejor enfoque de implante puede ser cementar directamente la sonda sobre el cráneo25. Sin embargo, esto también evita la reutilización de la sonda, así como el reposicionamiento de los sitios de grabación en caso de mala calidad de grabación, y es incompatible con la colocación de implantes estandarizados. Del mismo modo, si bien la unidad AMIE proporciona una solución ligera y de bajo coste para la implantación recuperable de sondas, está limitada a sondas individuales y restringida en la ubicación de las coordenadas objetivo17. En el extremo opuesto del espectro, algunos nano-motores disponibles comercialmente (ver Tabla 1 16,17,21,26,27,28,29,30) son extremadamente pequeños, pueden colocarse libremente en el cráneo y maximizar el número de sondas que se pueden implantar en un solo animal 16. Sin embargo, son caros en comparación con otras soluciones, requieren que los experimentadores estén altamente capacitados para realizar cirugías de implantes exitosas y prohíben la reutilización de la sonda. El microdrive desarrollado por Vöröslakos et al.21, cuya versión ligera también forma parte de este protocolo, sacrifica el tamaño pequeño del implante para mejorar la facilidad de uso, el menor precio y la reutilización de la sonda
Tabla 1: Comparación de estrategias populares para implantes de sondas crónicas en roedores. Disponibilidad: si el microdisco es de código abierto (para que los investigadores lo construyan por sí mismos), disponible comercialmente o ambos. Modularidad: Los sistemas integrados constan de uno o pocos componentes que están en una relación fija entre sí, mientras que los sistemas modulares permiten la colocación libre de la sonda/micromotor en relación con la protección (cabezal/jaula de Faraday) después de la producción del implante (por ejemplo, en el momento de la cirugía). La modularidad se determinó a partir de la información publicada o de los protocolos de implantación de los implantes enumerados. Headfix: Sí: El implante tiene mecanismos de fijación de la cabeza integrados en su diseño, X: El implante deja espacio para agregar una placa de cabeza adicional para la fijación sin grandes problemas, No: El diseño del implante probablemente crea problemas de espacio o requiere modificaciones sustanciales en el diseño para su uso con fijación de la cabeza. Colocación de la sonda: Restringida: La ubicación de la sonda es limitada en la etapa de diseño del implante. Flexible: La ubicación de la sonda se puede ajustar incluso durante la cirugía. Número de sondas: el número de sondas que se pueden implantar. Tenga en cuenta que implantar sondas >2 en un ratón plantea un desafío significativo independientemente del sistema de implante elegido. Reutilización de sondas: sí, si las sondas pueden, en teoría, reutilizarse. Peso/tamaño: peso y volumen del implante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Para crear un sistema que concilie estos diferentes requisitos de forma más fluida, el implante DREAM se diseñó sobre la base del implante Vöröslakos21, pero con varias modificaciones fundamentales. En primer lugar, para reducir el peso total del implante, el microdrive utilizado aquí se fabrica en aluminio mecanizado en lugar de acero inoxidable impreso en 3D, y la corona de Faraday está miniaturizada, logrando una reducción de peso total de 1,2-1,4 g dependiendo de la elección del material de la placa principal (consulte la tabla 2). En segundo lugar, la placa de cabeza que rodea el microdrive fue diseñada para permitir un mecanismo de fijación de la cabeza integrado que permite una fijación rápida y sin estrés, al tiempo que funciona como base para la jaula de Faraday, dando acceso a la mayoría de las áreas objetivo potenciales para las grabaciones neuronales y agregando solo un peso mínimo al implante. La forma plana del mecanismo de fijación y la ausencia de protuberancias también aseguran un deterioro mínimo del campo visual o la locomoción de los animales (ver Figura 2A-C), una clara mejora con respecto a los sistemas anteriores31,32. La corona y el anillo de Faraday que están fijados a la placa principal también se modificaron sustancialmente en comparación con los diseños anteriores. Ahora no requieren ninguna adaptación ad-hoc (por ejemplo, en términos de colocación de conectores) o soldadura durante toda la cirugía, lo que elimina las posibles causas de daño del implante y la variación impredecible en la calidad del implante. En cambio, el implante DREAM proporciona múltiples variaciones estandarizadas del anillo de corona que permiten colocar cada conector en una de las cuatro posiciones predefinidas, minimizando la variabilidad y el esfuerzo durante la cirugía. Por último, al optimizar el sistema de implantes para la recuperación de la sonda, el implante DREAM permite a los experimentadores reducir drásticamente el coste y el tiempo de preparación por implante, ya que el micromotor y la sonda pueden recuperarse, limpiarse y reutilizarse juntos.
Para obtener una visión más exhaustiva de las ventajas y desventajas que plantean los diferentes sistemas de implantes, consulte la Tabla 1. Si bien el enfoque presentado aquí generalmente no proporciona el máximo rendimiento en comparación con todas las demás estrategias, por ejemplo, en términos de tamaño, estabilidad o costo, opera en el rango superior en todos estos parámetros, lo que lo hace más fácilmente aplicable a una amplia gama de experimentos.
Tres aspectos del protocolo son particularmente cruciales para adaptarlo a cada caso de uso específico: la constelación de tierra y referencia, la técnica para cementar el microdrive y la validación del implante a través de la grabación neuronal. En primer lugar, al implantar los pines de tierra y de referencia, el objetivo era identificar el punto óptimo entre la estabilidad mecánica/eléctrica y la invasividad. Si bien, por ejemplo, los alambres de plata flotantes incrustados en agar son menos invasivos que los tornillos óseos33, es probable que sean más propensos a desprenderse con el tiempo. El uso de clavijas, junto con el agar, garantiza una conexión eléctrica estable y, al mismo tiempo, tiene la ventaja de ser más fácil de controlar durante la inserción, evitando traumatismos tisulares. Es poco probable que los clavos de tierra cementados al cráneo se desprendan, y en el caso de que el cable se separe del clavo, la reconexión suele ser sencilla debido a la mayor superficie y la estabilidad del clavo implantado.
Tabla 2: Comparación de los pesos de los componentes entre el implante DREAM y el implante descrito por Vöröslakos et al.21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Table%202.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
En segundo lugar, la cementación del microimpulsor generalmente debe ocurrir antes de la inserción de la sonda en el cerebro. Esto evita el movimiento lateral de la sonda dentro del cerebro si el micromotor no está perfectamente fijado en el soporte estereotáctico durante la inserción. Para comprobar la ubicación de la sonda antes de cementar el micromotor en su lugar, se puede bajar brevemente la punta del vástago de la sonda para determinar dónde entrará en contacto con el cerebro, ya que extrapolar la posición de aterrizaje puede ser difícil dado el cambio de paralaje del microscopio. Una vez establecida la posición del microdrive, se puede proteger opcionalmente la craneotomía con elastómero de silicona antes de cementar el microdrive para garantizar que el cemento no entre accidentalmente en contacto con la craneotomía; Sin embargo, no se recomienda bajar la sonda a través del elastómero de silicona, ya que los residuos de elastómero de silicona pueden entrar en el cerebro y causar inflamación y gliosis.
En tercer lugar, dependiendo del protocolo experimental utilizado, un registro de la prueba directamente después de la cirugía puede ser útil o no. En gran medida, la actividad neuronal registrada justo después de la inserción de la sonda no será directamente representativa de la actividad registrada crónicamente, debido a factores como la hinchazón transitoria del cerebro y el movimiento del tejido alrededor de la sonda, lo que significa que es poco probable que tanto la profundidad de inserción como las formas de onda de los picos se estabilicen directamente. Como tal, las grabaciones inmediatas pueden servir principalmente para determinar la calidad general de la señal y la integridad del implante. Se recomienda utilizar el trineo móvil de microimpulsión en los días posteriores a la cirugía, una vez que el cerebro se haya estabilizado para ajustar la posición. Esto también ayuda a evitar que la sonda se mueva más de 1000 μm por día, lo que minimiza el daño al sitio de registro y, por lo tanto, mejora la longevidad del sitio de registro.
Por último, es posible que los usuarios deseen adaptar el sistema para grabar desde más de una ubicación de destino. Como este sistema es modular, el usuario tiene mucho margen de maniobra sobre cómo ensamblar y colocar los componentes en relación entre sí (ver arriba y la Figura complementaria 3 y la Figura complementaria 4). Esto incluye modificaciones que permitirían montar una lanzadera extendida horizontalmente en el microaccionamiento, lo que permitiría implantar múltiples sondas o grandes sondas de vástago múltiple, así como la implantación de múltiples microaccionamientos individuales (consulte la Figura complementaria 3 y la Figura complementaria 4). Dichas modificaciones solo requieren el uso de un anillo de corona adaptado, con un mayor número de zonas de montaje para conectores/placas de interfaz/cabeceras. Sin embargo, las limitaciones de espacio de este diseño están dictadas por el modelo animal, en este caso, el ratón, lo que hace que el apilamiento de varias sondas en un microdisco sea más atractivo en términos de espacio que la implantación de varios microdiscos de forma independiente entre sí. Los microaccionamientos utilizados aquí pueden soportar sondas apiladas y, por lo tanto, la única limitación real es el número de cabeceras o conectores que pueden ajustarse a las restricciones de espacio y peso definidas por el modelo animal. Los espaciadores también se pueden utilizar para aumentar aún más las rutas de montaje e inserción no verticales.
En conclusión, este protocolo permite la implantación económica, ligera y, lo que es más importante, ajustable de una sonda, con la ventaja añadida de un diseño de microaccionamiento que prioriza la recuperación de la sonda. Esto aborda los problemas del costo prohibitivo de las sondas de un solo uso, la alta barrera de las habilidades quirúrgicas y de implantación, así como el hecho de que las soluciones comerciales para la implantación crónica a menudo son difíciles de adaptar a casos de uso únicos. Estos problemas plantean un punto débil para los laboratorios que ya utilizan electrofisiología aguda y un elemento disuasorio para aquellos que aún no realizan experimentos de electrofisiología. Este sistema tiene como objetivo facilitar la adopción más amplia de la investigación en electrofisiología crónica más allá de estas limitaciones.

<a href="https://app.jove.com/t/6665">This corrects</a> the article <a href="https://https://dx.doi.org/10.3791/66867">10.3791/66867</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66867">The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice

La electrofisiología con sondas de silicio implantadas crónicamente se ha convertido en una poderosa técnica para investigar la actividad neuronal y la conectividad en animales que se comportan, particularmente en ratones, debido a su manejabilidad genética y experimental1. Las sondas laminares de silicio, en particular, han demostrado ser una herramienta invaluable para identificar relaciones funcionales dentro de las columnas corticales2 y para relacionar la dinámica de grandes poblaciones neuronales con el comportamiento de una manera que antes era imposible3.
Dos enfoques complementarios son los estándares de oro actuales para registrar la actividad neuronal in vivo: la microscopía de dos fotones 4,5 y la electrofisiología extracelular6. La elección de la metodología de registro restringe la naturaleza de las lecturas que se pueden obtener: la microscopía de dos fotones es particularmente adecuada para estudios longitudinales de neuronas identificables individualmente en grandes poblaciones a lo largo del tiempo, pero sufre altos costos de equipo y se limita a capas superficiales de la corteza en cerebros intactos. Además, la resolución temporal típica de ~30 Hz limita su capacidad para capturar la dinámica neuronal en curso 7,8.
Por el contrario, los registros electrofisiológicos ofrecen una alta resolución temporal (hasta 40 kHz) para rastrear la actividad neuronal momento a momento, se pueden aplicar ampliamente a todas las especies, así como a través de profundidades corticales, y tienen configuraciones de costo relativamente bajo en comparación con la microscopía de dos fotones. Sin embargo, la identificación de neuronas individuales, así como el seguimiento longitudinal de las poblaciones neuronales, son difíciles de lograr. Esto se aplica especialmente a los electrodos de hilo, por ejemplo, tetrodos, y a las inserciones agudas de electrodos. Además de carecer de la capacidad de rastrear las neuronas a lo largo de las sesiones de grabación9, las inserciones agudas repetidas causan un trauma local10 que monta una respuesta inmune11, aumentando la posibilidad de infección y gliosis. En última instancia, esto reduce la estabilidad de la actividad neuronal registrada y la esperanza de vida de los animales de experimentación, limitando el alcance de los estudios longitudinales con registros electrofisiológicos agudos a solo unos pocos días12.
Las grabaciones crónicas de sondas de silicio de alta densidad tienen como objetivo combinar algunos de los mejores atributos de la electrofisiología aguda y las imágenes de dos fotones. Pueden rastrear la dinámica de la población neuronal a lo largo de las sesiones, con solo una capacidad algo menor para identificar neuronas individuales en comparación conlas imágenes de dos fotones. Estas grabaciones proporcionan una gran flexibilidad en la ubicación espacial y una resolución temporal precisa de las señales registradas, así como una mayor longevidad y bienestar de los animales de experimentación en comparación con las grabaciones agudas14. Además, a diferencia de los registros agudos, la electrofisiología crónica requiere un solo evento de implantación, lo que reduce eficazmente el riesgo de infección y daño tisular y minimiza el estrés en los animales15. En conjunto, estas ventajas hacen que la electrofisiología crónica sea una herramienta poderosa para investigar la organización y función del sistema nervioso.
Sin embargo, las técnicas de implantación crónica comúnmente utilizadas para ratones obligan a los investigadores a hacer concesiones significativas entre la compatibilidad con los registros de comportamiento, el peso del implante, la replicabilidad de los implantes, los costos financieros y la facilidad general de uso. Muchos protocolos de implantes no están diseñados para facilitar la reutilización de las sondas16, lo que aumenta considerablemente el costo efectivo de los experimentos individuales y, por lo tanto, dificulta financieramente que algunos laboratorios utilicen la electrofisiología crónica. También suelen requerir un extenso trabajo interno de creación de prototipos y diseño, para el que es posible que no se disponga de la experiencia y los recursos.
Por otro lado, los sistemas de implantes integrados17 ofrecen una solución más accesible para la electrofisiología crónica en roedores. Estos sistemas están diseñados para integrar un microdrive que sostiene la sonda con el resto del implante para simplificar el manejo del implante y los procedimientos quirúrgicos. Sin embargo, una vez implantados, estos sistemas pueden ser pesados en la parte superior y limitar la capacidad del experimentador para adaptar de forma flexible un experimento a diferentes coordenadas objetivo. A menudo, su peso impide los implantes en animales más pequeños, potencialmente perjudica el movimiento de los animales e induce estrés18. Esto puede afectar de manera desproporcionada la investigación en cohortes juveniles y femeninas, ya que es más probable que las limitaciones de peso afecten a estos grupos.
Además, no todos los sistemas integrados permiten el ajuste de las posiciones de los electrodos después de la implantación. Esto es relevante, ya que la gliosis o cicatrización debida a la inserción de la sonda19, especialmente en las primeras 48 h después de la implantación20, puede reducir la calidad de la actividad neuronal registrada. Los microajustes en la profundidad de inserción de la sonda pueden limitar estos efectos negativos en la integridad de la señal. Por lo tanto, los mecanismos de microposicionamiento, comúnmente llamados microdrives, pueden ser beneficiosos incluso en sondas con un gran número de electrodos distribuidos a lo largo de su longitud.
Para superar estas compensaciones, presentamos un novedoso sistema de implantes de electrofisiología crónica para ratones que aborda las limitaciones de los diseños anteriores al ofrecer una solución ligera, rentable y modular. El sistema de implante DREAM está diseñado para pesar menos del 10% (~2,1 g) del peso corporal típico de un ratón, lo que garantiza el bienestar animal y un impacto mínimo en el comportamiento. La validación del diseño del implante DREAM muestra un impacto mínimo en las métricas clave del comportamiento, como la locomoción, que puede verse significativamente afectada en los roedores cuando se colocan cargas en el cráneo. Esto puede beneficiar a los paradigmas experimentales que utilizan animales que se mueven libremente, así como animales con la cabeza fija, al aumentar el bienestar animal y permitir experimentos más sólidos desde el punto de vista etológico.
El sistema incluye un microaccionamiento para un ajuste flexible de la profundidad de registro de hasta 7 mm y se puede adaptar a diferentes tipos de sondas y dispositivos de registro, proporcionando a los investigadores una herramienta rentable y versátil para diversas aplicaciones experimentales. El sistema se combina de forma rutinaria con un microdrivemetálico 21, que ofrece una recuperación constante de la sonda en comparación con otros sistemas (tasa de recuperación media esperada: aprox. tres reutilizaciones fiables por sonda) y reduce drásticamente el coste de los experimentos individuales.
El diseño cuenta con una jaula protectora de Faraday impresa en 3D, lo que permite una protección barata pero robusta contra el ruido electrofisiológico, los impactos mecánicos y los materiales infecciosos, lo que permite grabaciones estables y sin ruido que sufren tasas de infección mínimas. Esta jaula implantable consta de la llamada "corona", diseñada para la protección contra impactos y para proporcionar estructura para el recubrimiento de malla metálica conductora de la jaula de Faraday, y el anillo de corona, que sirve como soporte para un amplificador implantable y/o un conector de sonda (ver Figura 1).
Por último, las placas de cabeza incluidas en el sistema de implante modular están diseñadas para ser compatibles con un sistema de fijación de cabeza novedoso y eficiente sin añadir volumen adicional al implante. A diferencia de otros sistemas existentes, no requiere apretar pequeños tornillos cerca del implante, lo que acelera la fijación de los ratones en la configuración experimental y mejora la relación experimentador-animal, así como la adherencia al comportamiento. Al mismo tiempo, la placa de cabeza se utiliza como base sobre la que construir los otros módulos del sistema de electrofisiología crónica DREAM.
Los archivos de diseño para el implante DREAM se publican como hardware de código abierto en https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/. En las siguientes secciones, se describirá el diseño y la fabricación del sistema de implantes DREAM, se demostrará su implementación exitosa en un modelo de ratón y se discutirán sus posibles aplicaciones y ventajas en comparación con los sistemas existentes.

<table><tbody><tr><td>Vaso de cola de soldadura de 0,05"</td><td>Mill-Max</td><td>853-93-100-10-001000</td><td></td></tr><tr><td>1,1'-dioctadecil-3,3,3',3' - Perclorato tetrametilindocarbocianino reactivo ('DiI'; DiIC18(3))</td><td>ThermoFisher</td><td>D282</td><td>Tinte lipofílico utilizado para facilitar la verificación histológica de la ubicación de la sonda</td></tr><tr><td>Masilla adhesiva (Blu-Tack)</td><td>Bostik</td><td>308590110</td><td>Las variaciones (por ejemplo, de Pritt) deberían estar disponibles en tu papelería</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296</td><td>Haz con solución salina para la conductividad.</td></tr><tr><td>Amplificador (Miniamp-64)</td><td>Cambridge Neurotech</td><td></td><td>Amplificador y digitalizador miniatura e implantable. Es posible usar un digitalizador implantable alternativo o un conector Omnetics implantable.</td></tr><tr><td>Crema analgésica (EMLA Cream)</td><td>Aspen</td><td>39699/0088</td><td>Crema analgésica utilizada para el dolor operatorio que contiene prilocaína, lidocaína.</td></tr><tr><td>Espaciador en ángulo</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>Separador inclinado para montaje no perpendicular de accionamiento... Open souce, también disponible en https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/</td></tr><tr><td>LED de curado de luz azul</td><td>B.A. Internacional</td><td>818223</td><td>Luz de curado para polimerización de imprimación. Longitud de onda de 420-480 nm</td></tr><tr><td>Cera ósea</td><td>SMI</td><td>Z046</td><td>Cera para proteger la craneotomía y la sonda tras la cirugía.</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Elanco Europe LTD</td><td>401513</td><td>Solución inyectable de buprenorfina (0,3 mg/mL)</td></tr><tr><td>Malla de cobre</td><td>Dexmet</td><td>3CU6-050FA</td><td>Malla de cobre utilizada para proteger eléctrica y físicamente la sonda y la craneotomía.</td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato (Loctite)</td><td>Loctite</td><td>1363589</td><td>Pegamento gel de cianoacrilato</td></tr><tr><td>Cemento dental (SuperBond C&; B)</td><td>Sun Medical</td><td>K058E</td><td>Cemento dental (SuperBond)</td></tr><tr><td>Crema de depilación (Veet)</td><td>Veet</td><td>310000091434</td><td>Crema depilatoria para la eliminación del vello alrededor de la zona quirúrgica.</td></tr><tr><td>Enrofloxacina (Baytril)</td><td>Elanco Europe LTD</td><td>00879/4117</td><td>Solución inyectable de enrofloxacina (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>Corona de Faraday</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>Jaula protectora implantable impresa en 3D. Open souce, también disponible en https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/</td></tr><tr><td>Anillo de Faraday</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>Anillo protector implantable impreso en 3D para jaula de Faraday. Open souce, también disponible en https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/</td></tr><tr><td>Esponja hemostática</td><td>SMI</td><td>ZHG101010</td><td>Esponja hemostática de gelatina absorbible</td></tr><tr><td>Tubería termoretráctil</td><td>HellermannTyton</td><td>TA32-9/3 BK</td><td>Tubo termoretráctil para fabricar pinzas de punta blanda</td></tr><tr><td>Yodo</td><td>Braunol</td><td>9322507</td><td>Solución acuosa de povidona-yodo.</td></tr><tr><td>Metamizole (Novalgin)</td><td>Sanofi-Aventis Gmbh</td><td>4527098</td><td>Metamizol inyectable (500mg/mL)</td></tr><tr><td>Metamizole (Novalgin)</td><td>Sanofi-Aventis Gmbh</td><td>1553758</td><td>Solución de metamizole</td></tr><tr><td>Microdrive (R2Drive)</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>Microimpulsor metálico recuperable con lanzadera móvil. Fuente abierta, también disponible en https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310-100ML</td><td>Aceite utilizado como disolvente para crear gel protector para craneotomías.</td></tr><tr><td>Toallitas que no desprenden (Kimtech)</td><td>Kimtech</td><td>7552</td><td>Toallitas anti-desprendimiento</td></tr><tr><td>Introducción</td><td>Bisco</td><td>B-7202P</td><td>Adhesivo universal para calaveras que evita que la humedad deteriore el cemento y proporciona una base sólida sobre la que formar el cemento.</td></tr><tr><td>Soporte R2Drive</td><td>3DNeuro</td><td></td><td>Accesorio estereotáxico para montar R2Drive. Fuente abierta, también disponible en https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/</td></tr><tr><td>Envoltura autoadherente</td><td>3M</td><td>VB050</td><td>Vendaje protector para implante tras la cirugía</td></tr><tr><td>Sonda de silicio (H2)</td><td>Cambridge Neurotech</td><td></td><td>Sonda lineal de silicio crónicamente implantable con 32 canales. Es posible usar una sonda alternativa.</td></tr><tr><td>Elastómero de silicona (Duragel)</td><td>Cambridge Neurotech</td><td></td><td>Elastómero de silicona</td></tr><tr><td>Escayola de silicona (Kwikcast)</td><td>WPI</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr><tr><td>Epoxi conductor de plata</td><td>MG Chemicals</td><td>8331D-14G</td><td>Epoxi de plata</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont tamaño 5</td><td>FSTools</td><td>11251-10</td><td>Pinzas pequeñas para levantar el colgajo óseo.</td></tr><tr><td>Alambre de acero inoxidable, recubierto de teflón</td><td>Productos Científicos GmBH</td><td>SS-3T</td><td>Cable de tierra</td></tr><tr><td>Estereotaxia (tracción trasera)</td><td>RWD</td><td>68803</td><td>Estereostaxia para procedimientos quirúrgicos en ratones.</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Alconox</td><td>1304</td><td>Un posible limpiador enzimático para limpiar la sonda</td></tr><tr><td>Resina epoxi de endurecimiento rápido de dos partes</td><td>Gorila</td><td>EP3</td><td>Epoxi para la unión permanente de las partes del implante DREAM.</td></tr><tr><td>Tijeras de muelle Vannas con mango redondo</td><td>FSTools</td><td>15403-08</td><td>Tijeras veterinarias de rebote de resorte con punta recta de 0,075 mm.</td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato veterinario (Vetbond)</td><td>3M</td><td>70-0068-5256-3</td><td>Cola de cianoacrilato veterinaria</td></tr></tbody></table>

el implante dream: un sistema de implantes ligero, modular y rentable para la electrofisiología crónica en ratones de cabeza fija y de comportamiento libre

The DREAM Implant: A Lightweight, Modular, and Cost-Effective Implant System for Chronic Electrophysiology in Head-Fixed and Freely Behaving Mice

Los registros electrofisiológicos crónicos en roedores han mejorado significativamente nuestra comprensión de la dinámica neuronal y su relevancia conductual. Sin embargo, los métodos actuales para implantar sondas de forma crónica presentan grandes compensaciones entre el costo, la facilidad de uso, el tamaño, la adaptabilidad y la estabilidad a largo plazo.
Este protocolo introduce un novedoso sistema de implante de sonda crónica para ratones llamado DREAM (Dinámico, Recuperable, Económico, Adaptable y Modular), diseñado para superar las compensaciones asociadas con las opciones disponibles actualmente. El sistema proporciona una solución ligera, modular y rentable con elementos de hardware estandarizados que pueden combinarse e implantarse en pasos sencillos y explantarse de forma segura para la recuperación y la reutilización múltiple de sondas, lo que reduce significativamente los costes experimentales.
El sistema de implantes DREAM integra tres módulos de hardware: (1) un microdrive que puede transportar todas las sondas de silicona estándar, lo que permite a los experimentadores ajustar la profundidad de grabación a lo largo de una distancia de recorrido de hasta 7 mm; (2) un diseño tridimensional (3D) imprimible en código abierto para una jaula de Faraday portátil cubierta con malla de cobre para blindaje eléctrico, protección contra impactos y colocación de conectores, y (3) un sistema de fijación de la cabeza miniaturizado para mejorar el bienestar animal y la facilidad de uso. El protocolo quirúrgico correspondiente se optimizó para la velocidad (duración total: 2 h), la seguridad de la sonda y el bienestar animal.
Los implantes tuvieron un impacto mínimo en el repertorio conductual de los animales, fueron fácilmente aplicables en contextos de movimiento libre y con la cabeza fija, y proporcionaron formas de onda de pico claramente identificables y respuestas neuronales saludables durante semanas de recopilación de datos posteriores al implante. Las infecciones y otras complicaciones quirúrgicas fueron extremadamente raras.
Como tal, el sistema de implantes DREAM es una solución versátil y rentable para la electrofisiología crónica en ratones, que mejora el bienestar animal y permite experimentos más sólidos desde el punto de vista etológico. Su diseño simplifica los procedimientos experimentales en diversas necesidades de investigación, aumentando la accesibilidad de la electrofisiología crónica en roedores a una amplia gama de laboratorios de investigación.

Este protocolo presenta un sistema de implantación crónica que permite a los investigadores implementar registros de electrofisiología crónica ligeros, rentables y seguros en ratones que se comportan (Figura 1). Los principales factores que determinan la aplicación exitosa de este enfoque incluyen: cobertura completa de cemento del cráneo, una craneotomía mínimamente invasiva y debidamente protegida, la fijación segura del micromotor y el cableado al cráneo y la continuidad completa del material protector de Faraday. Cuando se tienen en cuenta estos puntos, se pueden alcanzar grabaciones de alta calidad de manera consistente. Aquí se muestran resultados representativos relacionados con los siguientes aspectos principales del éxito quirúrgico:
1) ¿El implante interfiere con el comportamiento o el bienestar de los animales? 2) ¿La calidad de la señal es alta y se pueden mantener durante períodos prolongados de tiempo? 3) ¿Se pueden combinar fácilmente las grabaciones con el rendimiento de las tareas?
Para evaluar el impacto del implante en el comportamiento animal, analizamos los patrones de locomoción rastreados en cinco animales implantados. La Figura 2A muestra un ejemplo de un animal que se mueve libremente dentro de una jaula de juego durante 10 minutos antes y 1 semana después del implante. Uno puede ver que los patrones de movimiento no han cambiado. Esta observación se confirma con la Figura 2B, C , que muestra las distribuciones de las velocidades de movimiento y las direcciones de la cabeza entre los animales. Tanto la velocidad de carrera como las direcciones de la cabeza se mantuvieron prácticamente sin cambios antes y después de la implantación y, en todo caso, las velocidades de carrera parecían estar ligeramente elevadas después de la cirugía. El video complementario 1 muestra una breve grabación de video de un animal 6 días después de la cirugía de implantación. Los comportamientos típicos de la jaula en el hogar, como la locomoción, el acicalamiento, la crianza y la búsqueda de alimento en el entorno del hogar, son visibles e indican una recuperación exitosa de la cirugía, así como la salud general. Lo más probable es que el bajo impacto conductual del implante se deba a su bajo peso y altura manejable.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig02.jpg"> Figura 2: Locomoción antes y después de la cirugía. (A) Ejemplo de locomoción de un animal antes (panel izquierdo) y después (panel derecho) de la implantación. Las coordenadas x/y están en centímetros, los puntos muestran la posición del animal en cada punto de tiempo durante un período de 10 min. (B) Distribución de las velocidades de movimiento en cm/s durante 5 sesiones antes y 3 sesiones después de la implantación en 5 animales. (C) Densidad del kernel para probabilidad de movimiento en diferentes direcciones, para las mismas sesiones analizadas en (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
A continuación, se evalúa la calidad de la señal en el potencial de campo local (LFP) y la actividad de aumento en los sitios de grabación. Aquí, mostramos datos representativos de registros corticales en la corteza visual primaria (V1). Para la validación, se extrajo la actividad putativa de una sola unidad de las señales neuronales de banda ancha registradas en V1 de un ratón despierto utilizando Kilosort 3 (ver Figura 3). La Figura 3A muestra la ubicación de las unidades individuales extraídas en el vástago de la sonda, la Figura 3B muestra las formas de onda de pico correspondientes y la Figura 3C muestra las respuestas de pico de las mismas neuronas a un protocolo de densidad de fuente de corriente (CSD). En este paradigma, los destellos de campo amplio se presentaron con una duración de 300 ms a una frecuencia de 1 Hz (es decir, 300 ms encendidos, 700 ms apagados) durante 200 ensayos. Finalmente, la Figura 3D muestra las respuestas de las mismas unidades a un protocolo de mapeo de campo receptivo visual, que consta de 2000 fotogramas de cuadrados blancos y negros seleccionados al azar sobre un fondo gris, y cada uno presentado durante 16,6 ms. Los cuadrados cubrían 12 grados de ángulo visual cada uno y se seleccionaron de un campo de 15 x 5 ubicaciones posibles, de modo que el paradigma de mapeo cubrió un espacio visual de -90 a +90 grados de acimut y de -30 a +40 grados de elevación en total. Las respuestas de la velocidad de disparo a cada marco de estímulo se extrajeron analizando la velocidad máxima de disparo en una ventana de 16,6 ms, sujeta a un retraso de entre 40 y 140 ms, identificada como óptima por canal en función de la actividad máxima en cada ventana. Este tipo de registro se puede utilizar para guiar el ajuste de la profundidad de inserción de cada electrodo y para evaluar la calidad de la señal después de la cirugía de implante.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig03.jpg"> Figura 3: Señales neuronales registradas. (A) Ubicación inferida de unidades individuales clasificadas por el paquete de clasificación de picos Kilosort 3 a lo largo de los contactos de electrodos de la sonda. (B) Formas de onda de pico para las mismas unidades que se muestran en A a lo largo de 5 ms de tiempo. Líneas finas: Formas de onda de pico individuales. Líneas gruesas: Forma de onda de pico promedio. (C) Diagrama ráster de picos en respuesta a un paradigma de densidad de fuente de corriente (CSD) que presenta destellos de campo amplio de 300 ms seguidos de una pantalla negra de 700 ms. Las respuestas se muestran para las mismas unidades que en A y B. Las líneas de colores superpuestas representan histogramas de tiempo peri-estímulo (PSTH) de las mismas respuestas. Las velocidades de disparo de los PSTH se calcularon en intervalos de 10 ms y luego se normalizaron mediante la velocidad de disparo máxima en todo el PSTH. El tiempo 0 se centra en el estímulo del flash de campo amplio. (D) Campos receptivos estimados de las mismas unidades que en A-C, medidos por un paradigma de Mapeo de Campo Receptivo de Ruido Disperso. Cada gráfico muestra la actividad media de la tasa de disparo durante una ventana de análisis de 16,6 ms en respuesta al inicio (panel izquierdo) o al desplazamiento (panel derecho) de los estímulos cuadrados blancos y negros. Los estímulos se presentaron durante 16,6 ms, ubicados aleatoriamente en una cuadrícula cuadrada de 5 x 15 que abarcaba 180 grados de ángulo visual horizontalmente y 70 grados de ángulo visual vertical. La actividad de la velocidad de disparo se puntuó z en toda la cuadrícula de campo receptivo (ver barra de colores). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La calidad de la grabación se mantuvo alta en las grabaciones repetidas durante semanas o meses. La Figura 4A muestra los registros longitudinales de LFP de un animal durante 15 semanas. Las LFP se registraron en respuesta al paradigma de CSD descrito anteriormente (véase la Figura 3A-C). La Fig. 4A muestra las respuestas medias de la LFP 500 ms después del inicio del flash. En este ejemplo, utilizamos una sonda lineal con 32 canales, con una distancia entre electrodos de 25 μm. Tenga en cuenta que el día 18, se ajustó la profundidad de la sonda, desplazando la sonda hacia abajo en 600 μm. Tanto antes como después de este ajuste, las señales de LFP se mantuvieron estables a lo largo de los días de registro.
De acuerdo con esto, las formas de onda de pico de unidades individuales putativas fueron discernibles en muchas grabaciones. La Figura 4B muestra ejemplos representativos de formas de onda de pico de tres sesiones de grabación a lo largo de un mes de grabaciones, lo que demuestra que la actividad de una sola unidad se puede identificar con éxito a lo largo del tiempo. La Figura 4C muestra el número total de unidades individuales putativas extraídas de registros crónicos en seis animales, que abarcan una ventana de hasta 100 días. Las unidades individuales se definieron de acuerdo con los criterios predeterminados de kilosort 3.0 (ver Tabla Suplementaria 1). Como se puede ver, el número de unidades individuales claramente definidas ascendió típicamente a ~40 en la primera semana después de la implantación, y luego disminuyó gradualmente, avanzando hacia una asíntota aparentemente estable de ~20 unidades. Dado que estos registros se realizaron utilizando sondas lineales de 32 canales, esto equivale a un rendimiento esperado de aproximadamente 1,25 unidades individuales por electrodo directamente después de la implantación, disminuyendo a aproximadamente 0,65 unidades individuales por electrodo en registros a largo plazo. La conexión repetida al amplificador/conector del implante durante las sesiones no pareció afectar ni a la calidad de la grabación ni a la estabilidad del implante, ya que la corona de Faraday que sostiene el amplificador/conector puede soportar fuerzas repetidas de más de 10 Newton, un orden de magnitud mayor que incluso las fuerzas de acoplamiento máximas requeridas por los conectores estándar (véase el vídeo complementario 2).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig04.jpg"> Figura 4: Estabilidad de las grabaciones neuronales a lo largo del tiempo. (A) Actividad media de LFP en respuesta a un estímulo CSD flash de campo amplio, mostrada a través de los 32 canales de una sonda implantada crónicamente de 3 a 110 días después del implante. La línea vertical roja denota que la sonda se baja a una nueva ubicación debido a que los canales 0-8 graban desde el exterior del cerebro el día 18 después de la cirugía. (B) Formas de onda de pico de tres unidades de ejemplo del mismo implante crónico registradas repetidamente a lo largo de cuatro semanas. Líneas finas: Formas de onda de pico individuales. Línea gruesa superpuesta: Forma de onda de pico promedio. (C) El número de unidades individuales putativas detectadas por Kilosort 3 a lo largo de los días de registro para 6 animales (véase la leyenda del recuadro). El cuadrado rojo denota los días en que se movió la sonda. La línea punteada denota el número de electrodos por implante utilizados en estos registros (32). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Por último, al proporcionar un sistema modular que incluye un microdrive, así como una jaula de Faraday portátil y una placa de cabeza que funciona como base de implante y dispositivo para la fijación de la cabeza, este protocolo permite la integración de la electrofisiología crónica con el comportamiento de fijación de la cabeza. Aquí, se muestran datos de ejemplo de ratones que atraviesan un entorno virtual en una cinta de correr esférica. La Figura 5A muestra la actividad de picos relacionada con la carrera de 20 unidades en un ejemplo de prueba. La Figura 5B muestra las diversas pero robustas relaciones entre la velocidad de carrera y la actividad de aumento de las unidades individuales clasificadas por picos, así como un promedio poblacional para el mismo efecto en la Figura 5C, lo que confirma el efecto bien establecido de la actividad locomotora sobre la actividad neuronal en el roedor V124.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66867/66867fig05.jpg"> Figura 5: Respuestas neuronales durante el comportamiento con la cabeza fija. (A) Gráfico ráster de respuestas de una sola unidad en un ensayo de ejemplo, con velocidad de carrera (línea morada) y tasas de disparo promedio en todas las unidades individuales (línea azul claro) superpuestas. (B) Actividad de una sola unidad durante diferentes categorías de velocidad de carrera, mostrada para seis unidades de ejemplo. (C) Promedio de la actividad de aumento en todas las unidades individuales en una sesión de ejemplo, trazada a lo largo de los cinco quinítiles de la distribución de velocidad de carrera. Las velocidades de carrera en esta sesión oscilaron entre 0 y 0,88 metros/segundo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/66867fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla complementaria 1: Tabla que muestra los parámetros predeterminados utilizados por Kilosort 3 al identificar unidades individuales en los registros que se muestran en la Figura 3, la Figura 4 y la Figura 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video complementario 1: Video que muestra la actividad locomotora de los animales después del implante. El video tomado después de la fase de recuperación de 5 días es completo, mostrando el comportamiento locomotor normal, así como la adaptación al tamaño y peso del implante. Se puede ver al animal explorando normalmente una jaula de juego que contiene enriquecimiento ambiental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20video%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video complementario 2: Video que muestra la fuerza aplicada sobre la corona de Faraday ensamblada. Las fuerzas soportadas por la corona de Faraday son aproximadamente un orden de magnitud mayores que la fuerza de conexión necesaria para los conectores estándar, como los nanoconectores polarizados de 4 pines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Video%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 1: Figura que muestra imágenes del soporte de la unidad. Los archivos de diseño imprimibles se pueden encontrar en el repositorio de Github correspondiente (https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Plantilla para malla de cobre. Imprime la plantilla con la escala original y utiliza la plantilla para cortar la malla de cobre (paso 2.12). Utilice la barra de escala para verificar y, si es necesario, ajustar la escala de la impresión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 3: Serie de fotos que muestra los pasos de montaje del implante durante la cirugía. En este caso se instalan dos microaccionamientos, así como dos amplificadores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 4: Dibujo del cráneo de un ratón con ejemplos de colocación de unidades, craneotomías (en verde) y pin GND/REF (en rojo). Se sugiere la ubicación de los clavos debido a la ubicación en el cerebelo, que es poco probable que interfiera con los registros corticales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66867/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Aquí, presentamos un sistema de implante de sonda liviano y rentable para electrofisiología crónica en roedores optimizado para la facilidad de uso, la recuperación de la sonda, la versatilidad experimental y la compatibilidad con el comportamiento.

El implante DREAM: un sistema de implantes ligero, modular y rentable para la electrofisiología crónica en ratones de cabeza fija y de comportamiento libre

Chronic electrophysiological recordings in rodents have significantly improved our understanding of neuronal dynamics and their behavioral relevance. ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Comprender los sustratos neuronales del comportamiento requiere la grabación de un conjunto de circuitos cerebrales. Debido a su trazabilidad genética, el ratón ofrece un modelo para la disección de circuitos y el mimetismo de enfermedades. Aquí, se describe un método de diseño y fabricación de sondas miniaturizadas que es adecuado para apuntar a la estructura cerebral profunda en el ratón.

Diseño y fabricación de Ultralight Peso, ajustables Sondas Multi-electrodos para electrofisiológicos grabaciones en ratones

Aquí, describimos un diseño de micro-impulso, procedimiento de implantación quirúrgica y estrategia de recuperación postoperatoria que permiten grabaciones crónicas de campo y de una sola unidad de múltiples regiones cerebrales simultáneamente en ratones juveniles y adolescentes a través de una ventana crítica de desarrollo desde el día postnatal 20 (p20) hasta el día postnatal 60 (p60) y más allá.

Un implante de accionamiento ligero para grabaciones crónicas de tetrodos en ratones jóvenes

Aquí, presentamos un implante único imprimible en 3D para ratas, llamado TD Drive, capaz de registros simétricos de electrodos de alambre bilaterales, actualmente en hasta diez áreas cerebrales distribuidas simultáneamente.

El TD Drive: un implante paramétrico de código abierto para registros electrofisiológicos multiárea en ratas que se comportan y duermen

Este protocolo fue desarrollado para crear un sistema confiable y de fácil acceso para registrar EEG de roedores en movimiento libre.

Un protocolo rentable y mínimamente invasivo para el registro de electroencefalografía crónica multisitio en ratones que se mueven libremente

Se presenta un método de bajo costo para diseñar y construir un cabezal de luz pre-amplificador del sistema de grabación simultánea neural y la capacidad de estimulación. Este dispositivo puede ser impermeabilizadas para su uso en animales que nadan.

Diseño y construcción de un cabezal rentable para la estimulación simultánea neural y de grabación en el laberinto de agua

Control nervioso y los procesos cognitivos pueden ser estudiados a través de los movimientos oculares. El software VisualEyes permite a un operador para programar los estímulos en dos pantallas de ordenador de forma independiente utilizando un lenguaje de scripting personalizado simple. El sistema puede estimular los movimientos oculares sacádicos tándem (y seguimiento lento) o movimientos oculares opuestas (de convergencia) o cualquier combinación.

VisualEyes: Un sistema de software modular para experimentación oculomotor

Se describe el diseño y montaje de los auriculares miniaturizados adecuados para la sustitución de retroalimentación auditiva natural de un pájaro cantor con una señal acústica manipulado. Online hardware de procesamiento de sonido se utiliza para manipular la salida canción, introducir en tiempo real de los errores en la retroalimentación auditiva a través de los auriculares, e impulsar el aprendizaje motor vocal.

Un peso ligero, Auriculares basada Sistema de Manipulación de retroalimentación auditiva en Songbirds

Describimos el uso de optogenetics y grabaciones electrofisiológicas para la manipulación selectiva de oscilaciones de hippocampal de la theta (5-10 Hz) en ratones de comportarse. La eficacia del arrastre de ritmo se controla usando el potencial de campo local. Una combinación de opto - e inhibición farmacogenética aborda la lectura eferente del hipocampo sincronización.

Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

Modelos animales de implantes cocleares pueden avanzar el conocimiento de los fundamentos tecnológicos de tratamiento de la pérdida permanente de audición neurosensorial con estimulación eléctrica. Este estudio presenta un protocolo quirúrgico de implantación coclear de una matriz de electrodos en ratones, así como la evaluación funcional con respuesta auditiva del médula oblonga y agudo ensordecedor.

Cirugía de implante coclear y eléctricamente evocada médula oblonga auditivo respuesta grabaciones en ratones C57BL/6

El protocolo presentado produce un persistente conflicto sensorial para los experimentos destinados al estudio de aprendizaje a largo plazo. Con el uso de un dispositivo fijo permanentemente sobre sus cabezas, ratones están continuamente expuestos a un desajuste sensorial entre entradas visuales y vestibulares mientras se mueven libremente en jaulas de la casa.

A largo plazo conflicto sensorial en comportarse libremente ratones

Aprenda a utilizar el implante DREAM para electrofisiología crónica en ratones y macacos mediante tareas de realidad virtual. Este sistema modular y rentable facilita la grabación de actividad neuronal durante comportamientos naturalistas.

El implante DREAM: un sistema de implantes ligero, modular y rentable para la electrofisiología crónica en ratones de cabeza fija y de comportamiento libre (Video) | JoVE Journal

El implante DREAM: un sistema de implantes ligero, modular y rentable para la electrofisiología crónica en ratones de cabeza fija y de comportamiento libre

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