Name: Preparación de microesferas de alginato de sodio reticulado con diferentes iones metálicos utilizando la tecnología de electrospray microfluídico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprende a preparar microesferas de alginato de sodio reticuladas con iones de zinc y cobre mediante dispositivo microfluídico. Estas presentan propiedades antimicrobianas y liberación sostenida de fármacos para aplicaciones terapéuticas.

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Este trabajo contó con el apoyo de un proyecto de investigación de la Universidad de Zhejiang Shuren (2023R053 y 2023KJ237).

La sangre utilizada en los experimentos se obtuvo de ratones hembra BALB/c de grado SPF con un peso de 20-25 g y aproximadamente 7 semanas de edad. El Comité de Ética de Experimentación Animal del Colegio Zhejiang Shuren aprobó todos los procedimientos experimentales y de cuidado animal.
1. Preparación de la solución
<ol><li>Pesar el ALG y disolverlo en agua ultrapura agitándolo en un baño de agua a 50 °C para obtener una solución de ALG al 2%.</li>
	<li>Prepare por separado la fracción de masa con soluciones al 5% (o la concentración de masa molar es de 0,3 M) de CaCl2, FeCl3, ZnSO4 y CuSO4 en agua ultrapura. Vierta cada solución por separado en un plato colector.</li>
</ol>2. Dispositivo de electropulverización microfluídica
<ol><li>Tome un tubo capilar de vidrio y colóquelo sobre la llama de un soplete para que se ablande, luego estírelo a varios diámetros (50 μm-500 μm). Corta las partes finas con un cortador de vidrio y pule suavemente el puerto de la punta con papel de lija de carburo de silicona de alta calidad. Después de la limpieza, conecte el extremo grueso del tubo capilar a un tubo largo y el otro extremo del tubo a una aguja dispensadora y una jeringa de 5 ml (Figura complementaria 1). NOTA: Los bordes afilados de los cortes de los tubos de vidrio son difíciles de insertar en la manguera; Por lo tanto, la rotura debe redondearse en el borde de la llama.</li>
	<li>Conecte la jeringa a la bomba de jeringa microfluídica y el tubo capilar en un extremo al soporte. Conecte el clip rojo de alto voltaje de la fuente de alimentación de alto voltaje a la aguja dispensadora de la jeringa y coloque el clip plateado en el líquido de recolección. Esta configuración crea un dispositivo de electropulverización microfluídica simple (Figura 1A). NOTA: Coloque el tubo capilar perpendicular a la mesa.</li>
</ol>3. Preparación de microesferas de ALG
<ol><li>Coloque los platos de recogida selectiva que contienen diferentes iones metálicos directamente debajo del tubo capilar. Encienda la bomba de jeringa microfluídica y seleccione Avance rápido para cebar el tubo con el ALG, luego configure el caudal adecuado (2 mL/h).</li>
	<li>Encienda el interruptor de alimentación de alto voltaje y gire la perilla para configurar el voltaje apropiado (5-7 kV).</li>
	<li>Agregue 20 mL de solución a cada una de las placas de Petri de 90 mm para recolectar microesferas de ALG y formar ALGMS reticulados con diferentes iones metálicos (Figura 1B).</li>
	<li>ALG forma microesferas bajo la acción del campo eléctrico y la gravedad en diferentes soluciones colectoras de iones en unos pocos segundos. Aspire las microesferas con una pipeta esterilizada y transfiéralas a tubos de centrífuga individuales de 1,5 ml para obtener microesferas de hidrogel de Zn2+, Ca2+, Cu2+ y Fe3+ -ALG (Figura 1C). Etiquete los tubos de Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS y Fe-ALGMS. NOTA: Se pueden obtener microesferas de diferentes diámetros ajustando parámetros como el voltaje, el diámetro de la punta, el caudal y la concentración de la solución.</li>
	<li>Tome una pequeña cantidad de las microesferas preparadas, distribúyalas lo más uniformemente posible en PBS y colóquelas bajo un microscopio para su visualización.</li>
	<li>Seleccionado al azar 10 campos de observación en el mismo lote de microesferas, importe las imágenes que se medirán en el software ImageJ, convierta las imágenes al modo de escala de grises apropiado y utilice la tecnología de segmentación de umbral para definir con precisión el área de las partículas objetivo e iniciar la función de análisis de las partículas para que ImageJ pueda identificar y medir las partículas objetivo. Obtenga datos sobre las microesferas y luego importe los datos al software Origin para el análisis y el mapeo del tamaño de las partículas.</li>
</ol>4. Prueba de rendimiento antimicrobiano
<ol><li>Prepare suspensiones de 5 mL de Staphylococcus aureus (S. aureus) y Escherichia coli (E. coli) con una turbidez bacteriana inicial de 0,2 mcF utilizando un medio líquido Luria-Bertani (LB).</li>
	<li>Agregue 10 mL de cada solución bacteriana a 4 tubos de centrífuga estériles individuales de 15 mL. A continuación, añada 0,5 mL de Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS y Fe-ALGMS ALG a cada tubo y colóquelos en un agitador de temperatura constante a 37 °C y 200 rpm durante 12 h. Agregue una cantidad igual de solución salina al grupo de control.</li>
	<li>Diluya cada solución bacteriana de 10a 5 veces con agua estéril. Utilice una perla de vidrio estéril para esparcir 200 μL de solución bacteriana en un medio sólido LB.</li>
	<li>Extienda la solución rápida y uniformemente sobre la placa de recubrimiento, evitando ir y venir en la misma área. A continuación, coloque las placas en una incubadora a 37 °C durante 12 h. Observa las colonias de diferentes grupos. NOTA: Todos los procedimientos asépticos deben realizarse cerca de una lámpara de alcohol. Esterilice los recipientes de cultivo microbiano, los utensilios de inoculación y los medios de cultivo.</li>
</ol>5. Pruebas de liberación de drogas
<ol><li>Para evaluar la capacidad de liberación de fármacos de diferentes microesferas, utilice la albúmina sérica bovina (BSA) como fármaco modelo cargado. Añadir 500 μL de cada microesfera (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS y Fe-ALGMS) a 1 mg/mL de suspensión de BSA durante 24 h.</li>
	<li>Para el ensayo de liberación del fármaco, añadir cada muestra saturada a 5,0 M de solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4), seguida de agitación durante 15 min a 37 °C con agitación continua a 80 rpm.</li>
	<li>Utilice 100 μL de la solución y sustituya el medio por uno nuevo a las 1, 3, 6, 12, 24, 36 y 48 h.</li>
	<li>Cuantifique las concentraciones de proteínas sobrenadantes en momentos específicos utilizando un kit de BCA según las instrucciones del fabricante. Mida cuantitativamente el fármaco liberado por marcador enzimático para obtener la absorbancia correspondiente y convierta el valor medido en la concentración real del fármaco de acuerdo con la curva estándar. Calcule la tasa de liberación del fármaco utilizando la siguiente fórmula: Porcentaje de liberación del fármaco = (concentración del fármaco liberado en un momento específico / concentración inicial del fármaco) x 100%</li>
	<li>A intervalos regulares, retire un volumen igual de PBS de cada pocillo y reemplácelo con un volumen igual de medio fresco.</li>
</ol>6. Prueba de hemólisis
<ol><li>Coloque los Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS y Fe-ALGMS preparados en PBS e incube a 37 °C durante 24 h para formular la solución de incubación.</li>
	<li>Obtención de sangre completa de ratones BALB/c sanos mediante flebotomía ocular, recogida en tubos anticoagulados que contienen citrato de sodio. Vórtice y centrífuga a 1509 x g durante 15 min para obtener glóbulos rojos.</li>
	<li>Enjuague los glóbulos rojos 2x-3x con PBS y prepare una solución de glóbulos rojos al 10% con PBS.</li>
	<li>Preparación de varios ALGMS: Tomar 500 μL de cada microesfera para el grupo experimental, 1 mL de agua ultrapura (ddH2O) para el grupo de control positivo y 1 mL de solución de PBS para el grupo de control negativo y mezclar cada uno con 20 μL de solución de glóbulos sanguíneos.</li>
	<li>Incubar las muestras a 37 °C durante 4 h, centrifugar a 1509 x g, 15 min. Mantenga el sobrenadante a un lado y fotografíe los glóbulos rojos de cada grupo después de la hemólisis.</li>
	<li>Tome la tasa de hemólisis del grupo de control positivo como 100% y la del grupo de control negativo como 0%. Mida los valores de absorbancia de los sobrenadantes en cada grupo y calcule la tasa de hemólisis usando la fórmula: Hemólisis (%) = (Valores de absorbancia de los sobrenadantes de cada grupo- Valores de absorbancia del agua destilada sola) / (Valores de absorbancia del grupo de control positivo- Valores de absorbancia del agua destilada sola) x 100</li>
</ol>7. Prueba de citobiocompatibilidad
<ol><li>Lave los diferentes ALGMS 2 veces con PBS y colóquelos en una placa de Petri de 5 mL durante 15 min y deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir por separado diferentes ALGMS a 0,2 mL en medio de cultivo completo (DMEM) que contenga un 10% de FBS, incubar a 37 °C durante 24 h y filtrar la solución para obtener el lixiviado.</li>
	<li>Cultive las células NIH3T3 hasta aproximadamente el 70% de densidad celular en placas de 24 pocillos, trate las células NIH3T3 con una solución de lixiviación de microesferas y continúe cultivando con medio completo durante otras 24 h.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo celular y lave las células con PBS.</li>
	<li>Evalúe la viabilidad celular mediante el ensayo Calcein-AM/PI. Tome 2,5 μL de solución de Calceína-AM (4 mM) y 12,5 μL de solución de PI (2 mM) y añádalos a 5 mL de 1x PBS y mezcle bien para obtener una solución de trabajo con 2 μM de Calceína-AM y 5 μM de PI.</li>
	<li>Añadir la solución de trabajo a placas de cultivo celular previamente sembradas a 500 μL por pocillo, incubar a 37 °C bajo protección lumínica durante 15 min, y observar y fotografiar bajo un microscopio de fluorescencia invertida. Configure tres réplicas para cada grupo.</li>
	<li>Calcule la viabilidad celular de acuerdo con la siguiente fórmula: Viabilidad celular (%) = número de células viables / (número de células viables + número de células muertas)</li>
</ol>

Desarrollo de microesferas de hidrogel de alginato de sodio para uso biomédico

<ol><li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+advances+of+cellulose-based+intelligent-responsive+hydrogels+as+vehicles+for+controllable+drug+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+BiolMacromol%22%5BJournal%5D)">A review of recent advances of cellulose-based intelligent-responsive hydrogels as vehicles for controllable drug delivery system.</a> Int J BiolMacromol. 264 (2), 130525(2024).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microfluidic+hydrogel+microspheres+for+cell+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct%22%5BJournal%5D)">Injectable microfluidic hydrogel microspheres for cell and drug delivery.</a> Adv Funct. 31 (31), 2103339(2021).</li>
<li>Qiao, S., Chen, W., Zheng, X., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pH-sensitive+alginate-based+hydrogel+by+microfluidic+technology+for+intestinal+targeting+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery.</a> Int J Biol Macromol. 254 (2), 127649(2024).</li>
<li>Lei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+hydrogel+microspheres+for+protein+capture+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Design%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial hydrogel microspheres for protein capture and wound healing.</a> Mater Design. 215, 110478(2022).</li>
<li>Ju, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zn2%2B+incorporated+composite+polysaccharide+microspheres+for+sustained+growth+factor+release+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Zn2+ incorporated composite polysaccharide microspheres for sustained growth factor release and wound healing.</a> Mater Today Bio. 22, 100739(2023).</li>
<li>El-Sayed, N. S., Hashem, A. H., Khattab, T. A., Kamel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antibacterial+hydrogels+based+on+sodium+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">New antibacterial hydrogels based on sodium alginate.</a> Int. J Biol Macromol. 248, 125872(2023).</li>
<li>Olukman Şahin, M., Şanlı, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+5-fluorouracil+release+properties+investigation+from+pH+sensitive+sodium+alginate+coated+and+uncoated+methyl+cellulose%2Fchitosan+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">In vitro 5-fluorouracil release properties investigation from pH sensitive sodium alginate coated and uncoated methyl cellulose/chitosan microspheres.</a> Int J Biol Macromol. 258 (1), 128895(2024).</li>
<li>Chi, H., Qiu, Y., Ye, X., Shi, J., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+strategy+of+hydrogel+microsphere+and+its+application+in+skin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preparation strategy of hydrogel microsphere and its application in skin repair.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1239183(2023).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+dual-adhesive+particles+from+microfluidic+electrospray+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired dual-adhesive particles from microfluidic electrospray for bone regeneration.</a> Nano Res. 16 (4), 5292-5299 (2022).</li>
<li>Zheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol-encapsulated+microspheres+prepared+by+microfluidic+electrospray+for+alleviating+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">Celastrol-encapsulated microspheres prepared by microfluidic electrospray for alleviating inflammatory pain.</a> Biomater Adv. 149, 213398(2023).</li>
<li>Yang, L., Yang, W., Xu, W., Zhao, Y., Shang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+Janus+microcarriers+with+sequential+actives+release+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired Janus microcarriers with sequential actives release for bone regeneration.</a> Chem Eng J. 476, 146797(2023).</li>
<li>Yang, L., Sun, L., Zhang, H., Bian, F., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-inspired+lubricated+drug+delivery+particles+from+microfluidic+electrospray+for+osteoarthritis+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ice-inspired lubricated drug delivery particles from microfluidic electrospray for osteoarthritis treatment.</a> ACS Nano. 15 (12), 20600-20606 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-flexible+stretchable+liquid+metal+circuits+with+antimicrobial+properties+through+selective+laser+activation+for+health+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-flexible stretchable liquid metal circuits with antimicrobial properties through selective laser activation for health monitoring.</a> Chem Eng J. 482, 149173(2024).</li>
<li>Sukhodub, L., Kumeda, M., Sukhodub, L., Bielai, V., Lyndin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+doping+effect+on+the+physicochemical%2C+antimicrobial%2C+and+wound+healing+profiles+of+alginate-based+composite%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Metal ions doping effect on the physicochemical, antimicrobial, and wound healing profiles of alginate-based composite.</a> Carbohydr Polym. 304, 120486(2023).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Bertsch, P., Diba, M., Mooney, D. J., Leeuwenburgh, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+injectable+hydrogels+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration.</a> Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomass+microcapsules+with+stem+cell+encapsulation+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomicro+Lett%22%5BJournal%5D)">Biomass microcapsules with stem cell encapsulation for bone repair.</a> Nanomicro Lett. 14 (1), 4(2021).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK-Cell-Encapsulated+porous+microspheres+via+microfluidic+electrospray+for+tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater%22%5BJournal%5D)">NK-Cell-Encapsulated porous microspheres via microfluidic electrospray for tumor immunotherapy.</a> ACS Appl Mater. 11 (37), 33716-33724 (2019).</li>
<li>Nan, L., Zhang, H., Weitz, D. A., Shum, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+future+of+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22LOC%22%5BJournal%5D)">Development and future of droplet microfluidics.</a> LOC. 24 (5), 1135-1153 (2024).</li>
</ol>

No se revelarán conflictos de intereses.

En este protocolo, presentamos un método para la preparación de ALGMS basado en la tecnología de electrospray microfluídico. El método es fácil de operar y produce una gran cantidad de microesferas con una redondez uniforme y un diámetro controlable. Este enfoque ofrece comodidad a los investigadores y puede promover la investigación y la aplicación de microesferas de hidrogel. Además, al reticulación con diferentes iones metálicos, se mejoró la estabilidad y bioactividad de los ALGMS. En los experimentos antimicrobianos, el Cu-ALGMS y el Zn-ALGMS mostraron importantes efectos inhibidores bacterianos.
Las microesferas de hidrogel son microestructuras flexibles con una excelente plasticidad, lo que permite una administración eficaz de fármacos mediante la selección de materiales específicos y el diseño estructural. El alginato, un polisacárido natural que se gelifica en condiciones suaves, es biocompatible, biodegradable y no tóxico. Las microesferas de alginato de sodio a escala micrométrica se utilizan ampliamente en bioquímica y biomedicina, incluida la investigación farmacéutica, la administración de fármacos y la ingeniería de tejidos. Una ventaja clave de las microesferas de alginato de sodio en aplicaciones de administración de fármacos es su capacidad para la liberación sostenida de fármacos, lo que garantiza el mantenimiento de altas concentraciones del ingrediente farmacéutico activo durante un período prolongado14. Nuestros experimentos de liberación sostenida de fármacos revelaron que los ALGMS con diferentes reticulaciones iónicas tienen la capacidad de mantener la liberación de fármacos y pueden utilizarse para aplicaciones de administración de fármacos.
Los métodos comunes de fabricación de microesferas de hidrogel incluyen emulsificación por lotes, trituración mecánica, litografía, emulsión microfluídica y electrospray 8,15. Las ventajas de los métodos de emulsificación por lotes y trituración mecánica radican en la simplicidad del método de fabricación y la alta eficiencia de producción. Sin embargo, es difícil controlar la forma de las microesferas de hidrogel individuales utilizando estos métodos. La fotolitografía consiste en enfocar la luz en una máscara, placa o molde para curar la reticulación y formar microesferas de hidrogel. Sin embargo, la eficiencia de producción de este método se ve fácilmente afectada por la placa de la máscara, la fuente de luz y el molde. Además, el método de emulsión microfluídica puede controlar mejor el proceso de moldeo de microesferas de hidrogel y producir microesferas de hidrogel con formas específicas; sin embargo, su eficiencia de producción es baja16. En comparación con estos métodos, el método de electropulverización microfluídica puede producir microesferas de hidrogel con un tamaño uniforme, una forma regular y un tamaño de partícula ajustable17. El paso clave en este protocolo es la preparación de las microesferas. El tamaño y la forma de las microesferas pueden variar según la planitud del tubo de vidrio, el valor del voltaje y el caudal18. También existen algunas limitaciones en el uso de la tecnología de electropulverización microfluídica para preparar microesferas, como la tendencia de los microcanales a obstruirse y el rendimiento limitado, la compatibilidad limitada de los materiales y la dificultad de escalado del proceso, y la dificultad del control y seguimiento del proceso. Esto limita en cierta medida su aplicación generalizada19.
En resumen, la tecnología de electropulverización microfluídica es un método maduro de preparación de microesferas que ofrece la ventaja de la síntesis en un solo paso. Optimizando los parámetros de tamaño del canal de flujo y controlando la concentración de material y el caudal, se pueden obtener fácilmente microesferas de varias morfologías y tamaños. En particular, el proceso involucra solo la fase acuosa y no hay tensioactivos adicionales, lo que lo hace respetuoso con el medio ambiente y fácil de operar, evitando la necesidad de complejos procesos de lavado. Este método proporciona una estrategia para producir microesferas a partir de materiales de hidrogel similar al proceso de gelificación con alginato.

Los sistemas de administración de fármacos son un foco de investigación en el campo de la ingeniería de biotejidos, con el objetivo de mejorar la eficiencia y la eficacia de la administración de fármacos y reducir las reacciones adversas y los efectos secundarios1. Entre estos sistemas, las microesferas de hidrogel, caracterizadas por buena biocompatibilidad, propiedades mecánicas sintonizables y plasticidad funcional, son uno de los vehículos más utilizados para la carga y administración de fármacos2. Pueden utilizarse tanto para la liberación lenta como controlada de fármacos, proporcionar buenos efectos protectores para los fármacos, evitar o minimizar los efectos inespecíficos de los fármacos en otros tejidos y dirigir la administración de fármacos a estructuras tisulares específicas3. Por lo tanto, las microesferas de hidrogel se han convertido en un nuevo y eficiente sistema de administración de fármacos, con una investigación en este campo que emerge gradualmente4.
Las microesferas de hidrogel se sintetizan normalmente a partir de materiales biodegradables, como polisacáridos, proteínas y polímeros naturales5. Entre ellos, ALG es un polisacárido biocompatible y biodegradable extraído de algas pardas marinas6. Su cadena molecular contiene grupos hidroxilo y carboxilo libres que pueden reticularse con la mayoría de los cationes divalentes o multivalentes para formar una estructura de hidrogel insoluble en agua con una red tridimensional5. Las microesferas de hidrogel formadas por ALG se pueden convertir en polielectrolitos cargados negativamente en soluciones neutras y alcalinas. Esta repulsión entre cargas negativas hace que las microesferas se hinchen, permitiendo la liberación del principio activo encapsulado o fármaco. Estas propiedades han llevado a considerar las microesferas de ALG como prometedoras portadoras de fármacos ampliamente utilizadas para la carga de fármacos y la liberación controlada7.
Existen varios métodos para la preparación de microesferas de hidrogel. Los métodos tradicionales de preparación de ALGMS suelen incluir el método sol-gel o el método emulsión-sol. Estos métodos implican etapas como la precipitación, la coprecipitación y las reacciones de gelificación para obtener las microesferas objetivo8. En los últimos años, con el desarrollo continuo de la tecnología microfluídica, el método de electropulverización microfluídica se ha convertido gradualmente en un método de preparación de microesferas eficiente y preciso9. Este método utiliza la tecnología microfluídica para electrorociar una solución de polímero a través de una boquilla microfina para formar gotas y microesferas del tamaño de un micrómetro durante el posterior proceso de curado o reticulación10. En comparación con el método tradicional, el electrospray microfluídico ofrece un control preciso del tamaño y la morfología de las partículas de las microesferas mediante el ajuste de parámetros como el caudal de la solución, el voltaje y el tamaño fino de la boquilla11. También permite la preparación continua de microesferas a alta velocidad, mejorando la eficiencia de la preparación y manteniendo condiciones de reacción suaves. Además, los ALGMS pueden prepararse para poseer diversas funciones, como fármacos de liberación controlada y catalizadores cargados, lo que permite su fácil aplicación en diversos campos.
En este trabajo se presenta un protocolo para la preparación de microesferas de ALG mediante el método de electrospray microfluídico. El proceso consiste en hacer pasar una solución de ALG a través de un dispositivo microfluídico y someterla a electropulverización. Las gotas resultantes se recogieron en la solución que contenía diferentes iones metálicos (Ca2+, Cu2+, Zn2+ y Fe3+) para iniciar la reacción de reticulación. Esta reacción mejora la estabilidad y adherencia de las microesferas y las dota de diferentes funcionalidades. Este método es fácil de realizar y las microesferas sintetizadas exhiben una buena uniformidad de tamaño en su morfología. Además, investigamos sus propiedades antimicrobianas, su lenta capacidad de liberación de fármacos y su biocompatibilidad. Este protocolo será útil para el desarrollo y la producción de fármacos.

<table><tbody><tr><td>Pantalla de malla 120</td><td>Solarbio, China</td><td>YA0946</td><td></td></tr><tr><td>Quemador de alcohol</td><td>Solarbio, China</td><td>YA2320</td><td></td></tr><tr><td>BALB / c ratones</td><td>Wukong Biotechnology, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido bicincónico Reactivo de ensayo</td><td>Meilunbio, China</td><td>MA0082</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Lablead, China</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2& nbsp; polvo</td><td>Aladdin, China</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Calceína-AM/PI</td><td>Biosharp, China</td><td>BL130A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>Corning, América</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4 y nbsp; polvo</td><td>Jnxinyuehuagong, China</td><td>7758-99-8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibicol, China</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3 y nbsp; polvo</td><td>Aladdin, China</td><td>7705-08-0</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>HAKATA, China</td><td>HN-FBS Tubos de</td><td></td></tr><tr><td>vidrio</td><td>Sartorius, Alemania</td><td>CC0028</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía</td><td>óptica Evidentscientific, Japón</td><td>BX53 (LED)</td><td></td></tr> <tr><td>Bomba de jeringa microfluídica</td><td>Longerpump, Inglaterra</td><td>LSP01-3A</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3</td><td>HyGyte, China</td><td>TCM-C752</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Thermofisher,America</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina</td><td>Thermofisher,America</td><td>3002</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>Thermofisher,America</td><td>Axia ChemiSEM</td><td></td></tr><tr><td>Polvo de alginato de sodio&nbsp;</td><td>Bjbalb,China</td><td>Y13095</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4 polvo</td><td>Jnxinyuehuagong,China</td><td>7733-02-0</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de microesferas de alginato de sodio reticulado con diferentes iones metálicos utilizando la tecnología de electrospray microfluídico

Preparation of Cross-Linked Sodium Alginate Microspheres with Different Metal Ions Using the Microfluidic Electrospray Technology

Las microesferas son partículas del tamaño de un micrómetro que pueden cargarse y liberarse gradualmente fármacos a través de la encapsulación física o la adsorción en la superficie y dentro de los polímeros. En el campo de la biomedicina, las microesferas de hidrogel han sido ampliamente estudiadas para su aplicación como portadores de fármacos debido a su capacidad para reducir la frecuencia de administración de fármacos, minimizar los efectos secundarios y mejorar el cumplimiento del paciente. El alginato de sodio (ALG) es un polisacárido lineal natural con tres enlaces glucosídicos fundamentales. Hay dos grupos hidroxilo auxiliares presentes en cada una de las fracciones del polímero, que tienen las características de una fracción hidroxilo de alcohol. Las unidades sintéticas de ALG pueden sufrir reacciones químicas de reticulación con iones metálicos, formando una estructura de red reticulada de pilas de polímeros, formando finalmente un hidrogel. Las microesferas de hidrogel se pueden preparar utilizando un proceso simple que involucra las propiedades de reticulación iónica de ALG. En este estudio, preparamos microesferas de hidrogel basadas en ALG (ALGMS) utilizando una estrategia de electrodeposición microfluídica. Las microesferas de hidrogel preparadas tenían un tamaño uniforme y estaban bien dispersas, gracias a un control preciso del flujo de electrospray microfluídico. Se prepararon ALGMS reticulados con diferentes iones metálicos utilizando una técnica de electrospray microfluídico que combina microfluídica y campo eléctrico alto, y se investigaron sus propiedades antimicrobianas, capacidad de liberación lenta del fármaco y biocompatibilidad. Esta tecnología es prometedora para su aplicación en el desarrollo y la producción de fármacos avanzados.

Caracterización de ALGMS reticulados con diferentes iones metálicos La morfología óptica de Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS y Fe-ALGMS se muestra en la Figura 2, exhibiendo buena esfericidad, superficie lisa, distribución uniforme del tamaño de partícula (Figura suplementaria 2) y excelente monodispersidad. Además, realizamos la caracterización microscópica mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y análisis de espectroscopia de dispersión de energía (EDS). Como se muestra en la Figura 3, las microesferas eran generalmente esféricas con una redondez bien definida. La superficie del Zn-ALGMS estaba distribuida de manera desigual, apareciendo más áspera con muchas arrugas. Realizamos espectroscopía de dispersión de energía para determinar la distribución del contenido de iones metálicos involucrados en la reacción de reticulación en el gel. En particular, el tamaño de la microesfera se puede ajustar cambiando parámetros como la distancia de recolección, la concentración de gel y el voltaje del campo eléctrico12. En el protocolo descrito, ajustando los parámetros del dispositivo microfluídico y la concentración de líquido, se pueden obtener fácilmente partículas de diferentes tamaños de acuerdo con requisitos específicos.
Evaluación de las propiedades antimicrobianas Se evaluó la capacidad antimicrobiana de diferentes microesferas utilizando el método de la placa, como se muestra en la Figura 4. Diferentes microesferas mostraron actividad antibacteriana contra E. coli y S. aureus, siendo el Cu-ALGMS y el Zn-ALGMS los que mostraron las propiedades antibacterianas más fuertes. Esta mayor eficacia puede atribuirse a la actividad antimicrobiana de los metales, a saber, el cobre (Cu) y el zinc (Zn)13. Sukhodub et al. demostraron que el Fe3+, Zn2+, Ca2+ y Cu2+ exhibieron efectos antibacterianos sinérgicos con el quitosano, mientras que las muestras sin quitosano no mostraron dicha actividad, validando el efecto antibacteriano sinérgico de los complejos formados14. Los resultados obtenidos se alinean con este estudio, siendo el Cu-ALGMS y el Zn-ALGMS superiores a otras microesferas de hidrogel en el tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas.
Evaluación de las propiedades de liberación del fármaco La evaluación de la liberación del fármaco a partir de diferentes microesferas de hidrogel de alginato a base de metales utilizando BSA como fármaco modelo reveló diferencias en sus perfiles de liberación. (Figura complementaria 3). Los iones mostraron una mejor capacidad de liberación lenta de fármacos que los de otros materiales. La tasa de liberación del fármaco Fe2+ fue relativamente más rápida que la de los otros tres iones, mientras que la tasa de liberación del fármaco Ca2+ y Zn2+ fue relativamente más lenta. Estos resultados ponen de manifiesto las diferencias en los efectos de los diferentes iones sobre la liberación del fármaco. Nuestra hipótesis es que el Fe2+ posiblemente interactúa con el fármaco o se une de una manera que facilita su liberación, mientras que el Ca2+ y el Zn2+ se unen al fármaco más estrechamente, o hay otros factores que limitan la tasa de liberación. Esta liberación sostenida del fármaco de las microesferas de hidrogel puede estar relacionada con la fuerza de reticulación entre el metal y el polisacárido de alginato. Además, la diferencia en la capacidad de adsorción de diferentes metales en comparación con la de BSA probablemente contribuyó a las diferencias observadas en las capacidades de retardo de fármacos.
Evaluación de la biocompatibilidad Una buena biocompatibilidad es un requisito previo para los portadores de administración de fármacos en aplicaciones clínicas. Por lo tanto, evaluamos la hemocompatibilidad de las microesferas mediante una prueba de hemólisis in vitro . Utilizamos agua pura como control positivo y solución de PBS como control negativo. Los resultados experimentales se muestran en la Figura Suplementaria 4, revelando que los glóbulos rojos en la suspensión permanecieron intactos al contacto con diferentes microesferas, lo que indica una hemólisis mínima por parte de las microesferas. Los resultados de citobiocompatibilidad mostraron que las microesferas no afectaron la actividad celular (Figura suplementaria 5). Estos resultados indicaron que las microesferas tienen una buena compatibilidad con las células sanguíneas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig01.jpg"> Figura 1: Preparación de microesferas de hidrogel de alginato. (A) Instalación de tecnología de electrospray microfluídico. (B) La imagen en tiempo real del proceso de electrospray microfluídico. (C) Las microesferas de hidrogel de alginato de Ca2+, Cu2+, Zn2+ y Fe3+ preparadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig02.jpg"> Figura 2: Micrografía de microesferas de hidrogel de alginato. Micrografía de (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS y (D) Fe-ALGMS en PBS (pH 7.4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig03.jpg"> Figura 3: Microscopía electrónica de barrido y espectroscopía de dispersión de energía. Las imágenes muestran la caracterización de (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS y (D) Fe-ALGMS con i y ii para datos de microscopía de barrido y iii-v para datos de espectroscopía. Las imágenes iii-v muestran un mapeo EDS, en el que el EDS selecciona una cara en la superficie de la muestra para escanear y obtener información de distribución elemental en toda el área. El modo de barrido de mapa se utiliza en aplicaciones para el análisis de composición, el análisis de zonas de fase y la distribución del tamaño de partícula de los materiales, donde cada elemento está representado por un color diferente, como se muestra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig04.jpg"> Figura 4. Propiedades antimicrobianas de las microesferas. (A) Las propiedades antimicrobianas de los grupos se probaron utilizando el método de frotis bacteriano. (B, C) Cuantificación de los resultados del recuento de placas de frotis bacteriano para cada grupo. Las muestras de control muestran colonias cultivadas en medio LB sin ninguna adición. Las colonias relativas para las otras bacterias se calcularon tomando el recuento de clones del grupo de control como 100% y usándolo como referencia. La barra de error: desviación estándar, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Un tubo de vidrio está conectado a la jeringa a través de un tubo largo de goma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Tamaño de partícula. (A) Zn-ALGMS, (B) Ca-ALGMS, (C) Cu-ALGMS, (D) Fe-ALGMS. Se utilizó una concentración molar del 5% para todas las muestras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 3: Liberación de fármacos. La curva de liberación de fármacos de Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS y Fe-ALGMS en PBS (pH 7,4). La barra de error: desviación estándar, n = 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%203_RE.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 4: Ensayo de hemólisis de Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS y Fe-ALGMS. PC (control positivo): ddH2O; NC (Control Negativo): PBS. La barra de error: desviación estándar, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%204_RE.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 5: Citotoxicidad de microesferas reticuladas con diferentes iones. Se realizó la evaluación de la biocompatibilidad de Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS y Fe-ALGMS. Para realizar la prueba se utilizó Calcein-AM/PI y, para los resultados en este caso, se seleccionaron aleatoriamente 5 campos de visión. ImageJ se utilizó para analizar la proporción de glóbulos rojos y células muertas para obtener la viabilidad celular relativa. 1. PC, control positivo, 2.NC, control negativo, 3. Zn-ALGMS, 4. Ca-ALGMS, 5. Cu-ALGMS, 6. Fe-ALGMS, La barra de error: desviación estándar, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%205_RE.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El protocolo describe la preparación de microesferas de alginato de sodio reticuladas con diferentes iones metálicos utilizando un dispositivo microfluídico para el diseño de portadores de fármacos. También se investigaron las propiedades antimicrobianas y la liberación lenta de estos fármacos.

Preparación de microesferas de alginato de sodio reticulado con diferentes iones metálicos utilizando la tecnología de electrospray microfluídico

Microspheres are micrometer-sized particles that can load and gradually release drugs via physical encapsulation or adsorption onto the surface and within ...

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