Name: Electropenetrografía AC-DC para el estudio de los comportamientos de sondaje e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende a utilizar la electropenetrografía AC-DC para analizar los comportamientos de sondaje e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas. Este método no invasivo permite estudiar la transmisión de patógenos con detalle.

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Estamos agradecidos a la Prof. Astri Wayadande de la Universidad Estatal de Oklahoma por ser pioneros en el procedimiento de cableado para mosquitos, y a la Dra. Elaine Backus en el USDA-ARS en Parlier, CA, y al Sr. Andrew Dowell en EPG Technologies Inc. en Gainesville, FL, por su ayuda en la resolución de problemas del equipo EPG. También agradecemos al Dr. Dustin Swanson y al Sr. William Yarnell del Insectario USDA-ARS en Manhattan, KS, por proporcionar mosquitos, y a la Srta. Miriam Ruhinda de la Universidad Estatal de Kansas en Manhattan, KS por su ayuda con la filmación de los videos de procedimiento. Este trabajo fue posible gracias al acceso al Núcleo Integrado de Entomología Molecular (IEMC) de la Universidad Estatal de Kansas. Esta investigación fue respaldada por el Acuerdo de Desarrollo de la Fuerza Laboral de Investigación, Educación y Economía del USDA (#58-3022-0-002) y el Proyecto Multiestatal Hatch (NE1943). Este manuscrito es la contribución No. 24-194-J de la Estación Experimental Agrícola de Kansas, Universidad Estatal de Kansas, Manhattan, KS, EE.UU.

Non-invasive Electropenetrography to Study Mosquito Probing Behaviors

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Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de EE. UU. Las conclusiones de este informe son las de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista del USDA.

Al utilizar el AC-DC EPG, es fundamental tener un conocimiento básico del funcionamiento del hardware y el software30 y seguir cuidadosamente los protocolos descritos en este documento para evitar dañar el equipo. En particular, evite tocar el amplificador principal cuando esté encendido a menos que esté conectado a tierra en la jaula de Faraday. Se recomienda grabar lo más atrás posible en la jaula de Faraday30. Las puertas de la jaula no necesariamente necesitan estar cerradas para obtener formas de onda interpretables a menos que se graben en un entorno con ruido eléctrico ambiental excesivo. Nada motorizado puede estar en la jaula de Faraday. Es importante tener en cuenta que la jaula de Faraday en sí debe estar conectada a tierra eléctricamente únicamente a través del amplificador principal para que funcione correctamente. Esto se logra conectando el amplificador de cabeza a un soporte de laboratorio de metal con la pintura lijada de un pie del soporte para permitir una vía conductora para que la electricidad capturada por la jaula de Faraday fluya hacia el soporte de laboratorio, hacia la carcasa de metal del amplificador de cabeza, por el cable hasta la caja de control. a través de la fuente de alimentación en un tomacorriente de pared debidamente conectado a tierra, y en la tierra a través de la tierra del edificio30. Se puede utilizar un multímetro para comprobar la calidad de la conexión entre los componentes del interior de la jaula midiendo la resistividad (que es la inversa de la conductividad) entre varios puntos. También se puede colocar una radio AM inalámbrica dentro de la jaula de Faraday para verificar que el sonido se reduzca significativamente (o idealmente se elimine) cuando las puertas están cerradas, lo que confirma que la jaula de Faraday está capturando adecuadamente las señales eléctricas en el aire (E. Backus per. Comm.).
La preparación adecuada y estandarizada del pegamento de plata y la fijación de los electrodos de registro a los insectos son fundamentales para obtener registros utilizables. La cutícula de insectos es un aislante y actúa como un condensador si el pegamento plateado no penetra adecuadamente en los poros de la cutícula para crear una vía para que la electricidad viaje desde el interior del insecto hasta el alambre de oro en la superficie del pronoto30. Prepare el pegamento plateado al mismo tiempo antes de cada sesión de EPG, trabaje con pegamento plateado fresco del tubo y reemplácelo con pegamento plateado vigorosamente vórtice con frecuencia durante el procedimiento de cableado. Asegúrese de que el lazo dorado esté colocado contra el tórax para que todo el lazo esté en contacto con la cutícula y no inclinado hacia un lado o separado por una capa gruesa de pegamento plateado y escamas para ayudar a formar una conexión eléctrica fuerte, así como para evitar el desprendimiento y escape del mosquito del cable.
Los protocolos descritos aquí deben optimizarse cuando se trabaja con diferentes especies de mosquitos. Los ajustes óptimos de EPG (nivel de Ri, voltaje, tipo de corriente y ganancia de hardware) para grabar en un artrópodo dado deben determinarse experimentalmente12,30. Sin embargo, una vez que se ajusta el desplazamiento, no será necesario reajustarlo cuando se trabaje con mosquitos similares. Se han determinado ajustes óptimos para AC-DC EPG con Ae. aegypti26 y Cx. tarsalis27. Las bibliotecas de formas de onda (definidas en la Tabla 2) para especies adicionales facilitarán la adopción de EPG para mosquitos. También es necesario optimizar la anestesia para el mosquito de interés, ya que el comportamiento de alimentación de sangre puede verse afectado de manera diferente según la especie de mosquito y la elección de la anestesia. Por ejemplo, Cx. tarsalis requiere un período de recuperación de 4 h después de 15 min de anestesia con CO2, mientras que para Ae. aegypti, un período de recuperación de 15 min es suficiente después de un período de anestesia de 15 min con hielo. Sin embargo, los Culex tarsalis son difíciles de derribar con la exposición al frío, por lo que elCO2 se usa predominantemente a pesar del largo período de recuperación.
Si bien el monitor AC-DC EPG es fácil de usar después de revisar los recursos en línea30,31 o capacitarlo con un usuario experimentado, se requiere cierta solución de problemas. Inicialmente, las grabaciones EPG del autor de las sondas de mosquitos tenían una onda de signo inesperada de 11 Hz en la preseñal que no había sido observada o reportada por Wayadande y sus colegas26. La consulta con E. Backus indicó que la jaula de Faraday probablemente era el problema debido a los bucles de tierra que interferían. Una nueva jaula de Faraday construida a partir de una pantalla de cobre altamente conductora conectada a un marco de aluminio atornillado a una gran placa de piso de aluminio sostenida por pies de goma para aislarla de la tabla a continuación (Figura 1B), resolvió la señal de ruido de 11 Hz (Figura 3C, C '). Además, ocasionalmente, cuando se encendió por primera vez la fuente de alimentación EPG, las señales previas y posteriores a la rectificación aparecían como líneas gruesas y difusas en lugar de líneas rectas, suaves y delgadas. Esto generalmente se solucionaba apagando el instrumento y verificando todas las conexiones del cable. Si eso fallaba, desenchufar el instrumento durante 1-3 minutos generalmente ayudaba. En muy raras ocasiones, las señales previas y posteriores se vuelven gruesas y borrosas durante el funcionamiento, lo que se solucionó apagando el instrumento y enchufándolo a una toma de corriente diferente o usando un regulador de voltaje y un acondicionador de energía para enchufar la EPG antes de conectarla a la pared. Idealmente, una línea dedicada para el monitor EPG eliminaría el ruido de línea proveniente de los refrigeradores y otros equipos conectados al mismo circuito eléctrico que el EPG30.
Actualmente, existen dos limitaciones principales para usar EPG para estudiar mosquitos. En primer lugar, se han realizado pocos estudios de correlación para verificar qué comportamientos de sondeo corresponden a las formas de onda. Si bien existen hipótesis sólidas sobre lo que está sucediendo durante cada familia de formas de onda (Tabla 1) y algunos de los tipos de formas de onda (M1 y M2), pocas de estas hipótesis se han confirmado experimentalmente, excepto que la ingestión de sangre se correlaciona con la familia de formas de onda M26,27. Lo más importante es que se deben identificar las formas de onda correspondientes a los eventos de salivación porque muchos patógenos se transmiten en la saliva. Se requerirá la correlación de las formas de onda de EPG con las actividades biológicas en los mosquitos para interpretar de manera significativa las diferencias significativas en la duración de la forma de onda y los recuentos entre los grupos de tratamiento. En segundo lugar, las tasas de sondaje e ingestión durante la EPG pueden ser mucho más bajas de lo esperado27. Atar individualmente a los mosquitos a cables cortos y colocarlos directamente sobre el huésped podría prevenir los comportamientos de búsqueda de huéspedes y alimentación social a larga distancia, lo que puede afectar los comportamientos de sondeo e ingestión. Los insectos correctamente conectados pueden caminar y volar normalmente. Aún así, los mosquitos a menudo tiran de los cables y, a veces, se enredan o se mantienen en ángulos antinaturales, lo que indica que estar conectado afecta su comportamiento hasta cierto punto. Los autores probaron muchas estrategias para mejorar las tasas de sondeo durante la EPG, y el ayuno de los mosquitos durante la noche, el uso de individuos mayores, la exposición al aliento humano inmediatamente antes de colocarlos en la mano y la aplicación de saliva humana en la mano fueron los más efectivos, así como el uso de huéspedes que constantemente hacían ajustes a escala fina en la posición de su mano para asegurarse de que el mosquito estuviera en la posición ideal para sondear27.
A pesar de estas limitaciones, AC-DC EPG tiene numerosas ventajas sobre otros enfoques para estudiar los comportamientos de sondaje e ingestión. Sistemas como BiteOScope11, flyPAD15 y Automated BiomaterialPlatform 14 que fueron diseñados para cuantificar los comportamientos de sondeo e ingestión y las secreciones salivales durante la alimentación con sangre utilizan sustratos artificiales transparentes y dietas líquidas que carecen de sistemas de tejido huésped normales y señales del huésped. Si bien estas plataformas sintéticas son útiles para muchos propósitos experimentales, una clara ventaja de AC-DC EPG es la capacidad de estudiar estos comportamientos de artrópodos y variables de interés dentro de los sistemas huéspedes naturales. Además, la adaptabilidad definida por el usuario del sistema AC-DC EPG ofrece una ventaja adicional sobre otros instrumentos EPG22,33 y dispositivos de monitoreo electrónico similares a EPG16,21, que no tienen niveles de Ri, tipos de corriente y niveles de voltaje ajustables que se necesitan para obtener formas de onda con la máxima cantidad de información y minimizar los efectos adversos en una amplia gama de huéspedes y artrópodos22, Artículo 23. Las técnicas de electromiografía (EMG) también se utilizan para estudiar la alimentación sanguínea. Sin embargo, el circuito eléctrico generalmente solo incluye el artrópodo y solo se registran los potenciales musculares más cercanos al electrodo de registro, por lo que las formas de onda no proporcionan información sobre las actividades detalladas que ocurren en la interfaz huésped-insecto, como rupturas celulares, ubicaciones y actividades de estilete y potenciales de flujo a través de las piezas bucales28,34. Las técnicas de microscopía intravital se pueden utilizar para visualizar directamente los movimientos y actividades detallados de las piezas bucales en los tejidos vivos del huésped, pero estas técnicas implican procedimientos invasivos en modelos animales vivos9. Solo el monitor AC-DC EPG puede proporcionar información muy detallada en tiempo real sobre los comportamientos de sondeo, ingestión y salivación que ocurren en tejidos vivos opacos del huésped sin la necesidad de procedimientos invasivos y es adaptable para su uso en una amplia variedad de artrópodos10,12.
Este es el primer procedimiento detallado paso a paso para cablear mosquitos, construir un aspirador de insectos y realizar EPG en huéspedes humanos. Se espera que estos protocolos faciliten la adopción de AC-DC EPG en mosquitos que se alimentan de huéspedes humanos. Ejemplos de futuros esfuerzos de investigación que emplean AC-DC EPG pueden incluir estudios sobre mecanismos fundamentales de alimentación sanguínea y daño tisular del huésped10, incluida la identificación de secuencias estereotipadas de comportamientos de sondeo que preceden a la ingestión de sangre, investigación del flujo sanguíneo a través de piezas bucales y comparación de la plasticidad de la alimentación dentro y entre especies de artrópodos / etapas de desarrollo26. La EPG también se puede utilizar para cuantificar los efectos de insecticidas, antialimenticios y repelentes12. Los procedimientos presentados aquí para usar AC-DC EPG para estudiar mosquitos en manos humanas acelerarán estos estudios y permitirán nuevos conocimientos sobre la biología de los mosquitos que se alimentan de sangre.

Los mosquitos causan sufrimiento y pérdidas económicas en todo el mundo debido a su papel como vectores de enfermedades y plagas molestas1. Los mosquitos Anopheles transmiten la malaria, que anualmente causa aproximadamente 219 millones de casos en todo el mundo, más de 400.000 muertes2 y 12 mil millones de dólares estadounidenses en costos directos3. Los mosquitos Aedes son los vectores más notables de importancia para la salud pública porque tienen una presencia casi global y transmiten agentes de chikungunya, dengue, filariasis linfática, fiebre del Valle del Rift, fiebre amarilla y zika, que se cobran vidas, abruman los sistemas de salud y provocan sufrimiento crónico, morbilidad de por vida y discapacidad4,5. Además, los mosquitos Culex transmiten agentes de encefalitis equina, encefalitis japonesa, filariasis linfática, encefalitis de San Luis y fiebre del Nilo Occidental, que afectan tanto a la salud humana como a la animal3,4.
El control de vectores con enfoques basados en insecticidas es el principal método para controlar las enfermedades transmitidas por vectores a nivel mundial6,7. Sin embargo, el número de insecticidas disponibles para el control de mosquitos es limitado. Además, la resistencia a los insecticidas está evolucionando en muchas especies, especialmente en los mosquitos Aedes, lo que afecta nuestra capacidad para combatir las enfermedades transmitidas por vectores e impulsa la necesidad de nuevas estrategias de control6,8. Una mejor comprensión de la biología de los mosquitos, las interacciones mosquito-huésped-patógeno y los procesos que regulan la transmisión de patógenos puede facilitar el desarrollo de nuevas herramientas para el control de vectores6.
Los comportamientos de sondeo e ingestión en los tejidos del huésped pueden afectar la transmisión de patógenos y la patología de la enfermedad9,10,11,12. Por ejemplo, se ingirieron más microfilarias cuando el Aedes aegypti se alimentó directamente de los capilares en lugar de acumular sangre fuera de los vasos rotos13. Por lo tanto, la investigación fundamental y aplicada sobre este tema puede ayudar a desarrollar, refinar y evaluar estrategias de control de mosquitos y otras contramedidas para la transmisión de patógenos. Sin embargo, existen brechas de conocimiento significativas en los detalles de los comportamientos crípticos de alimentación de sangre que ocurren debajo de la superficie de la piel del huésped porque estos comportamientos a menudo requieren procedimientos invasivos en modelos animales vivos o emplean sustratos artificiales transparentes o dietas líquidas9,11,14,15. Las técnicas de electropenetrografía no invasiva (EPG; también llamada gráfico de penetración eléctrica) se han utilizado para estudiar los comportamientos alimenticios de los insectos que se alimentan de plantas relacionados con la transmisión de patógenos de plantas, la resistencia de la planta huésped y los modos de acción de los insecticidas, ya que permiten a los investigadores observar, registrar y cuantificar indirectamente los movimientos y comportamientos de las piezas bucales que ocurren dentro de los tejidos del huésped10,12.
Desde la década de 1950, se han aplicado técnicas electrónicas de monitoreo de penetración a los artrópodos que se alimentan de sangre, incluidos los mosquitos16,17,18,19,20. Sin embargo, la EPG nunca fue ampliamente adoptada para los artrópodos hematoalimentadores porque las actividades biológicas correspondientes a las formas de onda nunca fueron verificadas21. Además, los diseños y la electrónica de los primeros instrumentos dieron lugar a un énfasis excesivo en algunas señales eléctricas, altas relaciones ruido-señal, baja resolución y distorsión de las formas de onda, e irritación para los huéspedes vertebrados12,22. Un instrumento más reciente, el monitor AC-DC EPG 23, tiene configuraciones variables y un procesamiento de señal mejorado, lo que lo hace más adecuado para registrar artrópodos que se alimentan de sangre y descifrar los orígenes biológicos de las formas de onda en estudios experimentales de correlación10,12.
Para EPG, se aplica una señal eléctrica al host a través de una sonda de voltaje de sustrato (es decir, un electrodo de referencia). El artrópodo se conecta a un electrodo de registro y se coloca en el huésped. Cuando el artrópodo inserta sus piezas bucales (es decir, estiletes) en el huésped, la señal eléctrica se transmite al monitor AC-DC EPG para el procesamiento de la señal. Luego, las señales eléctricas se muestran en una computadora como "formas de onda" que corresponden a comportamientos específicos como los movimientos de las piezas bucales, la ingestión, la salivación y la adquisición/inoculación de patógenos10,12. Las variables de respuesta secuenciales y no secuenciales relacionadas con la duración y el recuento de las formas de onda24,25 en diferentes niveles jerárquicos (familias, tipos y subtipos) se pueden calcular en función de la frecuencia y la duración de las formas de onda para obtener información sobre los comportamientos de alimentación que ocurren dentro y entre las especies, y en respuesta a factores bióticos y abióticos, como huéspedes, patógenos, pesticidas y condiciones ambientales10,12.
Hasta ahora, el monitor AC-DC EPG se ha utilizado para caracterizar los comportamientos de sondeo e ingestión de Ae. aegypti26 y Culex tarsalis27 mosquitos alimentándose de manos humanas, y las garrapatas Dermacentor variabilis y Amblyomma americanum alimentándose de terneros bovinos28. Además, recientemente se desarrolló un modelo murino para EPG29 para facilitar los estudios de patógenos utilizando este instrumento. Las manos humanas son ideales para la caracterización inicial de la forma de onda del mosquito porque los huéspedes humanos pueden informar cuándo sienten el sondeo del mosquito, así como otros comportamientos, lo que facilita la correlación de las formas de onda con los comportamientos (Tabla 1). Además, una mejor comprensión de la plasticidad en los comportamientos alimentarios entre los mosquitos en diferentes poblaciones humanas podría contribuir al desarrollo de intervenciones de manejo más especializadas para los mosquitos y los patógenos que transmiten.
Tabla 1: Descripción de las familias de formas de onda utilizadas para clasificar las señales eléctricas registradas de Culex tarsalis en manos humanas utilizando AC-DC EPG. La fase de sondeo y las actividades biológicas correspondientes a cada familia de formas de onda. Consulte Cooper et al.27 para obtener más información. Abreviatura: CA = corriente alterna, CC = corriente continua, EPG = electropenetrógrafo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66877/Table1_31July2024.xlsx" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Para facilitar el uso de EPG para estudiar la biología de los mosquitos y las interacciones huésped-vector, aquí se presenta la metodología para cuantificar los comportamientos alimentarios de los mosquitos Cx. tarsalis en manos humanas utilizando el monitor AC-DC EPG. Estos protocolos se basan en los procedimientos fundamentales de AC-DC EPG descritos en los recursos en línea30 y asumen que los usuarios tienen un conocimiento práctico básico de AC-DC EPG y el software asociado31. Los procedimientos descritos pueden modificarse para otras especies de mosquitos y huéspedes y proporcionan una base para facilitar la investigación basada en hipótesis sobre los comportamientos de alimentación de los mosquitos.
Tabla 2: Definiciones de la terminología común de AC-DC EPG. Las definiciones se basan en las que se dan en los recursos en línea30,31 y en la literatura científica32. Abreviatura: CA = corriente alterna, CC = corriente continua, EPG = electropenetrógrafo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66877/66877_Table 2.xlsx" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

<table><tbody><tr><td>Instrumentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AC-DC Electropenetrógrafo de 4 canales</td><td>EPG Technologies, Inc.</td><td></td><td>Para EPG, incluye la fuente de alimentación, la caja de control, la caja de interfaz del interruptor, cuatro amplificadores de etapa principal, cuatro sondas de voltaje de sustrato y cables asociados Las</td></tr><tr><td>almohadas de aire</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para que el huésped humano apoye su mano/brazo durante EPG</td></tr><tr><td>DI-710 Hardware de adquisición de datos (placa AD)</td><td>DATAQ Instruments Inc.</td><td></td><td>para digitalizar las señales analógicas de EPG para que puedan visualizarse en un ordenador</td></tr><tr><td>Lámpara de aumento LED regulable, lupa grande de 5X manos libres con luz y soporte para lectura Pasatiempos Manualidades Banco de trabajo de costura</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para la observación del comportamiento durante la EPG; solo úselo desenchufado durante la EPG o puede resultar ruido</td></tr><tr><td>Microscopio digital Dino-Lite Edge (aumento de 250x)</td><td>Dino-Lite</td><td>AF4915ZT</td><td>para la observación del comportamiento durante EPG</td></tr><tr><td>Soporte de escritorio Dino-Lite Flex-arm</td><td>Dino-Lite</td><td>MS22B</td><td>para sujetar y manipular la cámara</td></tr><tr><td>Soporte de base de retorta de acero Eisco y juego de varillas</td><td>Fisher Scientific</td><td>S41740</td><td>para sujetar el amplificador de la etapa principal y conectar a tierra la jaula de Faraday (debe ser de metal)</td></tr><tr><td>Taller en línea EPG</td><td>UF IFAS Extension</td><td>https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022</td><td>AKA, "recursos en línea" para aprender EPG (configuración de instrumentos, recopilación y análisis de datos, construcción de Faraday, preparación de cola de plata, construcción de talones de insectos, etc.)</td></tr><tr><td>Regulador de potencia/acondicionador de potencia Furman P-1800 AR</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para reducir el ruido de la línea</td></tr><tr><td>Envoltura de amortiguación de burbujas pequeñas</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para usar como barrera entre el anfitrión y la jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Troemner Talboys Labjaws Soporte de abrazadera regular</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-217-121</td><td>para sujetar el amplificador de la etapa principal y conectar a tierra la jaula de Faraday (debe estar hecho de metal y no estar recubierto de plástico)</td></tr><tr><td>Computadora con Windows</td><td>Best Buy</td><td></td><td>for EPG & statistical analysis</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Backus 2.0 Data Analysis SAS program&nbsp;</td><td>UF IFAS Extension</td><td>https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/</td> <td>para el análisis estadístico de datos de forma de onda</td></tr><tr><td>Ebert 1.0 File Manipulator and Error Checker Programas SAS</td><td>UF IFAS Extension</td><td>https://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/</td> <td>para la preparación de archivos para el análisis estadístico de datos de forma de onda</td></tr><tr><td>SAS versión 9.4</td><td>SAS Institute Inc.</td><td></td><td>para el análisis estadístico de datos de forma de onda</td></tr><tr><td>WinDaq Lite&nbsp;</td><td>DATAQ Instrumentos, Inc.</td><td></td><td>para el registro y la revisión de los datos de EPG. Incluye el software WinDaq Hardware Manager (AKA, "software de gestión de hardware") y el software WinDaq Waveform Browser (AKA, "software de revisión de forma de onda"). Solo para uso en computadoras con Windows.</td></tr><tr><td>jaula de Faraday</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>marco de pantalla de aluminio</td><td>Home Depot</td><td>MSCF5167</td><td>para las paredes de la jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Lámina de aluminio, 0,125 (1/8) de espesor 3003-H14</td><td>Metals Depot</td><td>S318</td><td>para la base de la jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Tirantes de esquina, 1"&nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>339547</td><td>para las paredes de la jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Tornillos de máquina Phillips de cabeza plana, # 6-32 x 1 "</td><td>Home Depot</td><td>459999</td><td>para la construcción de jaulas de Faraday</td></tr><tr><td>Arandelas planas, # 6&nbsp;</td><td>638977 de Home Depot</td><td></td><td>para la construcción de jaulas de Faraday</td></tr><tr><td>El multímetro digital Fluke 15B+, para aplicaciones eléctricas, mide mediciones de voltaje y corriente CA/CC de hasta 1000 V y 10 A, junto con capacidades de resistencia, continuidad, diodo y capacitancia</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para probar la jaula</td></tr> <tr><td>de FaradayRadio portátil AM FM, Goodes Radio de transistor con altavoz, conector para auriculares, radio a pilas 2AA para recepción de largo alcance, radio de bolsillo para uso en interiores, exteriores y emergencias</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para probar la jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Pantalla de cobre puro, malla 16 x 16 con diámetro de alambre de 0,11, 36" x 12'</td> <td>Obras de pantalla</td><td></td><td>Metro para&nbsp; las paredes de la jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Tornillos de máquina combinados de cabeza redonda, #6-32 x 3/4"</td> <td>Home</td> <td>Depot</td><td>528466 para la construcción de jaulas de Faraday</td></tr><tr><td>Papel de lija, 1/2" por 1", grano 150</td><td>Home Depot</td><td>19036-20-CC</td><td>para quitar la pintura de la parte inferior del soporte de laboratorio</td></tr><tr><td>Esquinas del marco de la pantalla, 5/16"&nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>WCORN516</td><td>para las paredes de la jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Ranura de pantalla, 0.14"&nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>3034719</td><td>para las paredes de la jaula de Faraday</td></tr><tr><td>Insect Stubs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brass Escutcheon</td><td>Pins Home Depot</td><td>801294</td><td>para construir talones de insectos&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Alambre de cobre, 20 AWG</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para construir trozos de insectos&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Harris soluble en agua gripe &nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>355398</td><td>para ayudar a soldar a recubrir el alambre de los dientes de insectos y formar una conexión fuerte</td></tr><tr><td>Alicates de punta fina</td><td>Home Depot</td><td></td><td>para doblar alambre al construir trozos</td></tr><tr><td>de insectos Pro's Kit 900-015 Helping Hands Ayuda</td> a la soldadura <td>Amazon.com</td><td></td><td>para sujetar los pasadores del escudo durante la soldadura</td></tr><tr><td>Soldadura (con núcleo de colofonia)</td><td>Home Depot</td><td>296497</td><td>para la construcción de talones de insectos&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Herramienta peladora de corte de alambre</td><td>Home Depot</td><td></td><td>para pelar y cortar alambre de cobre al construir trozos de insectos</td></tr><tr><td>YIHUA 928D-III Soldador, 110W de alta potencia, pantalla totalmente digital</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para construir trozos de insectos; viene con un soporte, esponja y lana de acero para limpiar</td></tr><tr><td>Insect Aspirator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspirador de laboratorio Accuris ASPIRE</td><td>Instrumentos Accuris</td><td>V0020</td><td>para aplicar succión al aspirador de insectos; incluye el controlador de vacío de mano, el adaptador de acero inoxidable de punta fina (40 mm) y el adaptador de punta de pipeta</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur de Chemglass Life Sciences, de 5 3/4" de largo</td><td>NC0230004 Fisher Scientific</td><td></td><td>para su uso como aspirador de insectos cuando se cablean mosquitos</td></tr><tr><td>Cinta aislante de vinilo de color eléctrico comercial</td><td>Home Depot</td><td></td><td>para fijar la pipeta Pasteur modificada a la línea de vacío</td></tr><tr><td>Tela utilitaria para mosquiteros, cuadrado de 10 x 10 cm</td><td>Joann Fabrics</td><td>16651622</td><td>para evitar que los mosquitos sean aspirados en la bomba de vacío</td></tr><tr><td>Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-206-8914</td><td>para cambiar de forma rápida y sencilla entre diferentes pipetas Pasteur modificadas,</td></tr><tr><td>desconectadores rápidos de HDPE Thermo Scientific Nalgene (de 3/8 a 7/16 pulg. Identificación.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-315B</td><td>para un cambio rápido y sencillo entre diferentes pipetas Pasteur modificadas</td></tr><tr><td>Silver Glue&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elmer's Glue-All Multi Purpose White Glue</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para la preparación de pegamento de plata</td></tr><tr><td>Escamas de plata 99.9% pura,&nbsp; 4-8 &micro; m</td><td>ThermoFisher</td><td>786.09</td><td>para la preparación de cola de plata</td></tr> Silver <tr><td>Flake 99,95% puro, 8-10 y micro; m</td><td>Inframat Advanced Materials</td><td>47MR-12F</td><td>para la preparación de pegamento de plata</td></tr><tr><td>Anesthesia de insectos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 kit de burbujeo, 1000 mL, #9 Rubber Stopper</td><td>FlyStuff</td><td>59-181</td><td>para prevenir la desecación de insectos mientras se usa el</td></tr><tr><td>flypad Flypad&nbsp; marco, tamaño estándar</td><td>FlyStuff</td><td>59-118</td><td>para evitar que los mosquitos se caigan de la almohadilla</td></tr><tr><td>Flystation Brush</td><td>FlyStuff</td><td>59-205</td><td>para reducir la estática cuando se trabaja en una almohadilla</td></tr><tr><td>Flystuff&nbsp; Flypad&nbsp; tamaño estándar</td><td>FlyStuff</td><td>59-114</td><td>AKA "almohadilla de anestesia" para anestesiar mosquitos</td></tr><tr><td>Embudo (4 pulgadas de diámetro)Amazon.com</td><td></td><td></td> <td>para gasear tazas de mosquitos antes de transferirlas al flypad</td></tr><tr><td>Plexiglás o una tapa de plástico plana (cortada a medida)</td><td>Home Depot</td><td>MC-27</td><td>para cubrir el flypad si los mosquitos comienzan a despertarse</td></tr><tr><td>Cierre Abrazaderas de manguera de tubería de plástico de una sola posición y ajustables Apertura (variedad de 1/8" a 1/2")</td> <td>Amazon.com</td><td></td><td>para desviar el gas entre el flypad y el embudo</td></tr><tr><td>Regulador de CO2 de una sola etapa</td><td>FlyStuff</td><td>59-142</td><td>para regular el flujo de gas del tanque de CO2</td></tr><tr><td>" T&rdquo; Racor para tubo de 1/8" de diámetro interno</td><td>FlyStuff</td><td>59-123</td><td>para conectar tanto el flypad como el embudo al tanque de CO2</td></tr><tr><td>Tubo, transparente&nbsp;</td><td>FlyStuff</td><td>59-124C</td><td>para conectar el embudo y la almohadilla al regulador en el tanque de CO2</td></tr><tr><td>Insect Wiring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cartulina negra, (65Lb, 176 g/m2) 8.5" x 11"</td> <td>Michael's Stores Inc.</td><td>327826</td><td>para hacer que el alambre de oro sea más fácil de visualizar</td></tr><tr><td>Papel de construcción negro cuadrado de 3.5" x 4.0"</td> <td>Grapas</td><td>956221</td><td>para hacer que el alambre de oro sea más fácil de visualizar</td></tr><tr><td>Bolas de algodón</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para los mosquitos en ayunas</td></tr><tr><td>Bloque de espuma artesanal #12 (3,1 cm x 17,2 cm x 30,2 cm)</td><td>Tienda de telas y manualidades Joann</td><td>1941079</td><td>para sujetar mosquitos con cable</td></tr><tr><td>Cinta Deflecto Dispensador, Amazon.com</td><td></td><td></td> transparente <td>para almacenar hilo de oro</td></tr><tr><td>Pinza de entomología de peso pluma</td><td>Fisher Scientific</td><td>S72110</td><td>para la manipulación de insectos</td></tr><tr><td>Pinzas finas (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>para hacer un lazo de oro al cablear mosquitos</td></tr><tr><td>Pincel de punta fina</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para la manipulación de mosquitos durante el cableado y EPG; debe tener un mango de plástico o madera si se usa para EPG</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia estándar de punta fina, estrechas, 5,8 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>7761D21</td><td>para la preparación de cola de</td></tr><tr><td>plata Alambre de oro, 99,99% puro, 0,025 mm de espesor</td><td>Goodfellow</td><td>AU005121</td><td>para el cableado de mosquitos</td></tr><tr><td>Pines minutiens, punta 0,2 mm, 1 cm</td><td>NC9681411 Fisher Scientific</td><td></td><td>para aplicar pegamento a los mosquitos</td></tr><tr><td>Vasos de papel&nbsp;</td><td>Tubo</td><td></td> de papel rígido <td>para mosquitos en ayunas&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Tornillo de banco</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-996-811</td><td>para sujetar el alfiler minucioso durante el cableado de insectos</td></tr><tr><td>Caja de almacenamiento de plástico con tapa (7 pulgadas x 9 pulgadas x 14 pulgadas)</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para transportar mosquitos con cable</td></tr><tr><td>Plexiglás o una tapa de plástico plana (cortada a medida)</td><td>Home Depot</td><td>MC-27</td><td>para cubrir la almohadilla si los mosquitos comienzan a despertarse</td></tr><tr><td>Pinzas de cierre automático</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-906</td><td>para sujetar y manipular el tanque</td></tr> de <tr><td>><<> >< oro< / fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 gas</td><td>Matheson Gas</td><td></td><td>para anestesiar mosquitos con un flypad</td></tr><tr><td>Artículos de laboratorio comunes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolsas de autoclave desechables de riesgo biológico, 8 1/2" x 11"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>03-410-591</td><td>para la eliminación de mosquitos alimentados con sangre Quemador</td></tr><tr><td>Bunsen o soplete de propano</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para la modificación de pipetas Pasteur Cinta de</td></tr><tr><td>laboratorio de colores</td><td>Daigger Supplies</td><td>EF9763R</td><td>para etiquetar, preparar pegamento de plata y pinzas de enmascarar</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta desechables, 1000 y micro; L</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>para alícuota de agua al hacer cola de plata</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>para el cableado de mosquitos</td></tr><tr><td>Sonda de disección</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9109673</td><td>para agitar&nbsp; y aplicar cola de plata</td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer, 1000 mL</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>para prevenir la desecación de insectos mientras se usa la almohadilla para moscas</td></tr><tr><td>Etanol, 70%&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-122</td><td>para recuperar mosquitos escapados</td></tr><tr><td>Placas de Petri de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747B</td><td>para anestesiar mosquitos con hielo</td></tr><tr><td>Guantes</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>para protección personal</td></tr><tr><td>Kimwipes Limpiaparabrisas de la marca KimTech Science para tareas delicadas&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>para triturar</td></tr><tr><td>mosquitos Batas de laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>para la protección personal</td></tr><tr><td>LiBa Botellas de spray, recargables Botellas de spray vacías (aptas para alcohol isopropílico)</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para recuperar mosquitos escapados</td></tr> Barra agitadora <tr><td>magnética, 2 cm de largo</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>para mezclar cola de plata</td></tr><tr><td>Pipeta mecánica monocanal, 1000 y micro; L</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-690-032</td><td>para alícuotas de agua al hacer pegamento de plata</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,5</td><td>mL Fisher Scientific&nbsp;</td><td>780420</td><td>para el almacenamiento de cola de plata</td></tr><tr><td>Parafilm M&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-944</td><td>para sellar tubos de cola de plata</td></tr><tr><td>Envoltura de plástico</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para cubrir el bloque de espuma</td></tr><tr><td>Pyrex 20 mL Vaso de precipitados</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>07-250-051</td><td>para mezclar cola</td></tr><tr><td>de plata Semi-Micro Balance</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>10-919-370</td><td>para pesar pegamento y escamas de plata</td></tr><tr><td>Rotulador Sharpie, punta fina</td><td>Amazon.com</td><td></td><td>para etiquetar</td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de un solo filo</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>71980</td><td>para la limpieza de talones de insectos</td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia desechables estándar Fisher</td><td>Scientific&nbsp;</td><td>133-711-7mL</td><td>para transferir pegamento de plata a un tubo de almacenamiento&nbsp;</td></tr><tr><td>Plato de agitación</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>para mezclar cola de plata</td></tr><tr><td>Temporizador/cronómetro</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>para cronometrar cuánto tiempo está expuesto el huésped a cada insecto</td></tr><tr><td>Agua ultrapura (18 M&Omega;)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>para la preparación de cola</td></tr><tr><td>de plata Tijeras utilitarias</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-945</td><td>para cortar alambre de oro</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td>para mezclar pegamento</td></tr> <tr><td>de plataStudy Organisms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culex tarsalis mosquitos</td><td>USDA ARS Center for Grain and Animal Health Research en Manhattan, KS</td><td>para su uso como sujetos de estudio</td><td></td></tr></tbody></table>

electropenetrografía ac-dc para el estudio de los comportamientos de sondaje e ingestión de mosquitos culex tarsalis en manos humanas

AC-DC Electropenetrography for the Study of Probing and Ingestion Behaviors of Culex tarsalis Mosquitoes on Human Hands

Los mosquitos transmiten patógenos que afectan negativamente a la salud humana y animal. Una mayor comprensión de su biología de alimentación sanguínea y de sus interacciones con huéspedes y patógenos podría aprovecharse para desarrollar nuevos objetivos para el control de enfermedades transmitidas por mosquitos. Desafortunadamente, los comportamientos de sondeo (es decir, picaduras) de los mosquitos son poco conocidos porque ocurren dentro de los tejidos del huésped. Aquí, se describe un procedimiento no invasivo para el uso de electropenetrografía AC-DC (EPG) para visualizar y cuantificar indirectamente los comportamientos de alimentación de los mosquitos mediante el registro de cambios en las señales eléctricas generadas al sondear e ingerir en manos humanas. Se unen delgados cables de oro a los mosquitos con pegamento conductor de plata y se conectan al instrumento EPG. El huésped humano sostiene una sonda de voltaje de sustrato en su mano. El sondeo del huésped por el mosquito conectado completa el circuito eléctrico, y las señales eléctricas se registran en una computadora como "formas de onda" que luego se pueden medir y enumerar para su análisis. Esta metodología se ha utilizado para caracterizar los comportamientos de sondaje e ingestión de los mosquitos Aedes aegypti y Culex tarsalis y puede aplicarse a otras especies de mosquitos. La EPG se puede utilizar para estudiar los efectos de patógenos, insecticidas y otros factores en los comportamientos de alimentación de los mosquitos.

Las grabaciones EPG de corriente alterna y continua (AC-DC) de la alimentación con sangre de mosquitos Cx. tarsalis sobre manos humanas (Figura 4) generaron formas de onda interpretables adecuadas para análisis y publicación27. Las formas de onda interpretables contenían patrones repetitivos distintos y diferenciables que podían clasificarse en familias (Tabla 1 y Figura 4), tipos y subtipos cuando se ajustaba la compresión (definida en la Tabla 2) y la ganancia del software en el software de revisión de formas de onda27,31. Todas las familias de formas de onda (J, K, L, M, N) y tipos (L1, L2, M1, M2) descritos previamente en Ae. aegypti alimentándose sobre manos humanas26 se identificaron en las formas de onda generadas por Cx. tarsalis alimentándose sobre manos humanas, lo que verifica la validez de los métodos descritos aquí. Además, se identificaron tres nuevos tipos de formas de onda (M3, N1, N2) y numerosos subtipos de L1, L2, M1 y M227. Asimismo, la caída de voltaje de regreso a la línea base cuando las piezas bucales se retiran del huésped fue denominada familia de formas de onda W27.
La variación sistemática de los ajustes del instrumento (tipo de corriente y niveles de Ri) siguiendo los procedimientos descritos aquí permitió determinar los ajustes óptimos para registrar la alimentación de Cx. tarsalis sobre manos humanas, los orígenes eléctricos de cada forma de onda, la duración promedio en segundos de las punciones completas e incompletas por mosquito, y la comparación estadística de la duración de la forma de onda en segundos por insecto (WDI), el número de eventos de forma de onda por insecto (NWEI) y la duración de la forma de onda en segundos por evento por insecto (WDEI) entre los diferentes ajustes27. Además, se interrumpió a los mosquitos durante diferentes formas de onda y se les realizó disección para determinar qué forma de onda se correlacionaba con la ingestión de sangre27. Se llevó a cabo una investigación similar para Ae. aegypti utilizando una metodología comparable26.
Debido a la naturaleza sensible e intrincada del EPG, no todas las grabaciones fueron tan nítidas como las que se muestran en la Figura 4. En ocasiones, picos (Figura 3A,C), cambios en la ganancia del hardware (Figura 3A,C), conexiones defectuosas (Figura 3B), el plegamiento del rectificador en la familia de ondas J (Figura 3C,C') y el ruido eléctrico (Figura 3C,C') distorsionaron y enmascararon las formas de onda, lo que dificultó su análisis y puntuación y las hizo inadecuadas para su uso en figuras de calidad para publicación. Por lo tanto, se recomienda dedicar esfuerzo inicial a perfeccionar las habilidades de conexión, optimizar la ganancia y los ajustes de voltaje, ajustar el desplazamiento (offset) y controlar el ruido eléctrico. Curiosamente, el plegamiento del rectificador solo se observó en la familia de ondas J para Cx. tarsalis (Figura 3C,C') y no volvió a presentarse una vez que se ajustó inicialmente el desplazamiento, incluso cuando se utilizaron otras especies de mosquitos (Ae. aegypti y Culex quinquefasciatus) (datos no mostrados). Además, el diagnóstico reveló que el ruido eléctrico no controlado mostrado en la Figura 3 (paneles C y C') se debió a una jaula de Faraday defectuosa. Las grabaciones realizadas en la jaula de Faraday defectuosa aún fueron utilizables, pero los problemas de ruido se resolvieron al construir una jaula de Faraday mejorada (Figura 1B).
Aunque se tomaron todas las precauciones y optimizaciones iniciales, ligeras variaciones en la calidad de la conexión del electrodo al mosquito y otros factores desconocidos que distorsionaban la señal y alteraban periódicamente la relación señal-ruido hicieron necesario ajustar la ganancia del hardware durante la grabación, para asegurar que la señal estuviera dentro del rango visible y que la resolución de los picos en cada forma de onda fuera suficiente para su identificación y caracterización. Desafortunadamente, ajustar la ganancia del hardware durante la grabación puede provocar cambios bruscos de voltaje (Figura 3A, C), lo que hace que las formas de onda no sean adecuadas para su publicación, pero aún utilizables (en su totalidad o en parte) para mediciones y análisis.
<img alt="Diagramas de equilibrio estático que muestran el análisis de fuerzas; las gráficas resaltan las ecuaciones ΣFx=0, ΣFy=0." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66877/66877fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Formas de onda representativas de una sonda de Culex tarsalis sobre una mano humana registradas con una Ri de 107 Ω utilizando una señal aplicada de 250 mV AC. Los nombres de las formas de onda a nivel de familia (NP, J, K, L, M, W) se muestran en la parte superior de cada panel. Los paneles inferiores muestran ampliaciones de regiones seleccionadas del panel A. Los paneles insertados muestran ampliaciones de las regiones indicadas. Las escalas de tiempo y las ganancias del software son: (A) 7.0 s/div, 16x; (B) 1.0 s/div, 64x; (B') 0.2 s/div, 64x; (C) 1.0 s/div, 64x; (C') 0.2 s/div, 32x; (D) 1.0 s/div, 64x; (D') 0.2 s/div, 64x. Abreviaturas: AC = corriente alterna, Ri = resistencia de entrada, mV = milivoltio, Ω = ohmios, s/div = segundos por división. Esta figura fue elaborada con datos de Cooper et al.27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66877/66877fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se describen procedimientos para estudiar los comportamientos de sondeo e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas utilizando electropenetrografía AC-DC.

Electropenetrografía AC-DC para el estudio de los comportamientos de sondaje e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas

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