Electropenetrografía AC-DC para el estudio de los comportamientos de sondaje e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas

Nuestro grupo está utilizando EPG para estudiar cómo los arbovirus y otros factores afectan los comportamientos de sondaje e ingestión que ocurren durante la alimentación con sangre, ya que muchos patógenos manipularán el comportamiento del vector para mejorar la transmisión. Básicamente, estamos estudiando lo que sucede durante una picadura de mosquito y cómo esos comportamientos influyen en la transmisión de patógenos y la patología de la enfermedad. Históricamente, la EPG se utilizaba principalmente para estudiar los insectos que se alimentaban de plantas.

El reciente desarrollo de los procedimientos AC-DC EPG para artrópodos que se alimentan de sangre nos permite estudiar los comportamientos de sondeo e ingestión que ocurren durante la alimentación con sangre con un detalle sin precedentes sin la necesidad de procedimientos invasivos, lo que posiblemente permita el desarrollo de nuevas estrategias de manejo. El mayor desafío de usar EPG en artrópodos que se alimentan de sangre es correlacionar las formas de onda con actividades biológicas como la salivación y la transmisión de patógenos. Tenemos hipótesis sólidas basadas en los orígenes eléctricos de las formas de onda y en la literatura, pero aún necesitamos evidencia empírica.

Para comenzar, pase la punta de una pipeta de vidrio para pastos a través de una llama, girando ligeramente la pipeta. Inspeccione el diámetro y repita el proceso para llevar la pipeta al tamaño deseado. Para hacer un aspirador de insectos, cubra el extremo grande de la pipeta de pasto modificada con una mosquitera e insértelo en el tubo de silicona conectado a un aspirador de laboratorio que asegure la unión con cinta aislante.

Para los electrodos de registro, envuelva un bloque de espuma con una envoltura de plástico fresca para sujetar los trozos de insectos preparados y los mosquitos cableados. Raspe el centímetro superior del alambre de cobre con una cuchilla de afeitar hasta que esté brillante por todos lados. A continuación, corte el alambre de oro de 0,025 milímetros de diámetro en trozos de cuatro a cinco centímetros de largo.

Sostenga el alambre en pinzas de cierre automático enmascaradas con cinta adhesiva para evitar abollar el alambre, envuelva suavemente el alambre dorado tres veces alrededor del alambre de cobre del trozo de insecto comenzando a lo largo de la punta limpia del alambre de cobre. Usa una sonda de disección para aplicar pegamento de plata para mantener el alambre de oro en su lugar. Después de asegurarse de que no haya ningún extremo suelto, coloque el trozo de insecto en la espuma hasta que el pegamento se seque.

Luego, acaricie suavemente el alambre dorado unido al trozo de insecto para darle forma de un arco largo y suave, y recorte el alambre a aproximadamente 2,5 a 3 centímetros de largo. Trabajando bajo un microscopio de disección, sostenga el trozo de insecto por el clavo de latón con la mano no dominante mientras el alambre de oro toca la etapa del microscopio de disección y agarre el extremo del alambre de oro con pinzas de punta fina con la mano dominante, use las pinzas de punta fina para cruzar la punta del alambre de oro sobre el alambre de cobre del trozo de insecto cerca del área pegada. A continuación, tire suavemente del trozo de insecto hasta que el alambre de oro forme un pequeño bucle de oro alrededor de las pinzas de punta fina.

Suelta el alambre de oro y retira con cuidado las pinzas. Mientras sostiene el trozo de insecto con la mano no dominante, agarre el lazo de oro con pinzas de punta fina. Tire del trozo de insecto mientras gira ligeramente las pinzas lejos del trozo hasta que el lazo se doble en un ángulo de 90 grados con respecto al cuello del alambre.

Asegúrese de que el bucle de oro esté completamente cerrado antes de devolver el trozo de insecto al bloque de espuma. Para comenzar, prepare el aspirador de insectos y los electrodos de registro para el cableado de los mosquitos. Coloque a los mosquitos anestesiados boca arriba en la almohadilla de anestesia con el abdomen mirando hacia el investigador.

Después de colocar una cinta de laboratorio, aplique una gota de 0,5 centímetros de pegamento de plata recién mezclado sobre la cinta. A continuación, aspire el abdomen de un mosquito anestesiado en el aspirador. Usar la succión solo el tiempo suficiente para asentar el abdomen en su lugar y sostener el mosquito debajo del endoscopio de disección por encima del pegamento de plata usando el aspirador.

Después de sumergir un alfiler de minuchin en el pegamento de plata, aplique una capa delgada al pronoto del mosquito. Sumerja rápidamente el bucle de oro en la punta del electrodo de registro en el pegamento de plata. Colócalo en el punto de pegamento plateado en el pronoto del mosquito y balancea el lazo hacia adelante y hacia atrás para asegurarte de que quede al ras.

A continuación, vuelva a colocar el trozo de insecto en la espuma en un ángulo que permita que el mosquito conectado se pare cómodamente cuando se despierte. Una vez que se haya conectado la cantidad deseada de mosquitos, coloque el bloque de espuma en una caja de almacenamiento y manténgalo. Para comenzar, conecte los electrodos de registro a los mosquitos el día del experimento de electropenetografía o EPG.

Una vez que el host esté en posición, gire el amplificador principal hacia un lado. Después de quitar un mosquito con cable, inserte la clavija de latón del trozo de insecto en el puerto del amplificador principal. Inicie la grabación utilizando el software de gestión de hardware.

Coloque el amplificador de cabeza por encima de la mano para que el mosquito pueda pararse cómodamente y sondear. Encienda el amplificador principal mientras está conectado a tierra. Ajuste la posición de la mano del anfitrión según sea necesario para ayudar a que el sondeo se realice correctamente.

Utilice el software de administración de hardware para realizar observaciones con marca de tiempo sobre las respuestas del huésped, los comportamientos de los mosquitos, los cambios de ganancia y otros eventos relevantes durante la grabación. Ajuste la posición de las señales en la pantalla y la ganancia del software utilizando el software de gestión de hardware para mantener ambas señales claramente visibles. Para ajustar la ganancia de hardware, cambie el rango de canal uno y los interruptores multiplicadores.

Si ese ajuste no es suficiente, gire el dial de ganancia del canal uno hacia la derecha o hacia la izquierda para aumentar o disminuir la ganancia, respectivamente, para evitar picos o picos poco claros. Para ajustar el desplazamiento, gire el interruptor de desplazamiento del canal uno en la caja de control a negativo. A continuación, gire el dial de desplazamiento del canal uno hasta que los picos de las señales previa y posterior se produzcan en la misma dirección en la pantalla del ordenador.

Si el mosquito está en medio de una sonda, deje que termine. Si no sondea dentro de los 10 minutos, apague el amplificador principal. Pídele al huésped que se quite la mano con cuidado y luego retira el mosquito con el trozo de insecto adjunto.

Finalmente, vuelva a colocar el mosquito en la caja de almacenamiento. Las grabaciones AC-DC EPG de mosquitos Culex tarsalis alimentándose de manos humanas generaron formas de onda interpretables adecuadas para la clasificación en familias, tipos y subtipos.