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</ol>

<table><tbody><tr><td>-80 &deg;C almacenamiento</td><td></td><td></td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>0.1% gelatina en agua</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-006-B</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Unidades de filtro de 0.2 &micro;m</td><td>Fisher</td><td>04-977-158</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>0.5% tripsina-EDTA (10X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 7.5</td><td>ThermoFisher</td><td>15567027</td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9855G</td><td>Opcional: para insertar FTA en un locus de proteína ribosomal endógena</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1.5 y 2 mL, esterilizados</td><td></td><td></td><td>Para transfección</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1.5, 2 mL y 5 mL de unión baja para proteínas</td><td>Eppendorf</td><td>022431081, 022431102, 0030108302</td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejido de 10 cm</td><td></td><td></td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>72068-100ML</td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>Concentrado de tampón de funcionamiento Tris/glicina/SDS 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo de tejido de 37 &deg;C x 2</td><td></td><td></td><td>Para cultivo celular. Uno de estos sirve como incubadora principal para cultivo celular e iluminación de células transfectadas. Se necesita espacio temporal en una segunda incubadora el día de la activación de ALIBi para alojar las células transfectadas mientras se configura el transiluminador en la incubadora principal.</td></tr><tr><td>Baño de agua de 37 &deg;C</td><td></td><td></td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>50 mM biotina</td><td>ThermoFisher</td><td>B20656</td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>Tampon Laemmli 6x</td><td>FIsher</td><td>50-196-784</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td>Para desinfección</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td>Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>Kit de proteasa AcTEV</td><td>ThermoFisher</td><td>12575015</td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>Plasmid ALIBi C-fragment</td><td>Addgene</td><td>#235615, 235636 &ndash; 235641</td><td>Se requiere escala midi-prep para transfección</td></tr><tr><td>Plasmid ALIBi N-fragment</td><td>Addgene</td><td>#235614, 235635, 235642, 235643</td><td>Se requiere escala midi-prep para transfección</td></tr><tr><td>Hoja de aluminio</td><td></td><td></td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>bicarbonato de amonio</td><td>MilliporeSigma</td><td>5.3305</td><td>Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-FLAG</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3165</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-GAPDH</td><td>Cell Signaling</td><td>5174</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario anti-ratón</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931V</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario anti-conejo</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934V</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Rpl12</td><td>Abcam</td><td>ab175219</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Rpl31</td><td>Abcam</td><td>ab103991</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-Rpl5</td><td>ProteinTech</td><td>15430-1-AP</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-V5</td><td>ThermoFisher</td><td>R960-25</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Apirasa</td><td>NEB</td><td>M0398L</td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol (55 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul</td><td>Clare Research Chemical</td><td>DR46B (pequeño) o DR196 (grande)</td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Puntas C18 (punta C18 OMIX)</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>Contenedor de congelación celular</td><td></td><td></td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Centrífuga adaptada para tubos cónicos de 15 mL y/o 50 mL</td><td></td><td></td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Centrífuga para tubos de microcentrífuga de 1.5-2 mL</td><td></td><td></td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad. Debe ser capaz de refrigeración hasta 4 C y velocidades de hasta 17,000 g. Idealmente, está ubicado en una habitación que puede oscurecerse temporalmente mientras se transfieren los tubos.</td></tr><tr><td>Kit Clarity ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Tanque de gel Criterion</td><td>Bio-Rad</td><td>1656001</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Geles pre-moldeados Criterion TGX, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>5671095</td><td>Para Western blot. Se encuentran disponibles tamaños y diseños de pozos adicionales</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7698-5G</td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>Deoxicolato</td><td>MilliporeSigma</td><td>S1827</td><td>Para lisis &amp; purificación por afinidad</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>ThermoFisher</td><td>PIA39255</td><td>Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>FBS calificado para ES</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-009-B</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Gold Shield</td><td>412828</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>459828</td><td>Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>MilliporeSigma</td><td>A117</td><td>Opcional: para preparación de muestras de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>Analizador de tamaño de fragmentos y consumibles</td><td></td><td>Agilent

aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

Isolation of Subcellular Ribosome Subpopulations Based on Recombinant Peptide Tag-Specific Location-Restricted Illumination-Enhanced Biotinylation

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

Growing evidence suggests that mRNA translation is a highly compartmentalized process within a cell, and that subcellular trafficking and localization of ...

Our research investigates how ribosome composition and mRNA translation vary across subcellular domains to regulate local protein synthesis. Current methods lack spatial and temporal precision. ALIBi addresses this through optogenetically controlled proximity labeling of ribosomes.To begin, obtain L31FTA mouse embryonic stem cells and transfect them with ALIBi, GFP control, or full length BirA plasmids. After 24 to 48 hours of transfection, pre-chill the centrifuge to four degrees Celsius. With the lights off, move the transfected plates to a temporary 37-degree Celsius incubator.To prevent temperature fluctuations, once the transilluminator is placed in the main incubator, using 70%ethanol, wipe down the blue light transilluminator. After connecting the transilluminator to power, place it in the main incubator. Allow the incubator conditions to reequilibrate, while continuing the setup.Warm an aliquot of media to 37 degrees Celsius for dosing with biotin and cyclohexamide, or CHX. If preparing control samples without supplemental biotin, warm a separate aliquot for CHX-only dosing. Chill an aliquot of DPBS intended for CHX dosing.Prepare the RNase removal buffer, salt wash, lysis buffer, and wash buffers. Using a pipette, mix buffers containing dense or viscous components to ensure even mixing. Chill the prepared buffers on ice before use.Re-suspend the stock bottle of streptavidin beads by gentle pipetting or rocking. Transfer 450 microliters of beads into a protein low binding tube for each 10 centimeter plate of cells. Place the re-suspended beads on the magnetic rack for one minute, or until the beads have fully migrated.Aspirate and discard the bead storage buffer without touching the bead pellet. Wash the beads two times with 900 microliters of RNAs removal buffer. Wash the beads once with 900 microliters of salt wash.Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer. Store the beads in the wash I buffer at four degrees Celsius while performing activation and cell lysis. Add biotin and CHX to the warmed aliquot of media and keep at 37 degrees Celsius until use.Add CHX to the cold DPBS aliquot and keep it chilled until use. Aspirate the media from the transfected plates. Immediately add 10 milliliters of warm media containing CHX with or without Biotin to each plate.Place negative control plates in a dark incubator. Place the remaining plates directly on top of the transilluminator. Turn on the transilluminator and incubate the plates for 15 minutes.Wash each plate two times with the 10 milliliters of cold DPBS containing CHX. Place the plates on ice between and after washes. After aspirating the second wash, tilt the plate and aspirate any residual DPBS.Keeping the plate flat on ice, add two milliliters of ice-cold lysis buffer and incubate the plate on ice for five minutes. Tap the plate two to three times during incubation to dislodge cells. Using a micropipette, pipette the lysate up and down across the plate surface to dislodge any remaining cells.Transfer the lysate to a chilled labeled protein low binding tube. In difficult to lyse organelles, sonicate all samples for 45 seconds at four degrees Celsius. And if required, transfer the lysate into a larger tube before sonication.Transfer the sonicated lysate into a two-milliliter tube. Incubate the lysate on ice for 15 minutes. Centrifuge the lysate at 17, 000 G for three minutes at four degrees Celsius.Transfer the supernatant into a chilled protein low binding tube without disturbing the pellet. Using a magnetic rack, pellet the washed strepped avident beads. Aspirate the wash one buffer.Transfer 1, 200 microliters of clarified lysate to the tube containing the washed beads. Pipette up and down gently to re-suspend the beads. Store the remaining clarified lysate at minus 80 degrees Celsius.Incubate the lysate with the beads at four degrees Celsius in the dark on a tube rotator for one hour. During the incubation, prepare the Tobacco Etch Virus, or TEV elution buffer. Pellet the beads on a magnetic rack.Transfer the supernatant to a chilled protein low binding tube. Store the supernatant at minus 80 degrees Celsius. Wash the beads two times with 900 microliters of wash I buffer and once with 900 microliters of wash II buffer.Add 450 microliters of TEV elution buffer to the beads. Incubate the beads in TEV elution buffer for one hour at room temperature on a tube rotator. Pellet the beads on the magnetic rack.Transfer the elute to a protein low binding tube. Store the eluate at minus 80 degrees Celsius if proteomics analysis or Western blot is intended. Cells containing all system components showed a L31-FTA band, which was stronger with full length burray and faint or absent when components were omitted.Endogenous biotinilated carboxylase proteins were detected in all lysates at 70 to 80 kilodaltons and 120 to 130 kilodaltons. ANTV5 probing confirmed expression of the split bore fragments. Biotinillated L31FTA decreased in the flow through relative to the lysate.No biotinillated L31-FTA was present in the eluate following TEV-mediated elution. Anti-flag probing showed a cleaved L31-FTA band at a lower molecular weight than intact L31-FTA ribosomal protein. S12 probing demonstrated the presence of the small ribosomal subunit in the eluate.Anti-V5 probing showed that proteins that do not bind the ribosome were absent from the eluate. When 2.5 fold more lysate was used with the same 450 microliters of streptavidin coated beads, a substantial amount of biotinilated L31-FTA remained in the flow through. Endogenous biotinilated proteins were partially depleted in the flow through.Endogenous biotinillated proteins were absent from the eluet, but were recovered after heating post-dilution beads in lambly buffer. Anti-flag probing detected cleaved L31-FTA at a lower molecular weight than intact L31-FTA. Anti-V5 probing showed that the split burray fragments were absent from the eluate.ALIBi enables the identification of ribosome-bound proteins and mRNAs in specific subcellular regions, revealing differences in translation regulation. The key challenge is maintaining specific proximity labeling through careful control of targeting construct expression and illumination conditions. Following this protocol, affinity purified ribosomes and associated mRNAs can be analyzed using quantitative proteomic and transcriptomic approaches.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

Una técnica para identificar sitios traduccionales pausa en ARNm se describe. Este procedimiento se basa en el aislamiento de polipéptidos nacientes acumulan en los ribosomas durante la traducción in vitro de un ARNm diana, seguido por el análisis del tamaño de las cadenas nacientes utilizando una electroforesis en gel de desnaturalización.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

Se describe aquí una técnica que ahora se utilizan habitualmente para aislar de forma estable consolidados complejos ribosoma cadena naciente (RNC). Esta técnica aprovecha el descubrimiento de que un joven de 17 aminoácidos de longitud SecM "secuencia de la detención" puede detener la elongación de la traducción en un procariota...

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Se describen técnicas para diseccionar los mecanismos que subyacen a la secreción de VIH-1 Nef en exosomas. Péptidos específicos cortos derivados de la proteína Nef y transfección fueron explotados para determinar la estructura, la función y las parejas de unión de la secreción Modificación Región de Nef. Estos procedimientos tienen importancia general en muchos estudios sobre el mecanismo.

La identificación basada en péptidos de motivos funcionales y sus parejas de unión

Este protocolo ilustra modificaciones esenciales de fraccionamiento polyribosome con el fin de estudiar la translatome in vivo de muestras del SNC. Permite la evaluación global de la traducción y transcripción de regulación a través del aislamiento y la comparación de ARN total a ribosoma ARN fracciones unidas.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Describimos aquí un método para la identificación de proteínas de unión a moléculas pequeñas utilizando el marcaje de fotoafinidad. La ventaja de esta técnica es que la unión y el marcaje covalente de las proteínas diana se producen dentro del entorno celular vivo, lo que elimina el riesgo de alterar la estructura de la proteína nativa y las condiciones de unión durante la lisis celular.

Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

Aquí, describimos la inmunoprecipitación de ribosomas y el ARN asociado de poblaciones selectas de células germinales macho adultas utilizando el sistema RiboTag. La cría estratégica y la cuidadosa inmunoprecipitación dan como resultado resultados limpios y reproducibles que informan sobre el traducto de células germinales y proporcionan información sobre los mecanismos de los fenotipos mutantes.

RiboTag Inmunoprecipitación en las células germinales del ratón macho

La transferencia de energía de fluorescencia de molécula única es un método que rastrea la dinámica del ARNt durante la síntesis de proteínas ribosómicas. Al rastrear ribosomas individuales, se identifican poblaciones no homogéneas, lo que arroja luz sobre los mecanismos. Este método se puede utilizar para rastrear cambios biológicos conformacionales en general para revelar relaciones de función dinámica en muchos otros biosistemas complejados. Los métodos de molécula única pueden observar...

Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

Presentamos un protocolo de dos pasos para el aislamiento de mitocondrias de alta calidad que es compatible con el descubrimiento y cuantificación de proteínas a escala de proteoma. Nuestro protocolo no requiere ingeniería genética y, por lo tanto, es adecuado para estudiar las mitocondrias de cualquier célula y tejido primario.

Aislamiento de dos pasos sin etiquetas de las mitocondrias para mejorar el descubrimiento y la cuantificación de proteínas

Stanford School of Medicine.  La Biotinilación Mejorada por Iluminación Restringida por Localización específica (ALIBi) es un método novedoso activado optogenéticamente desarrollado para marcar y purificar afinidad poblaciones subcelulares de ribosomas para secuenciación posterior y análisis proteómico.

Aislamiento de subpoblaciones subcelulares de ribosomas basadas en biotinilación potenciada por iluminación restringida por etiquetas péptidas específicas de péptidos recombinantes

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