Name: Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana de Buffy Coats a través de la separación inmunomagnética de perlas de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Aprenda a aislar células mononucleares de sangre periférica humana mediante separación inmunomagnética automatizada de alto rendimiento. Este método mejora la eficiencia del biobanco manteniendo viabilidad celular superior al 90%.

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El Biobanco Estatal de Salud de Nueva Gales del Sur agradece el apoyo de NSW Health Pathology, la Oficina de Salud e Investigación Médica de Nueva Gales del Sur y el Distrito de Salud Local de Sydney. Además, los autores agradecen a Omico y a otros estudios de investigación respaldados por el NSW Health Statewide Biobank por conceder permiso para publicar datos generados internamente y utilizar los especímenes no utilizados con fines de investigación. Los autores agradecen a la profesora Jennifer Bryne (NSW Health Pathology, Universidad de Sydney) por su liderazgo crítico y sus discusiones. La Figura 1 se creó con BioRender.com.

Las muestras de sangre de control de calidad y los datos generados internamente (como el recuento de células, la viabilidad y la edad de la muestra en el procesamiento) se obtuvieron de estudios de investigación consentidos en el NSW Health Statewide Biobank, Royal Prince Alfred Hospital (aprobación de HREC: 2019/ETH06776). Se recolectaron muestras de sangre humana adulta procesadas (es decir, empobrecidas en plasma), no examinadas y no identificadas en tubos de EDTA. Estas muestras de sangre de control de calidad se procesaron menos de 72 h después de la recolección y se utilizaron para experimentos de aislamiento de PBMC comparando el gradiente de densidad y los métodos basados en perlas. Para el método de separación por gradiente de densidad utilizado en los resultados representativos, consulte el procedimiento en el Archivo complementario 1. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado para este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de la sangre entera
<ol><li>Invierta suavemente 10 ml de tubos de sangre entera (recubiertos con ácido etilendiaminotetraacético [EDTA], acido-citrato-dextrosa [ACD] o heparina de litio) 10 veces a temperatura ambiente.</li>
	<li>Opcional: Si se va a almacenar sangre entera, alícuota en criotubos para almacenamiento a -80 °C.</li>
	<li>Centrifugar los tubos con un rotor de cuchara basculante a 800 x g durante 10 min a 22 °C con el freno puesto (9 aceleraciones/9 deceleraciones).</li>
</ol>2. Colección de abrigos buffy
<ol><li>Después de la centrifugación, coloque las muestras en un gabinete de seguridad biológica y verifique las tres capas distintas (como se muestra en la Figura 1). NOTA: Los glóbulos rojos se encuentran en la capa inferior de color rojo oscuro del tubo de centrífuga. Una capa blanca opaca que contiene glóbulos blancos y plaquetas se encuentra por encima de la capa de glóbulos rojos, conocida como capa leucocitaria. La capa amarilla superior contiene plasma.</li>
	<li>Opcional: Si se va a almacenar plasma, alícuota de plasma en criotubos para almacenamiento a -80 °C.</li>
	<li>Pipetear 1 mL de capa leucitaria (material de partida) de un tubo de sangre de 10 mL y transferirlo al tubo especificado y etiquetado en los pasos 3.1 y 4.1 para los métodos manual y automatizado, respectivamente. Agite la capa leucocitaria (capa blanca opaca) con la punta de la pipeta y recoja la capa leucocitaria aspirando. NOTA: Menos de 100 μL de plasma y glóbulos rojos son aceptables durante la aspiración. Si se recolectan varios tubos de sangre para un participante, se pueden juntar los pelajes leucocitarios; sin embargo, esto puede afectar la concentración de plaquetas13.</li>
	<li>Para el procesamiento manual, proceda a la sección 3. Para el procesamiento automatizado, proceda a la sección 4.</li>
	<li>Opcional: Si se van a almacenar glóbulos rojos, alícuotas glóbulos rojos en criotubos para almacenarlos a -80 °C.</li>
</ol>3. Purificación de PBMC - Método manual
NOTA: Un solo operador puede procesar hasta 8 muestras por soporte de imán.
<ol><li>Etiquete 3 tubos de poliestireno de 5 ml con las letras A-C. NOTA: Utilice la numeración secuencial si realiza más de una muestra, es decir, 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>Añada 60 μL de EDTA 0,1 M (para una concentración final de EDTA de 6 mM, pH 8,0, consulte el Archivo Suplementario 2 para la receta) al tubo A que contiene la capa leucocitaria transferida en el paso 2.3.</li>
	<li>Añadir 50 μL del tubo de mezcla de cóctel (ver Tabla de Materiales) al tubo A, mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces, e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Agregue 890 μL de PBS al tubo A y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces.</li>
	<li>Vórtice el tubo de perlas magnéticas (ver Tabla de Materiales) durante 30 s.</li>
	<li>Añada 50 μL de las perlas magnéticas al tubo A y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces.</li>
	<li>Coloque inmediatamente el tubo A en el soporte magnético e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipetear cuidadosamente la suspensión celular enriquecida en el tubo B, recogiendo la fracción clara con glóbulos rojos sin o con un mínimo de (<100 μL) para una recuperación óptima de PBMC. NOTA: No moleste las cuentas unidas al imán. Se recomienda una pipeta de transferencia.</li>
	<li>Retire el tubo A del soporte magnético y deséchelo.</li>
	<li>Añada 50 μL de perlas magnéticas a la suspensión celular en el tubo B y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces.</li>
	<li>Coloque inmediatamente el tubo B en el soporte magnético e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipetear con cuidado la suspensión celular enriquecida en el tubo C, recogiendo solo la fracción clara. NOTA: No moleste las cuentas unidas al imán. Se recomienda una pipeta de transferencia.</li>
	<li>Retire el tubo B del soporte magnético y deséchelo.</li>
	<li>Coloque inmediatamente el tubo C en el soporte magnético e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipetee cuidadosamente la suspensión celular enriquecida en un tubo de centrífuga marcado y rellene hasta 2 ml con PBS.</li>
	<li>Transfiera 50 μL de la suspensión celular a un vaso de muestra del contador celular automatizado. Para un recuento de células de dilución 1:10, agregue 450 μL de PBS. Continúe con la sección 5 para los pasos de conteo de células.</li>
</ol>4. Purificación de PBMC - Método automatizado
NOTA: Se pueden procesar hasta 4 muestras con un solo instrumento PBMC automatizado. Un solo operador puede hacer funcionar varios instrumentos en paralelo.
<ol><li>Etiquete 2 tubos de 14 ml con las letras A y B, 1 tubo de centrífuga de 50 ml con la letra C y 1 tubo de centrífuga de 50 ml con la palabra "residuos". NOTA: Solo se requiere un contenedor de residuos para cada ejecución en el instrumento PBMC automatizado. Utilice la numeración secuencial si realiza más de una muestra, es decir, 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C.</li>
	<li>Añadir 60 μL de EDTA 0,1 M (para una concentración final de EDTA de 6 mM) al tubo A que contiene la capa leucocitaria transferida en el paso 2.3.</li>
	<li>Vórtice el tubo de perlas magnéticas (ver Tabla de Materiales)  durante 30 s.</li>
	<li>Encienda el instrumento PBMC automatizado encendiendo la alimentación en la parte delantera del instrumento.</li>
	<li>En la pantalla de inicio del instrumento PBMC automatizado, seleccione perfil y seleccione el protocolo deseado. NOTA: El perfil de protocolo seleccionado para este aislamiento de PBMC humano EasySep Direct 19654 - buffy coat fue el perfil de protocolo seleccionado para este aislamiento de PBMC. Consulte el procedimiento estándar del fabricante para este perfil en el informe de protocolo14.</li>
	<li>Introduzca el volumen inicial (la cantidad de capa leucitaria aspirada en el tubo A) y repita el procedimiento para cada muestra.</li>
	<li>Seleccione todos los cuadrantes que utilizarán el mismo kit de reactivos. NOTA: Si se utiliza el mismo protocolo para más de un cuadrante, el instrumento PBMC automatizado sugerirá utilizar el mismo kit de reactivos para todos los cuadrantes14.</li>
	<li>Cargue el carrusel del instrumento con los consumibles etiquetados, las puntas de filtro y el contenedor de tampón. El kit de reactivos que contiene el tubo magnético de perlas y el tubo de mezcla de cóctel se cargará en el cuadrante 1. NOTA: El instrumento preguntará si el usuario desea utilizar 1 kit de reactivos para todos los cuadrantes. Seleccione "sí" y resalte todos los cuadrantes utilizando el kit de reactivos.</li>
	<li>Una vez completada la carga, retire las tapas de los consumibles y reactivos y seleccione ejecutar en la pantalla del instrumento.</li>
	<li>Cuando se complete la ejecución, seleccione descargar y retire las muestras (que contienen suspensión PBMC etiquetada en el tubo C) del carrusel del instrumento. Guarde el tubo magnético de perlas, el tubo de mezcla de cóctel y el recipiente tampón a 4 °C. Deseche los tubos etiquetados como A, B y los desechos (consulte el paso 4.1) y las puntas de los filtros. NOTA: No es necesario recargar con PBS para el método automatizado, ya que la suspensión de PBMC produce un volumen final de 7 mL.</li>
	<li>Transfiera 500 μL de las células a un recipiente de muestra para obtener un recuento de células sin dilución. Continúe con la sección 5 para el recuento de células.</li>
</ol>5. Recuento de células
<ol><li>Realice el recuento celular y la viabilidad utilizando el método de exclusión del colorante azul de tripanosiguiendo las instrucciones del fabricante. NOTA: Para los procesos internos del autor, el análisis de celdas se realiza utilizando un contador de celdas automatizado con las siguientes configuraciones para adquirir los PBMC. Factor de dilución = 10 (para protocolo manual, si la suspensión celular es de bajo volumen) o 1 (para protocolo automatizado) Tipo de célula: PBMC Rango de concentración = 5 x 104 a 1 x 107 células/mL Rango de tamaño (diámetro) = 8 μm a 50 μm Número de imágenes = 50</li>
</ol>6. Preparación de la criopreservación
<ol><li>Centrifugar (utilizando un rotor de cangilón oscilante) los tubos de muestra a 300 x g durante 8 min a 22 °C con el freno puesto (9 aceleración/9 deceleración).</li>
	<li>Después de la centrifugación, vuelva a colocar las muestras en el gabinete de seguridad biológica.</li>
	<li>Con una pipeta, retire con cuidado el sobrenadante. Se puede dejar una pequeña cantidad de sobrenadante con el pellet de PBMC para asegurarse de que no se altere.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 3 mL de medio de criopreservación frío. Mezcle lenta y suavemente la suspensión hacia arriba y hacia abajo hasta que quede homogénea. NOTA: El volumen del medio de ciropreservación se puede ajustar en función de la concentración final deseada de PBMC.</li>
	<li>Dispense 1 ml de PBMC resuspendido en un tubo criogénico preasignado y colóquelo dentro de un recipiente de congelación de velocidad controlada durante un mínimo de 4 h a -80 °C. NOTA: El volumen de PBMC acanaladas a cada criotubo se puede ajustar según las preferencias del investigador.</li>
	<li>Después de almacenar los tubos criogénicos a -80 °C durante un mínimo de 4 h, transfiera los tubos criogénicos a un tanque de fase de vapor de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>7. Análisis estadístico de datos
<ol><li>Los datos representativos de los resultados se analizaron utilizando un software estadístico y gráfico como se especifica en el Archivo Complementario 3.</li>
</ol>

Aislamiento de PBMC de alto rendimiento mediante perlas inmunomagnéticas

<ol><li>Alexovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+A+review+of+recent+proteomic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications.</a> Proteomics. 22 (15-16), e2200026(2022).</li>
<li>Zhang, M., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multi-differentiation+potential+of+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48(2012).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).</li>
<li>Kleeberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+recovery+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+cryopreserved+for+up+to+12+years+in+a+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).</li>
<li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+%28PBMC%29+by+density+gradient+centrifugation+on+percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li>
<li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).</li>
<li>Gautam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+gene+expression+profiles+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+multiple+collection+and+processing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods.</a> PLoS One. 14 (12), e0225137(2019).</li>
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<li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+biobanking+using+a+robotized+liquid+handling+workstation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation.</a> J Transl Med. 17 (1), 371(2019).</li>
<li> Stemcell Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vol.+27156%5BTitle%5D)+AND+%22STEMCELL+TECHNOLOGIES%22%5BJournal%5D)">Vol. 27156.</a> STEMCELL TECHNOLOGIES. , 1-4 (2020).</li>
<li>Hornschuh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+magnetic+sorting+preserves+the+functionality+of+ex+vivo+cultivated+non-adherent+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes.</a> Biology (Basel). 11 (11), 1583(2022).</li>
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<li>Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+processing+for+pathogen+inactivation+of+double-dose+buffy-coat+platelet+concentrates%3A+Maintained+in+vitro+quality+over+7-day+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage.</a> Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).</li>
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<li>Fuchs, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+biobanking%3A+Employing+a+robotic+system+for+automated+mononuclear+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation.</a> Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).</li>
<li>Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology%2C+white+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls+Publishing%22%5BJournal%5D)">Histology, white blood cell.</a> StatPearls Publishing. , (2024).</li>
<li>Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+buffy+coat+extract+on%3A+Methodology%2C+feasibility%2C+optimization%2C+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study.</a> Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).</li>
<li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield%2C+but+severly+compromise+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li>
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</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Las PBMC humanas son tipos de células versátiles que se utilizan para numerosos ensayos; Sin embargo, el rendimiento del aislamiento es a menudo una limitación en muchos laboratorios, incluidos los biobancos16. Anteriormente, el Biobanco Estatal de Salud de Nueva Gales del Sur aisló los PBMC utilizando el método de gradiente de densidad. Se investigó la automatización del método de separación en gradiente de densidad para aumentar la capacidad de procesamiento, pero se identificaron barreras para la implementación, incluyendo (i) el costo de un manipulador de líquidos con una unidad de centrifugación completamente automatizada, con el requisito adicional de una unidad HEPA para producir un producto estéril, (ii) personal capacitado para la programación y (iii) el tiempo requerido para las pruebas de protocolo. Por lo tanto, este estudio exploró métodos alternativos e identificó el kit de PBMC humano obtenido comercialmente que podría usarse para el procesamiento manual y automatizado. La esterilidad está garantizada ya que el equipo necesario para el procesamiento cabe dentro de una cabina de seguridad biológica estándar (longitud de 1,2 m). En este documento se detallan las modificaciones realizadas en el protocolo14 recomendado por el fabricante, para aumentar la eficiencia y reducir los costes de los reactivos sin sacrificar la calidad. Además, el protocolo del fabricante se amplió para detallar los pasos de las muestras del biobanco para futuras investigaciones, incluida la sangre completa (paso 1.2), el plasma (paso 2.2) y los glóbulos rojos (paso 2.5) alícuotas del tubo sanguíneo original, así como el recuento de células y la criopreservación.
En este estudio, se compararon tres protocolos de aislamiento de PBMC: separación en gradiente de densidad, aislamiento manual y automatizado basado en perlas. Se realizaron modificaciones al protocolo manual basado en perlas del fabricante, incluida la eliminación de la dilución de la capa leucocitaria antes del aislamiento de PBMC y la eliminación del requisito de rotura para las centrifugaciones, lo que permitió a los investigadores seguir un protocolo de aislamiento de PBMC adaptable, rentable y de alto rendimiento. En primer lugar, se utilizaron ocho muestras de sangre entera emparejadas para aislar las PBMC con el fin de comparar la separación en gradiente de densidad y la técnica manual basada en perlas. Es importante destacar que las distribuciones de la población celular, la viabilidad celular y la recuperación de PBMC no fueron significativamente diferentes entre los dos métodos comparados, como se muestra en la Figura 2A-F, la Figura 3A y la Figura 1 suplementaria, respectivamente. En los datos representativos, los recuentos celulares fueron mayores para el método de separación en gradiente de densidad utilizando el método de exclusión de azul de tripano, pero no cuando se utilizó un analizador de células hematológicas. La configuración del tipo de célula PBMC en el contador de células empleó un rango de diámetro de célula de 8-50 μm y, por lo tanto, los recuentos incluirán PBMC así como granulocitos (aproximadamente 12-15 μm de diámetro) cuando se utilice el método de exclusión de azul de tripano17. Si bien el contador de células hematológicas ofreció una mayor especificidad que el método de exclusión de azul de tripano, algunos cálculos de recuperación fueron superiores al 100%, lo que refleja el margen de error del instrumento (ver Figura complementaria 1). Por lo tanto, se recomienda que los investigadores apliquen una combinación de técnicas de recuento celular al comparar los rendimientos de los protocolos de aislamiento de PBMC, ya que la mayoría de las técnicas no ofrecen recuentos celulares diferenciales específicos y altamente sensibles. Además, no se realizaron ensayos para comparar la actividad funcional de las PBMC obtenidas por ninguna de las técnicas, lo cual es una limitación de nuestro análisis.
A continuación, se compararon los métodos manuales y automatizados basados en perlas, y no se identificaron diferencias significativas entre el rendimiento o la viabilidad de PBMC a partir de 8 muestras emparejadas (Figura 4A,B). Las poblaciones celulares no se compararon individualmente, ya que se utilizó el mismo cóctel de aislamiento de anticuerpos para ambos métodos. Es importante destacar que el tiempo de intervención para procesar 8 muestras se redujo de 43 min a 22 min utilizando el protocolo automatizado (Figura 4C). Si bien el rendimiento, la prevención del agotamiento de los técnicos y la consistencia del procesamiento de muestras se garantizan mediante la automatización, el costo de los reactivos y consumibles es significativamente más alto, 3-4 veces más que el método manual basado en cordones. Esto es después de hacer modificaciones al protocolo del fabricante para usar 1 mL de capa leucocitaria (de un volumen de sangre total de 10 mL) en lugar del rango recomendado de 2-5 mL (de un volumen de sangre total de 10 mL y/o más). Si el presupuesto es una limitación, optar por el método manual puede reducir el tiempo de procesamiento en ~25% mientras se mantienen los costos de reactivos y consumibles comparables a los del método de separación por densidad. Se recomienda procesar no más de 8 muestras a la vez por técnico para garantizar un escalonamiento adecuado de las muestras (~30 s/muestra) dentro de los períodos de incubación de 5 minutos (pasos 3.7, 3.11 y 3.14).
Tanto en los métodos manuales como en los automatizados basados en perlas, la eliminación de la capa leucocitaria es un paso crítico para garantizar un aislamiento óptimo de PBMC. Es importante tener en cuenta que en este protocolo se utiliza una capa leucocitaria en lugar de sangre entera, ya que el volumen de los reactivos se basa en los volúmenes10 del material de partida. Eliminar de manera efectiva todo el volumen del pelaje leucocitario puede ser un desafío técnico. Inicialmente, este método detallaba la eliminación de 0,5 mL de capa leucocitaria, sin embargo, se aumentó a 1 mL para mejorar la recuperación. Para garantizar una recuperación adecuada y consistente del pelaje leucocitario, es importante detallar este proceso en la documentación del protocolo y la capacitación. Se recomienda agitar la punta de una pipeta mientras se aspira la capa leusulista, teniendo cuidado de no aspirar demasiados glóbulos rojos de la capa inferior (paso 2.3). Es importante no saturar el cóctel de anticuerpos que se une a las células no deseadas (es decir, granulocitos y glóbulos rojos), lo que puede afectar el rendimiento y la pureza10. Para minimizar los glóbulos rojos recolectados durante la extracción del pelaje leucocitario, la punta de la pipeta debe estar entre la capa de plasma y la capa del pelaje leucovita. El volumen del pelaje leucocitario se puede aumentar a partir de 1 mL; sin embargo, se debe tener cuidado como se describió anteriormente para asegurarse de que no más del 10% del volumen recolectado contenga glóbulos rojos. Alternativamente, se puede usar un manipulador de líquidos automatizado para recolectar pelajes leucocitarios de manera constante18. Sin embargo, las horas dedicadas necesarias para calibrar y solucionar problemas de los protocolos de los instrumentos de manipulación de líquidos, especialmente teniendo en cuenta el gasto, pueden no ser factibles para la mayoría de los laboratorios.
La transición y la aplicación del protocolo automatizado basado en perlas fue esencial dado el objetivo del NSW Health Statewide Biobank de procesar 23,000 PBMC durante los próximos 3 años. Aquí, se demostró que las PBMC se pueden aislar de los tubos de ACD hasta 9 días después de la recolección con una viabilidad media >70%. Si bien los rendimientos fueron óptimos 24 horas después de la recolección, el procesamiento dentro de este período de tiempo no siempre es factible, ya que es posible que sea necesario transportar las muestras. Se demostró que las PBMC aisladas con el método manual o automatizado basado en perlas pueden tener rendimientos de >3 x 105 células/ml de sangre total cuando se aíslan dentro de los 4 días posteriores a la recolección y >1 x 105 células/mL de sangre total cuando se aíslan dentro de los 10 días posteriores a la recolección. Los números bajos de muestras de más de 5 días se señalan como una limitación de este análisis. Además, los datos no se separaron en función de las edades, el sexo y el historial clínico de los participantes, ya que esta información no estaba disponible. Aunque se necesita un análisis comparativo para examinar los efectos de los retrasos en los tiempos de procesamiento de ambos métodos, se ha informado previamente que los retrasos en el aislamiento de PBMC utilizando el método de gradiente de densidad disminuyen la calidad celular y aumentan significativamente la contaminación por glóbulos rojos19,20. Además, las proporciones de granulocitos aumentan si se retrasa el procesamiento y, por lo tanto, los especímenes de "edades" similares deben agruparse para los análisis posteriores 20,21,22. Cabe destacar que este experimento se realizó utilizando sangre anticoagulada con dextrosa cítrica ácida (es decir, citrato trisódico, ácido cítrico y dextrosa); sin embargo, el rendimiento y/o la proporción de los tipos celulares pueden variar si se utilizan otros anticoagulantes23; por lo tanto, se aconseja a los investigadores que elijan un anticoagulante adecuado en función de los análisis de PBMC previstos.
En resumen, se detalla un protocolo para el aislamiento de PBMC mediante perlas magnéticas que es adaptable a flujos de trabajo de alto rendimiento para cumplir con los requisitos de escalado sin comprometer la viabilidad de la celda. Tanto los métodos manuales como los automatizados se pueden optimizar para producir concentraciones celulares específicas cambiando los volúmenes de arranque y resuspensión. El Biobanco Estatal de Salud de Nueva Gales del Sur ha pasado de extraer ~ 60 PBMC por mes utilizando la técnica tradicional de separación en gradiente de densidad a ~ 300 PBMC por mes utilizando este método basado en cuentas compatible con la automatización. El próximo objetivo de los autores es utilizar la plataforma automatizada para procesar hasta 1200 PBMC por mes y comparar aún más las PBMC aisladas mediante técnicas basadas en perlas magnéticas (manuales y automatizadas) y de gradiente de densidad para guiar la implementación de esta técnica a otros laboratorios, con un enfoque particular en los biobancos.

El aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) es una técnica que separa y aísla linfocitos y monocitos de otros componentes de la sangre completa. Las PBMC son un tipo de célula versátil que se utiliza para numerosas aplicaciones, entre las que se incluyen, entre otras, la inmunoterapia, el desarrollo de vacunas, la identificación de dianas o biomarcadores y el desarrollo de fármacos de anticuerpos/moléculas pequeñas 1,2. Estas células pueden aislarse de individuos sanos o enfermos y pueden utilizarse inmediatamente en procesos posteriores o criopreservarse para futuras investigaciones3. En algunos casos, se conoce el propósito posterior, mientras que en otros, como es común en los biobancos, los PBMC se aíslan y se almacenan para futuras aplicaciones no especificadas4.
La centrifugación en gradiente de densidad es la técnica tradicional para aislar las PBMC 5,6,7 de la sangre total, utilizando la separación diferencial de los tipos de células constituyentes en función de la densidad celular durante la centrifugación. Si bien puede haber alguna variación en este método, la sangre completa generalmente se diluye con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se coloca en capas sobre un medio de gradiente de densidad en un tubo de centrífuga especializado o estándar y luego se centrifuga. El resultado son cuatro capas distintas: la capa superior de plasma está enriquecida con plaquetas, una fina capa de PBMC está por encima del medio de gradiente de densidad y, por último, la capa inferior está formada por glóbulos rojos (RBC) y granulocitos. Aunque este método se ha denominado anteriormente "el estándar de oro"8, existen limitaciones para el escalado, como el largo tiempo de procesamiento, la capacidad de centrifugación, la dificultad para alícuotas de otros productos sanguíneos (es decir, plasma y glóbulos rojos) y su laboriosidad de automatización. Si bien la automatización es posible para este método9, requiere una programación completa de un manipulador de líquidos (con un módulo de centrifugación para automatizarlo por completo) y seguiría siendo un proceso largo.
A partir de ahora, se presenta un flujo de trabajo alternativo que utiliza la separación inmunomagnética de perlas con un imán de ocho soportes para el procesamiento manual o un instrumento para el procesamiento totalmente automatizado. Este método utiliza un cóctel de anticuerpos que se agrega a las células y se une a las poblaciones celulares no deseadas, en este caso, plaquetas, granulocitos y glóbulos rojos. Estas poblaciones no deseadas se eliminan posteriormente por separación magnética, dejando las poblaciones de monocitos y linfocitos en la fracción negativa que están listas para el procesamiento posterior10. Este método de selección negativa es más rápido que los métodos de selección positiva, que requieren pasos adicionales para eliminar el complejo de anticuerpos y perlas magnéticas de las PBMC. La selección negativa es además ventajosa, ya que se ha descrito como una forma de preservar la funcionalidad celular11,12.

<table><tbody><tr><td>Medios de criopreservación celular CS10, 100 mL (CRYOSTOR)</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>07930</td><td></td></tr><tr><td>Clase II Cabina de seguridad biológica</td><td>Thermo ScientififcTM</sup</td><td>>51033311</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell 1 mL FX</td><td>BioTools</td><td>BCS-407P</td><td>Este es el contenedor de congelación de tasa de control utilizado.</td></tr><tr><td>Agua destilada&nbsp;</td><td>Bacto Laboratories</td><td>561832</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de hematología DxH 500&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B40601</td><td>Conocido como contador de células automatizado externo.</td></tr><tr><td>EasyEightsTM EasySepTM</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>18103</td><td></td></tr><tr><td>EasySepTM Kit de aislamiento directo de PBMC</td><td>humano StemCellTM Technologies</td><td>19654</td><td>El kit incluye el tubo de perlas magnéticas y el tubo de mezcla de cóctel</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td><td>E6758-500G</td><td>Las instrucciones para hacer una solución de EDTA 0.1M a partir de sal de EDTA se encuentran en el archivo complementario 2.</td></tr><tr><td>LymphoprepTM Medio de gradiente de densidad</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge ST4 Plus Centrífuga</td><td>Thermo ScientififcTM</td><td>THR75009903</td><td></td></tr><tr><td>Orion Star A211 Electrodo de medidor de pH</td><td>Thermo ScientififcTM</td><td>STARA2110</td><td></td></tr><tr><td>Orión&comercio; ROSS Ultra&comercio; Triodo de vidrio&comercio; Electrodos combinados de pH/ATC</td><td>Thermo ScientififcTM</td><td>8302BNURCA</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución, 1X, 500ml</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Prisma</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoboSepTM Buffer 1X</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>20104</td><td>Software utilizado para análisis estadístico.</td></tr><tr><td>RoboSepTM-S</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>21000</td><td>Instrumento separador de células totalmente automatizado.</td></tr><tr><td>RoboSep&comercio; Puntas de filtro</td><td>StemCellTM Technologies</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>SepMateTM-50 (IVD)</td><td>tubos StemCellTM Technologies</td><td>85460</td><td>IVD - Diagnóstico in vitro. También conocido como tubos SepMateTM-50</td></tr>, <tr><td>Vi-CELL XR Cell, Anlayzer</td><td>, Beckman Coulter, Life Sciences</td>, Contador de <td></td><td>células automatizado interno. Instrumento obsoleto y ya no disponible para su compra (a 31 de diciembre de 2022). El instrumento alternativo es el analizador de viabilidad celular ViCell BLU (n.º de producto C19196).</td></tr><tr><td>Kit de reactivos Vi-CELL XR Quad Pack Beckman</td><td>Coulter Life Sciences</td><td>383722</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana de buffy coats a través de la separación inmunomagnética de perlas de alto rendimiento

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) son una población heterogénea de monocitos y linfocitos. Las PBMC criopreservadas tienen una viabilidad estable en el almacenamiento a largo plazo, lo que las convierte en un tipo de célula ideal para muchos fines de investigación posteriores, como la citometría de flujo, los inmunoensayos y la secuenciación del genoma. Por lo general, los PBMC se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad, sin embargo, es un flujo de trabajo de bajo rendimiento que es difícil y costoso de escalar. En este artículo se presenta un flujo de trabajo de alto rendimiento que utiliza un método de aislamiento PBMC basado en perlas magnéticas que es rápido de implementar. Se comparó la concentración celular total, la viabilidad y la distribución poblacional con PBMC obtenidos mediante aislamiento en gradiente de densidad, y la viabilidad celular y la proporción de tipos celulares fueron comparables para ambas técnicas. Las PBMC aisladas demostraron más del 70% de viabilidad hasta 9 días después de la recolección de sangre, aunque el rendimiento disminuyó a la mitad después de 5 días en comparación con las PBMC procesadas dentro de las 24 horas posteriores a la recolección. En resumen, este artículo describe un protocolo PBMC que utiliza un enfoque basado en perlas para adaptarse a un flujo de trabajo de alto rendimiento y demuestra que los métodos manuales y automatizados basados en perlas pueden aumentar la capacidad de procesamiento y proporcionar flexibilidad para varios presupuestos.

Las proporciones de linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos antes (es decir, en sangre total) y después del aislamiento de PBMC se midieron cuando se aislaron PBMC utilizando el método de separación basado en perlas o en gradiente de densidad. Las proporciones de linfocitos y monocitos se enriquecieron significativamente con ambos métodos (Figura 2A,B). Además, las proporciones de neutrófilos, eosinófilos y basófilos (es decir, granulocitos) disminuyeron significativamente en las PBMC aisladas por el método basado en perlas (Figura 2C-F). No hubo diferencias significativas en las proporciones de linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y granulocitos entre los métodos de gradiente de densidad y los métodos basados en perlas (Figura 2). Además, se calculó el porcentaje de recuperación para los tipos de células enumerados anteriormente (véase la figura complementaria 1). La viabilidad celular media fue superior al 95% para ambos métodos, y no fueron significativamente diferentes (Figura 3A). Las PBMC también se contaron utilizando un rango de tamaño (diámetro) de 8 μm a 50 μm, donde el método de separación en gradiente de densidad produjo recuentos totales de células aproximadamente dos veces mayores (Figura 3B). 
A continuación, se comparó el método automatizado basado en cordones con el método manual. No se identificaron diferencias significativas para la viabilidad celular (Figura 4A) o el recuento total de células (Figura 4B) utilizando el método manual o automatizado. Se comparó el tiempo de procesamiento de estas 8 muestras, incluido el tiempo de no intervención que no requirió intervención humana. El tiempo total de procesamiento de 8 muestras fue de 43 min vs. 57 min para el manual vs. el método automatizado. El método automatizado incluyó 35 minutos de procesamiento sin intervención (Figura 4C).
El flujo de trabajo basado en perlas de aislamiento de PBMC (con alícuotas de sangre total y plasma) se puso a prueba durante 9 meses, en el que se aislaron 1410 muestras de PBMC de sangre humana no analizada utilizando la plataforma manual para los primeros 820 participantes y luego utilizando el método automatizado para los siguientes 590 participantes. El procesamiento se realizó el mismo día o hasta 10 días después de la recolección según los criterios de aceptación del estudio, con retrasos en el procesamiento debidos en gran medida a los tiempos de tránsito de las muestras. Con el método manual o automatizado, los PBMC procesados dentro de las 24 horas posteriores a la recolección tuvieron la mayor viabilidad y recuperación (Figura 5). La viabilidad celular media fue del &gt;90% para las PBMC procesadas en 5 días y del &gt;70% para las PBMC procesadas en 10 días (Figura 5A). Los rendimientos medios de PBMC disminuyeron en un 50% después de 5 días en comparación con los especímenes procesados dentro de las 24 h (Figura 5B).
<img alt="Proceso de aislamiento y criopreservación de células sanguíneas; centrífuga, tabla de perlas magnéticas; almacenamiento celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Flujo de trabajo esquemático del protocolo de aislamiento PBMC basado en perlas de buffy coat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Comparación de aislamiento de células sanguíneas; gráficos de linfocitos, monocitos, neutrófilos; gradiente de densidad, basado en perlas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Proporciones de linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y granulocitos en el aislamiento de sangre total antes y después de PBMC mediante gradiente de densidad y métodos basados en perlas. Porcentaje de linfocitos (A), monocitos (B), neutrófilos (C), eosinófilos (D), basófilos (E) y granulocitos (F) en sangre total emparejada antes del aislamiento de PBMC (cuadrados) y en PBMC después del aislamiento mediante el método de gradiente de densidad (círculos abiertos) o basado en perlas (círculos cerrados) (n = 8). ns = no significativo, y *p &lt; 0,05 según lo determinado por el ANOVA de un factor (A y B) o la prueba de Friedman (C- F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráfico de viabilidad celular y recuento; gradiente de densidad vs. basado en perlas; Análisis estadístico de métodos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Viabilidad y recuento total de células de PBMC aisladas por gradiente de densidad y métodos basados en perlas. (A) Viabilidad celular media (± DE) para muestras procesadas utilizando gradiente de densidad (cuadrados, barra oscura) vs. Métodos basados en cuentas (círculos, barra libre) para 8 muestras emparejadas. ns = no significativo por la prueba t pareada. (B) Recuento total de células para muestras procesadas usando gradiente de densidad (cuadrados, barra oscura) vs. Métodos basados en cuentas (círculos, barra libre) para 8 muestras emparejadas. *p &lt; 0,05 determinado mediante una prueba t pareada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráficos de viabilidad celular y recuento total de células; método azul de tripano; procesamiento manual vs. automatizado." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Comparación de métodos manuales y automatizados basados en perlas. (A) Viabilidad celular media (± DE) para muestras procesadas manualmente (cuadrados, barra oscura) vs. Métodos automatizados (círculos, barra libre) basados en cuentas para 8 muestras pareadas. ns = no significativo por la prueba de Mann-Whitney. (B) Recuento total de células para muestras procesadas usando manual (cuadrados) vs. Métodos automatizados (círculos) basados en cuentas para 8 muestras pareadas. ns = no significativo por la prueba t pareada. (C) Tiempo de procesamiento para 8 muestras procesadas usando manual vs. Métodos automatizados, incluidos los períodos de tiempo de manos (barra de luz) y de no intervención (barra oscura). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráficos de viabilidad celular y rendimiento; procesamiento manual vs automatizado; Tablas de análisis estadístico incluidas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Viabilidad y rendimiento de PBMC aislado del método basado en perlas, ya sea manualmente o mediante automatización según el tiempo entre la recolección de muestras y el almacenamiento de PBMC. (A) Viabilidad celular media (± IC del 95%) para las muestras de los participantes procesadas con manual (barra oscura) vs. Métodos automatizados (barra libre) basados en cuentas. Tabla con el detalle de los números de participantes. ns = no significativo. na = no aplicable. *p &lt; 0,05 por la prueba de comparación múltiple de Tukey. (B) Recuento total de células para muestras de participantes procesadas usando manual (barra oscura) vs. Métodos automatizados (barra libre) basados en cuentas. Tabla con el detalle de los números de participantes. ns = no significativo. na = no aplicable. *p &lt; 0,05 por la prueba de comparación múltiple de Tukey. No hay ningún valor para el día 10 automatizado debido a que el número de réplicas es inferior a 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Figura de recuperación del porcentaje diferencial de células con los métodos basados en gradientes de densidad y perlas. El porcentaje se calculó utilizando recuentos absolutos de células pre-aislamiento en sangre total y post-aislamiento de células en suspensión utilizando el método de gradiente de densidad (cuadrados, barra oscura) y el método basado en cuentas (círculos, barra abierta) (n = 8). ns = no significativo, y *p &lt; 0,05 determinado por la prueba t no apareada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 1: Protocolo de gradiente de densidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%201_editedv2.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Ficha complementaria 2: Preparación de EDTA 0,1 M, pH 8,0 en PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%202_editedv2.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Fichero complementario 3: Procedimiento detallado realizado para generar los datos representativos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%203_editedv2.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo detalla un método compatible con la automatización de alto rendimiento para aislar células mononucleares de sangre periférica humana para biobancos y otros fines.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana de Buffy Coats a través de la separación inmunomagnética de perlas de alto rendimiento

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are a heterogeneous population of monocytes and lymphocytes. Cryopreserved PBMCs have stable viability in ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El video explica una forma de purificar las células B mediante la orientación inmunomagnética y la separación de la suspensión de células mononucleares de sangre periférica. El método consiste en etiquetar tipos de células no deseadas con anticuerpos o ligandos específicos (unidos a partículas magnéticas) dirigidos a proteínas específicas de la superficie celular, para ser agotadas de la suspensión celular heterogénea por separación magnética.

Selección inmunomagnética negativa: un método para purificar células B a partir de células mononucleares de sangre periférica

En este video, demostramos el aislamiento de monocitos de sangre humana completa mediante separación inmunomagnética negativa. Los monocitos aislados se pueden utilizar para análisis posteriores.

Aislamiento de monocitos de sangre total por selección inmunomagnética negativa

En este video, demostramos el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica, PBMCs, que contienen monocitos y linfocitos de una capa de leucocitología humana mediante centrifugación en gradiente de densidad. Los PBMC aislados se pueden utilizar para un análisis posterior.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica de pelajes leucocitarios humanos

En este video, demostramos el aislamiento de células B de sangre periférica humana utilizando anticuerpos biotinilados específicos para células no B y microperlas magnéticas conjugadas con estreptavidina.

Aislamiento y purificación de células B de sangre periférica humana

Este video muestra una técnica para generar ratones del sistema inmunológico humano (HIS). Las células madre hematopoyéticas (HSC) CD34+ se aíslan de las células de la capa leucitaria de la sangre del cordón umbilical humano mediante perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos. Las HSC CD34+ se expanden en un medio de crecimiento enriquecido con citocinas y criopreservado. Finalmente, las HSC descongeladas se inyectan en una cría de ratón inmunodeficiente para establecer el modelo de ratón HIS.

Aislamiento de células madre hematopoyéticas de la sangre del cordón umbilical para generar ratones del sistema inmunitario humano

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Aquí, demostramos cómo se aíslan los monocitos mediante la separación magnética de perlas de las células mononucleares de sangre periférica después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre humana anticoagulada. Después de la incubación durante 5 días, los monocitos humanos se diferencian en células dendríticas inmaduras y están listos para procedimientos experimentales en un entorno no clínico.

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Presentamos un protocolo sencillo para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica a partir de sangre total obtenida de pacientes diagnosticados con Síndrome de Sézary, seguido de selección de linfocitos T CD4+, su estimulación con forbol12-miristato13-acetato e ionóforo A23187, y preparación de ARN para el perfil transcriptómico.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana y células T CD4 + de pacientes con síndrome de Sézary para perfiles transcriptómicos

Este protocolo detalla un método para el aislamiento de neutrófilos de sangre total, capas buffy o membranas de leucoféresis, logrando un buen rendimiento, alta pureza y mínima activación celular. Utilizamos la purificación por gradiente, la sedimentación de glóbulos rojos (RBC) y la lisis de RBC para obtener una preparación de neutrófilos de alta calidad / pureza.

Aislamiento de neutrófilos humanos de sangre entera y buffy coats

Describimos un método que combina perlas inmunomagnéticas y clasificación celular activada por fluorescencia para aislar y analizar subpoblaciones de células inmunes definidas de células mononucleares de sangre periférica (monocitos, células T CD4 +, células T CD8 +, células B y células asesinas naturales). Usando este método, las células magnéticas y marcadas con fluorescencia pueden ser purificadas y analizadas.

Separación de subpoblaciones de células inmunitarias en muestras de sangre periférica de niños con mononucleosis infecciosa

Este protocolo presenta una guía accesible para recolectar, almacenar y descongelar células mononucleares de sangre periférica adecuada para análisis posteriores y flujos de trabajo como la citometría de flujo y la secuenciación de ARN. También se muestran las colecciones de pelajes de plasma y buffy.

Aislamiento y criopreservación de células mononucleares de sangre periférica humana altamente viables a partir de sangre total: una guía para principiantes

Aprenda a aislar células mononucleares de sangre periférica humana mediante separación inmunomagnética automatizada de alto rendimiento. Este método mejora la eficiencia del biobanco manteniendo viabilidad celular superior al 90%.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana de Buffy Coats a través de la separación inmunomagnética de perlas de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana de Buffy Coats a través de la separación inmunomagnética de perlas de alto rendimiento

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