Name: Imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado del hipocampo en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprende a realizar imágenes de calcio in vivo en células granulosas del giro dentado del hipocampo en ratones libremente móviles. Este protocolo integra la inyección de virus y el implante de lente GRIN en un solo procedimiento quirúrgico para mejorar la calidad de los datos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo cuenta con el apoyo del Programa Piloto de Investigación Básica de Shanghái - Universidad de Fudan 21TQ1400100 (22TQ019), el Proyecto Mayor de Ciencia y Tecnología Municipal de Shanghái, el Laboratorio Lingang (subvención no. LG-QS-202203-09) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32371036).

Imágenes en tiempo real de la actividad neuronal en células de giro dentado de ratones 

<ol><li>Scoville, W. B., Milner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+recent+memory+after+bilateral+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).</li>
<li>Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O'keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+hippocampal+pathology+impairs+topographical+and+episodic+memory+but+not+visual+pattern+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Bilateral hippocampal pathology impairs topographical and episodic memory but not visual pattern matching.</a> Hippocampus. 11 (6), 715-725 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neurophysiological+approaches+in+the+study+of+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular neurophysiological approaches in the study of learning.</a> Physiol Rev. 48 (1), 65-134 (1968).</li>
<li>Zemla, R., Basu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal function in rodents.</a> Curr Opin Neurobiol. 43, 187-197 (2017).</li>
<li>Basu, J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corticohippocampal+circuit%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a021733(2015).</li>
<li>Gobbo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+signature+of+spatial+decision-making+during+navigation+by+freely+moving+rats+by+using+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal signature of spatial decision-making during navigation by freely moving rats by using calcium imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2212152119(2022).</li>
<li>Schuette, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabaergic+ca1+neurons+are+more+stable+following+context+changes+than+glutamatergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gabaergic ca1 neurons are more stable following context changes than glutamatergic cells.</a> Sci Rep. 12 (1), 10310(2022).</li>
<li>Daumas, S., Halley, H., Francés, B., Lassalle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding%2C+consolidation%2C+and+retrieval+of+contextual+memory%3A+Differential+involvement+of+dorsal+ca3+and+ca1+hippocampal+subregions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Encoding, consolidation, and retrieval of contextual memory: Differential involvement of dorsal ca3 and ca1 hippocampal subregions.</a> Learn Mem. 12 (4), 375-382 (2005).</li>
<li>Ognjanovski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Parvalbumin-expressing+interneurons+coordinate+hippocampal+network+dynamics+required+for+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Erratum: Parvalbumin-expressing interneurons coordinate hippocampal network dynamics required for memory consolidation.</a> Nat Commun. 8, 16120(2017).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Yassa, M. A., Stark, C. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the hippocampus.</a> Trends Neurosci. 34 (10), 515-525 (2011).</li>
<li>Ryan, T. J., Roy, D. S., Pignatelli, M., Arons, A., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory.+Engram+cells+retain+memory+under+retrograde+amnesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory. Engram cells retain memory under retrograde amnesia.</a> Science. 348 (6238), 1007-1013 (2015).</li>
<li>Manahan-Vaughan, D., Reymann, K. G., Brown, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+investigations+into+the+role+of+histamine+in+the+dentate+gyrus+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological investigations into the role of histamine in the dentate gyrus of the rat.</a> Neuroscience. 84 (3), 783-790 (1998).</li>
<li>Kim, S., Jung, D., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cell+maps+slowly+develop+via+competitive+learning+and+conjunctive+coding+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Place cell maps slowly develop via competitive learning and conjunctive coding in the dentate gyrus.</a> Nat Commun. 11 (1), 4550(2020).</li>
<li>Danielson, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+dentate+gyrus+mossy+cells+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of dentate gyrus mossy cells in behaving mice.</a> Neuron. 93 (3), 552-559.e4 (2017).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+gcamp6m%27s+ca2%2B-dependent+change+in+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular mechanism responsible for gcamp6m's ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0170934(2017).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normcorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Normcorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInan%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2021).</li>
<li>Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+viral+injection+and+gradient-index+lens+implantation+for+deep+brain+in+vivo+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging.</a> J Vis Exp. (176), (2021).</li>
<li>Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-day+calcium+imaging+of+ca1+hippocampus+in+freely+moving+rats+reveals+a+high+preponderance+of+place+cells+with+consistent+place+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-day calcium imaging of ca1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields.</a> J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).</li>
<li>Masala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+hippocampal+Ca2%2B+micro-waves+following+synapsin-dependent+adeno-associated+viral+expression+of+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Aberrant hippocampal Ca2+ micro-waves following synapsin-dependent adeno-associated viral expression of Ca2+ indicators.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> J Neurosci Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+baseplating+and+a+miniscope+preanchored+with+an+objective+lens+for+calcium+transient+research+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62611(2021).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniscope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniscope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> J Neurosci Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Cholvin, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+spatial+representation+by+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific spatial representation by hippocampal granule cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 6227(2022).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Aquí describimos un procedimiento para la obtención de imágenes de calcio in vivo en la DG de ratones. Creemos que este protocolo será útil para los investigadores que buscan estudiar las funciones de la DG en diversos procesos cognitivos, particularmente en los casos en que una subpoblación identificada genéticamente es de interés. A continuación explicamos las ventajas de nuestro protocolo, haciendo hincapié en algunos puntos clave en la cirugía, y comentamos las limitaciones de este método.
Hemos probado varios procedimientos para la obtención de imágenes de DG a partir de la literatura disponible y hemos optimizado los procedimientos experimentales como se detalla en este protocolo. En nuestra opinión, las siguientes tres modificaciones clave mejoraron en gran medida la tasa de éxito de nuestro protocolo. Primero, combinamos todos los procedimientos quirúrgicos en una sola sesión, mientras que muchos estudios de imágenes de calcio para regiones subcorticales realizaron la inyección del virus y la implantación de lentes en dos cirugías separadas. Una ventaja clave de nuestro enfoque es que la expresión del virus y la recuperación del tejido cerebral ahora ocurren durante el mismo período, lo que reduce a la mitad el tiempo de espera para la preparación del ratón, que generalmente tomameses 21. Además, las cirugías separadas requieren un reposicionamiento preciso del ratón, ya que ligeras inclinaciones con un desajuste en el rango de 100 μm provocarán el fracaso del procedimiento. Para evitar el extravío de la lente, algunos grupos desarrollaron un enfoque que conecta el miniscopio a la lente e intentaron ver la expresión neuronal del sensor durante la cirugía de implantación. Esta solución requiere una ingeniería no trivial del aparato estereotáxico de uso común y es compleja de usar debido a la supresión de las actividades neuronales durante la anestesia. Nuestro método no requiere reposicionar el mouse, lo que reduce en gran medida el tiempo y el estrés asociados con el procedimiento.
El segundo punto clave de nuestro enfoque es que inyectamos repetidamente pequeñas cantidades del virus en el área objetivo22. Esto hace que se infecten más células. Es importante destacar que, en comparación con el aumento de la carga viral en un solo sitio de inyección, este enfoque arrojó resultados superiores en el sentido de que las ubicaciones de las células infectadas se distribuyen uniformemente por todo el campo de visión. Otro punto clave relacionado es que diluir el título del virus mejora la calidad de las imágenes de calcio. En nuestra experiencia, una cantidad excesiva de virus se asocia con la aparición de grupos de actividades en forma de onda, lo que es consistente con un informe anterior23. Si bien inicialmente sospechamos que la aspiración de tejido puede conducir a la eliminación prematura del virus en el lugar de la inyección y a una expresión insuficiente, no observamos tal fenómeno, y nuestro protocolo generalmente arrojó una infección robusta de la región objetivo. En comparación con los ratones transgénicos que expresan GCaMP, el enfoque del virus es inevitablemente menos consistente, pero ofrece un uso más flexible porque no requiere una reproducción complicada. Sin embargo, dado que la expresión del GCaMP puede extenderse a las estructuras cerebrales adyacentes o distribuirse de manera desigual en la región cerebral objetivo, es fundamental para la interpretación de los resultados un examen cuidadoso de las posiciones anatómicas del virus y el cristalino desde el tejido fijado. La combinación de líneas Cre específicas de la región o del tipo de célula con la expresión de GCaMP dependiente de Cre podría mejorar la especificidad de las señales visualizadas.
El tercer punto clave de nuestro protocolo es que durante la implantación de la lente, repetimos la inserción y el enjuague de la lente varias veces para asegurarnos de que no quedara sangre en la zona de implantación. Esta es una operación clave para facilitar la recuperación del tejido y mejorar la tasa de éxito del procedimiento. Si bien no se conoce el mecanismo exacto, especulamos que la inserción del cristalino inevitablemente causará algún daño al tejido, y el paso de enjuague eliminaría el sangrado asociado con este daño. De lo contrario, el cerebro puede tardar mucho tiempo en eliminar el sangrado asociado a la inserción, lo que aumenta la probabilidad de inflamación local e infiltración de macrófagos, lo que reduciría la calidad óptica. Además, en las coordenadas que proporcionamos en este protocolo, encontramos que colocar el cristalino un poco más cerca de la sutura sagital suele dar lugar a un aumento del número de células visibles, aunque es importante evitar la perforación en el tercer ventrículo. También hemos proporcionado una lista de problemas comunes para una mejor solución de este paso (Tabla 1).
El ratón tiene que ser entrenado para usar el miniscopio ficticio antes de los experimentos de comportamiento para minimizar el impacto del peso adicional en la cabeza. Por lo general, este entrenamiento se lleva a cabo ~ 3 días, y cada sesión dura 20 minutos. Durante los experimentos de comportamiento, la condición física del ratón debe ser monitoreada regularmente. El rendimiento conductual del ratón se verá muy afectado por su salud.
Este protocolo contiene varias limitaciones. En primer lugar, hay que tener en cuenta que las imágenes de calcio son un sustituto de la actividad neuronal, que puede verse influida por la expresión de los sensores. Los métodos de obtención de imágenes de un fotón que utilizan un miniscopio pueden dar lugar a señales superpuestas de las células vecinas, que requieren la desmezcla de los análisis posteriores. Además, nuestro protocolo implica cirugías invasivas. Durante el paso de implantación de la lente GRIN se extrae un trozo de tejido cerebral, que suele incluir parte de la región CA1, la corteza retroesplenial y la corteza visual asociativa. Esto es necesario debido a la limitación de la profundidad de imagen proporcionada por la iluminación de un fotón. En nuestras observaciones, no observamos ningún déficit conductual aparente en los ratones después del procedimiento quirúrgico, ni en sus comportamientos generales y sin restricciones ni en el aprendizaje de las tareas de seguimiento lineal (Figura suplementaria S1). Alternativamente, el uso de instrumentos quirúrgicos automatizados para la succión del tejido cerebral puede reducir los errores asociados con la operación manual, mejorando así la precisión del procedimiento quirúrgico24. Además, nuestros datos de imágenes de calcio en general arrojaron una dinámica de calcio normal. El efecto sobre las funciones cognitivas más complejas necesita una mayor caracterización. Un método alternativo para la inserción del cristalino sin aspiración tisular ha sido descrito antes25. Esto se logra haciendo un corte en el tejido cerebral a lo largo del tracto de inserción previsto y colocando el cristalino directamente a través de la abertura. En nuestra experiencia, este enfoque conduce a un plegamiento u otras deformaciones del tejido cerebral a lo largo del tracto de inserción, que aún pueden ser invasivas. La alta variabilidad de la deformación hace que este enfoque sea menos confiable que el protocolo que describimos. Otra posible advertencia de nuestro protocolo es que el rendimiento del comportamiento del ratón se ve ligeramente afectado por el cable coaxial que conecta el miniscopio y la caja de adquisición de datos (DAQ) del miniscopio. Esto no solo se debe a que los cables se enrollan después de numerosas vueltas, sino también porque el cable puede ser un distractor para el mouse durante la tarea. El uso de un miniscopio inalámbrico26 resolvería efectivamente este problema. 
A pesar de las limitaciones existentes, creemos que esta metodología puede ser muy beneficiosa para los investigadores interesados en utilizar imágenes de calcio in vivo para estudiar los patrones de actividad neuronal dentro del giro dentado del hipocampo. Por ejemplo, este enfoque de imágenes de calcio in vivo se puede aplicar para investigar células de lugar específicamente dentro de la región del giro dentado. Esto permitiría explorar cómo las células de lugar codifican información a través de diferentes áreas cerebrales10,27. Nuestra validación indica que este protocolo es razonablemente reproducible, con altas tasas de éxito, y puede aplicarse a diferentes regiones del cerebro.

Estudios previos encontraron que el hipocampo es una estructura cerebral esencial para procesar y recuperar recuerdos 1,2. Desde la década de 1950, los circuitos neuronales del hipocampo en roedores han sido un foco en el estudio de la formación, almacenamiento yrecuperación de la memoria. Las estructuras anatómicas dentro del hipocampo incluyen las subregiones del giro dentado (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 y subículo4. Existen conexiones bidireccionales complejas entre estas subregiones, de las cuales DG, CA1 y CA3 forman un circuito trisináptico prominente que consta de células granulosas y células piramidales5. Este circuito recibe su entrada primaria de la corteza entorrinal (EC) y ha sido un modelo clásico para estudiar la plasticidad sináptica. Las investigaciones previas in vivo sobre la función del hipocampo se han concentrado principalmente en el CA1 6,7 debido a su fácil acceso. Si bien las neuronas CA1 desempeñan un papel importante en la formación, consolidación y recuperación de la memoria, particularmente en las células de lugar para la memoria espacial, otras subregiones del hipocampo también son vitales 8,9. En particular, estudios recientes han puesto de relieve las funciones de la DG en la formación de la memoria. Se ha informado de que las células de lugar en DG son más estables que las de CA110, y sus actividades reflejan información específica del contexto11. Además, el marcaje dependiente de la actividad de las células granulosas DG puede reactivarse para inducir comportamientos relacionados con la memoria12. Por lo tanto, para obtener una comprensión más profunda de la codificación de la información en DG, es crucial investigar las actividades de la subregión de DG mientras el animal lleva a cabo tareas dependientes de la memoria.
Los estudios previos de las actividades de DG han utilizado principalmente la electrofisiología in vivo 13. Sin embargo, esta técnica tiene algunos inconvenientes: en primer lugar, en las grabaciones eléctricas, puede ser difícil identificar directamente los distintos tipos de células que generan la señal. Las señales registradas provienen tanto de células inhibidoras como excitadoras. Por lo tanto, se requieren más métodos de procesamiento de datos para separar estos dos tipos de células. Además, es difícil combinar otra información de tipo de célula, como los subgrupos específicos de la proyección o el etiquetado dependiente de la actividad, con registros eléctricos. Además, debido a la morfología anatómica de la DG, los electrodos de registro a menudo se implantan en una dirección ortogonal, lo que limita en gran medida el número de neuronas que se pueden registrar. Por lo tanto, es difícil que los registros eléctricos logren monitorear cientos de neuronas individuales de la estructura DG en el mismo animal14.
Una técnica complementaria para registrar las actividades neuronales en DG es el uso de imágenes de calcio in vivo 15. Los iones de calcio son fundamentales para los procesos de señalización celular en los organismos, desempeñando un papel crucial en muchas funciones fisiológicas, especialmente dentro del sistema nervioso de los mamíferos. Cuando las neuronas están activas, la concentración de calcio intracelular aumenta rápidamente, lo que refleja la naturaleza dinámica de la actividad neuronal y la transmisión de señales. Por lo tanto, el registro de los cambios en tiempo real en los niveles de calcio intracelular en las neuronas proporciona información importante sobre los mecanismos de codificación neuronal.
La tecnología de imágenes de calcio utiliza tintes fluorescentes especializados o indicadores de calcio modificados genéticamente (GECI) para monitorear las concentraciones de iones de calcio en las neuronas mediante la detección de cambios en la intensidad de la fluorescencia, que luego se pueden capturar a travésde imágenes microscópicas. Comúnmente, se emplea la familia GCaMP de genes indicadores de calcio, que comprende secuencias de proteína fluorescente verde (GFP), calmodulina y polipéptidos M13. GCaMP puede emitir fluorescencia verde cuando se une a los iones de calcio17, lo que permite registrar las fluctuaciones en la fluorescencia verde a través de imágenes18. Además, para obtener imágenes claras de la región del cerebro objetivo, se suele implantar una lente de índice de gradiente (lente GRIN) sobre la región de interés. La lente GRIN permite obtener imágenes de la región profunda del cerebro a la que no se puede acceder directamente desde la superficie.
Esta técnica es relativamente fácil de combinar con otras herramientas genéticas para etiquetar diferentes tipos de células. Además, como el plano de imagen es paralelo a la orientación de las células en DG, cientos de neuronas son accesibles para la obtención de imágenes con cada cirugía exitosa. En este trabajo presentamos un protocolo quirúrgico completo y detallado para la obtención de imágenes de calcio in vivo en el giro dentado en ratones (Figura 1). El procedimiento implica dos operaciones principales. La primera es inyectar el virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f en el DG. La segunda operación consiste en implantar una lente GRIN sobre el lugar de la inyección del virus. Estos dos procedimientos se llevan a cabo en la misma sesión. Después de la recuperación de estas cirugías, el siguiente paso es verificar la calidad de las imágenes con microscopios miniaturizados (miniscopios). Si el campo de imagen tiene cientos de células activas, el procedimiento posterior es fijar la placa base del miniscopio al cráneo del ratón con cemento dental; A continuación, el ratón se puede utilizar para experimentos de imagen. También presentamos una línea de preprocesamiento basada en MATLAB para agilizar el análisis de los datos de calcio recopilados.

<table><tbody><tr><td>200 &mu; L puntas de pipeta universales</td><td>Pipetas Transcat</td><td>1030-260-000-9</td><td>Para eliminar la sangre y la solución salina</td></tr><tr><td>Aguja roma Luer Lock de 25 G (Puntas dispensadoras predobladas)</td><td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>Para extraer el tejido cerebral</td></tr><tr><td>Tapa protectora impresa en 3D</td> N<td>/A</td><td>N/A</td><td>Para proteger la lente GRIN</td></tr><tr><td>75% etanol</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd</td><td>bwsj-230219105303</td><td>Para la desinfección y limpieza de la superficie de la lente GRIN</td></tr><tr><td>AAV2/9-CaMKII&alpha;-GCaMP6f</td><td>virus Brain Case</td><td>BC-0083</td><td>Para inyección viral</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 versión 22.1</td><td>Para dibujar figuras</td></tr><tr><td>Bomba de aire de anestesia</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-30</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Software de control de cámara</td><td>Daheng Imaging</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td><td>Para registrar los datos de comportamiento</td></tr><tr><td>Soportes de férula de cánula/cerámica (soporte de lente GRIN)</td><td>RWD LIFE SCIENCE Co.,Ltd</td><td>68214</td><td>Para sostener la lente GRIN</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>Para reducir el dolor postoperatorio del ratón&nbsp;</td></tr><tr><td>Cable coaxial</td><td>Abrir ephys</td><td>CW8251</td><td>Para conectar el miniscopio y la caja DAQ del miniscopio</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Olympus Life Science&nbsp;</td><td>FV3000</td><td>Para observar las rebanadas de</td></tr><tr><td>cerebro Hisopo de algodón</td><td>Nanchang Xiangyi Medical Devices Co., Ltd</td><td>20202140438</td><td>Para la desinfección</td></tr><tr><td>Placa frontal personalizada</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para sujetar el ratón en la rueda de correr</td></tr><tr><td>Soporte de placa frontal personalizado</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Para sujetar la placa frontal del ratón Base de</td></tr><tr><td>dentadura postiza matierlals (autopolimerizable)</td><td>New Centry Dental</td><td>430205</td><td>Para colocar el miniscopio</td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Veet</td><td>ASIN : B001DUUPQ0</td><td>Para quitar el pelo del ratón</td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico digital de sobremesa, SGL M</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>68803</td><td>Para inyección viral e implantación de lentes GRIN</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>Para prevenir la inflamación postoperatoria del ratón</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>MZ62-WX</td><td>Para observar las condiciones durante las cirugías</td></tr><tr><td>Bote de filtro de gas, grande, paquete de 6</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-31-6</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Lente GRIN</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>Para implante de lentes GRIN Lente</td></tr> <tr><td></td><td>GRINInFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>Para la implantación de lentes GRIN</td></tr> Cámara <tr><td>de inducción-ratón (15 cm x 10 cm x 10 cm)</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>V100</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Cámara industrial</td><td>Daheng Imaging</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>Para adquirir los datos de comportamiento</td></tr><tr><td>Desinfectante de yodóforo</td><td>Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co., Ltd</td><td>8861F6DFC92A</td><td>Para la desinfección</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R510-22-10</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Tubo de recolección de muestras líquidas (Micropipeta de capilares de vidrio para Nanoject III)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Para inyección viral</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>Para analizar los datos</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>78001</td><td>Para craneotomía</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>Para extraer el tubo de recogida de muestras líquidas</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Para inyección viral</td></tr><tr><td>Miniscope DAQ Software</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>Para registrar los datos de imágenes de calcio</td></tr><tr><td>Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)</td><td>Open ephys</td><td>V3.3</td><td>Para adquirir los datos de imágenes de calcio</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>Para imágenes de calcio in vivo</td></tr><tr><td>Placa base del miniscopio V4 (Variante 2)</td><td>Open ephys</td><td>Variant 2</td><td>Para sostener el miniscopio</td></tr><tr><td>nanoject III Inyector de nanolitros programable</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>Para inyección viral</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Cisen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>H37022025</td><td>Para mantener los ojos húmedos</td></tr>, <tr><td>tubo de PCR</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>Para diluir el virus</td></tr><tr><td>Ordenador personal (ThinkPad)</td><td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>Para registrar los datos de imágenes de calcio y los datos de comportamiento</td></tr><tr><td>Rueda de correr</td><td>Shanghai Edai Pet Products Co., Ltd</td><td>NA-H115</td><td>Para sujetar el ratón al colocar la placa base</td></tr><tr><td>Destornillador (tornillos M1.6)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)</td><td>60902</td><td>Para desatornillar los tornillos M1.6</td></tr><tr><td>Destornillador (tornillos de fijación)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd)</td><td>S2</td><td>Para desatornillar los tornillos de fijación</td></tr><tr><td>Tornillo de fijación</td><td>TBD</td><td>2-56 Tornillo de fijación de punta cónica</td><td>Para sujetar el miniscopio a su placa base</td></tr><tr><td>Máquina de anestesia para animales pequeños</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>R500</td><td>Para anestesia</td></tr><tr><td>Jeringa estéril</td><td>Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD</td><td>20163140236</td><td>Para enjuagar la sangre</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>S14016-13</td><td>Para cortar el cabello y el cuero cabelludo</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura ThermoStar, 69025 almohadilla incl.</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>69027</td><td>Para mantener la temperatura corporal del animal</td></tr><tr><td>Pinzas ultrafinas</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>F11020-11</td><td>Para eliminar los restos óseos y la duradura</td></tr><tr><td>Cable USB 3.0</td><td>Open ephys</td><td>N/A</td><td>Para conectar el miniscopio DAQ box y el ordenador</td></tr><tr><td>Luz ultravioleta</td><td>Jinshida</td><td>66105854002</td><td>Para fijar la lente GRIN en el cráneo</td></tr><tr><td>Resina UV (adhesivo fotopolimerizable)</td><td>Loctite</td><td>32268</td><td>Para fijar la lente GRIN en el cráneo</td></tr><tr><td>Bomba</td><td>de vacío Kylin-Bell</td><td>GL-802B</td><td>Para eliminar la sangre, la solución salina y el tejido cerebral</td></tr></tbody></table>

imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado del hipocampo en ratones 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Los enfoques en tiempo real suelen ser necesarios en los estudios de aprendizaje y memoria, y las imágenes de calcio in vivo ofrecen la posibilidad de investigar la actividad neuronal en animales despiertos durante las tareas de comportamiento. Dado que el hipocampo está estrechamente asociado con la memoria episódica y espacial, se ha convertido en una región cerebral esencial en la investigación de este campo. En investigaciones recientes, las células de engrama y las células de lugar se estudiaron registrando las actividades neuronales en la región CA1 del hipocampo utilizando el microscopio en miniatura en ratones mientras realizaban tareas de comportamiento que incluían campo abierto y pista lineal. Aunque la circunvolución dentada es otra región importante en el hipocampo, rara vez se ha estudiado con imágenes in vivo debido a su mayor profundidad y dificultad para la obtención de imágenes. En este protocolo, presentamos en detalle un proceso de imágenes de calcio, que incluye cómo inyectar el virus, implantar una lente GRIN (índice de gradiente) y colocar una placa base para obtener imágenes del giro dentado del hipocampo. Describimos con más detalle cómo preprocesar los datos de imágenes de calcio utilizando MATLAB. Además, los estudios de otras regiones profundas del cerebro que requieren imágenes pueden beneficiarse de este método.

La Figura 1 muestra el esquema del procedimiento experimental, incluida la inyección del virus, la implantación de lentes GRIN, la afijación de la placa base, las imágenes de calcio in vivo a través de un miniscopio y el procesamiento de datos. Por lo general, todo el procedimiento dura 1 mes. La Figura 2 muestra ejemplos de procedimientos de inyección de virus, incluida la posición del orificio perforado en el cráneo y la condición del tejido cerebral antes de la implantación de la lente GRIN.
La figura 3 muestra el proceso de extirpación del tejido cerebral, que es crucial para el éxito de esta cirugía. A medida que se succiona más tejido, las diferentes capas de tejido se vuelven visibles. Este paso de succión se puede detener una vez que se observa una capa gris reflectante.
La Figura 4 muestra el procedimiento de la implantación de GRIN, incluida la inserción de la lente GRIN, la adherencia de la placa frontal en el cráneo y la cobertura de la lente GRIN con una tapa personalizada. La calidad de las imágenes de calcio in vivo depende del éxito de la inyección del virus y de la implantación de la lente GRIN.
La Figura 5 muestra cuatro tipos de resultados de imágenes de calcio in vivo. La figura 5A es el resultado fallido; No se observaron células activas en el campo de visión de la imagen. En la figura 5B-D se muestran los resultados exitosos. La figura 5B tiene menos de 10 células activas, pero no hay vasos sanguíneos obvios. La figura 5C tiene más de 50 células activas y vasos sanguíneos visibles. En la Figura 5D, hay cientos de células activas en el campo de visión de la imagen; Al mismo tiempo, observamos vasos sanguíneos claros. Las imágenes de calcio in vivo de alta calidad suelen tener cientos de células activadas. Se cree que menos de una docena de células activadas no son óptimas para obtener resultados de imagen. Por lo general, el número de células se correlaciona con el diámetro del cristalino GRIN, así como con la parte de la región del cerebro. Un diámetro de lente GRIN más grande y una región del cerebro más cercana a la cara dorsal aumentarán la probabilidad de observar más células activas. También es vital tener en cuenta que cuanto mayor sea el diámetro de la lente GRIN, más daño hace al cerebro del ratón; Por lo tanto, seleccionar el tamaño adecuado es crucial. La implantación de una lente GRIN de 1 mm de diámetro no afecta la capacidad del animal para adquirir el comportamiento lineal de la pista (Figura suplementaria S1).
Los datos de comportamiento y los datos de imágenes de calcio generalmente se procesan por separado. Los datos de comportamiento del ratón pueden etiquetarse manualmente o procesarse mediante un software de análisis de código abierto. Los datos de imágenes de calcio se procesan mediante Non-Rigid Motion Correction (NoRMCorre) y EXTRACT en MATLAB. La Figura 6 muestra las células individuales extraídas superpuestas en el campo de visión y muestra cinco trazas de calcio representativas de un registro exitoso de imágenes de calcio in vivo . Consulte el vídeo complementario S1 para ver un vídeo representativo de los datos sin procesar.
Verificar que la implantación de la lente GRIN y la inyección viral tienen lugar en la región cerebral prevista es el último paso y también es muy importante para la interpretación de los datos. La figura 7 es un corte de cerebro de ratón que muestra la posición de la expresión de GCaMP6f (la región de fluorescencia verde) y la pista de la lente GRIN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de los procedimientos de inyección de virus e implantación de lentes GRIN. (A) Inyectar el virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f en el giro dentado. (B) Implante la lente GRIN por encima de la circunvolución dentada. (C) Comprobar la calidad de las imágenes después de la cirugía. (D) Coloque la placa base del miniscopio después de la comprobación. (E) El cronograma y el proceso de todo el protocolo. Abreviatura: GRIN = Índice de gradiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig02.jpg"> Figura 2: Vista quirúrgica representativa durante la inyección del virus. (A) Coloque el ratón sobre el aparato estereotáxico. (B) Marque el área de implantación de la lente GRIN (la región negra). (C) Craneotomía en el área objetivo. (D) Inyectar 240 nL de virus en el giro dentado. (E) Retire la micropipeta después de la inyección. (F) Extirpar la corteza y parte del tejido cerebral CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig03.jpg"> Figura 3: Vista quirúrgica representativa durante la aspiración de tejido cerebral. (A) La región encerrada por el marcador negro se pule con un microtaladro, dejando (B) tejido cortical parcialmente expuesto. La parte izquierda muestra una corteza expuesta y la parte derecha está cubierta por duramadre y tejido craneal. (C) Imagen representativa durante la aspiración del tejido cerebral cortical. El tejido permanece de color rosa pálido. (D) La materia blanca es visible dentro del campo de visión, como lo indica la flecha blanca. (E) Una succión adicional reveló una superficie reflectante de color rojo grisáceo oscuro debajo de la materia blanca. Se cree que la región (flecha negra) es la superficie CA1 y la succión no debe ser más profunda. (F) No se ve más sangrado en la región después de enjuagar con solución salina varias veces. En todos los paneles, los asteriscos indican herramientas quirúrgicas: una aguja roma de 30 G para solución salina y una aguja roma de 25 G para la aspiración de tejido cerebral. Barras de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig04.jpg"> Figura 4: Un ejemplo de procedimiento para la implantación de lentes GRIN y la fijación de la placa base. (A) Implante la lente GRIN en el tejido cerebral utilizando un soporte para lentes GRIN. (B) Adherir la lente GRIN en el lugar adecuado con resina UV; la parte reflectante representa la resina UV. (C) Fije la placa de la cabeza en el cráneo del ratón con resina UV. (D) Cubra la lente GRIN con una tapa protectora impresa en 3D. (E) Verificar la calidad de la cirugía. El miniscopio estaba fijado por un soporte. (F) Aplique los materiales de la base de la dentadura postiza alrededor de la placa base. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig05.jpg"> Figura 5: Resultados exitosos y no exitosos de las imágenes. (A) Resultado infructuoso de las imágenes de calcio in vivo . No hay células activas en A y varias regiones tienen manchas de sangre oscuras, como lo indican las flechas negras. (B-D) Resultados exitosos de imágenes de calcio in vivo . (B) Se pueden observar menos de 10 células activas, pero no vasos sanguíneos significativos en el campo de la imagen. (C) Se pueden observar más de 50 células activas y vasos sanguíneos significativos. (D) Se pueden observar cientos de células activas y vasos sanguíneos más significativos. Los círculos discontinuos representan el campo de visión de la imagen. Las flechas verdes representan las celdas que expresan GCaMP6f. Las flechas rojas representan los vasos sanguíneos. Barras de escala = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig06.jpg"> Figura 6: Datos representativos de imágenes de calcio in vivo de un ratón que corre en la pista lineal. (A) El campo de visión de imagen registrado por el miniscopio, número total de celdas = 227. (B) Trazas representativas de calcio. Las ubicaciones de la celda se muestran en el mismo color en A. (C) Tarea conductual: Pista lineal con recompensas de agua en ambos extremos. (D) Resultado representativo del análisis conductual de la actividad del ratón; Tiempo total = 100 s. Las líneas verticales azules indican los puntos de tiempo del comportamiento de lamido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig07.jpg"> Figura 7: Secciones de tejido cerebral de ratones después de la cirugía. (A,B) Dos ejemplos de tejidos cerebrales de ratón. Las áreas rectangulares discontinuas indican la trayectoria de implantación de la lente GRIN. Las líneas curvas representan el giro dentado en el hipocampo. Barras de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Problema</td>
			<td>Posible causa</td>
			<td>Solución</td>
		</tr><tr><td>El campo de imagen aparece oscuro o negro.</td>
			<td>Hay una cantidad significativa de sangre residual en la parte inferior de la lente GRIN.</td>
			<td>Antes de implantar la lente GRIN, la solución salina se utiliza para enjuagar continuamente la superficie del sitio quirúrgico hasta que ya no hay sangrado observable.</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Hay vasos sanguíneos claramente visibles en el campo de la imagen, pero no hay actividad neuronal discernible.</td>
			<td>1. La expresión del virus fue subóptima o pobre.</td>
			<td>1. Sería recomendable comprobar lo siguiente:</td>
		</tr><tr><td>2. La ubicación de la expresión del virus observada no coincide con la posición donde se implantó la lente GRIN (generalmente, la posición de implantación de la lente GRIN es demasiado superficial en comparación con la ubicación deseada).</td>
			<td>un. Asegúrese de que las condiciones de almacenamiento del virus sean las adecuadas.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>b. Verifique que la ubicación de la inyección del virus sea correcta.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>c. Confirme que la concentración del virus es adecuada.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>2. Durante el próximo procedimiento quirúrgico, la profundidad de la implantación de la lente GRIN se puede aumentar adecuadamente, y la profundidad exacta debe registrarse cuidadosamente cada vez que se realiza el experimento.</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">El campo de imágenes muestra algunos patrones regionales de actividad neuronal, pero no hay actividad claramente visible a nivel de célula individual.</td>
			<td>1. El volumen de virus inyectado fue excesivamente alto.</td>
			<td>1. Diluir el virus o reducir el volumen de la inyección del virus.</td>
		</tr><tr><td>2. La ubicación de la expresión del virus no se alinea con la posición de la lente GRIN (por lo general, la lente GRIN se implanta a una profundidad menor que la posición óptima para la expresión del virus).</td>
			<td>2. Durante el próximo procedimiento quirúrgico, la profundidad de la implantación de la lente GRIN se puede aumentar adecuadamente, y la profundidad exacta debe registrarse cuidadosamente cada vez que se realiza el experimento.</td>
		</tr><tr><td>Hay ciertas células dentro del campo de imágenes que mantienen una señal de fluorescencia constante y brillante en todo momento, y no hay cambios en la intensidad de esta fluorescencia.</td>
			<td>El virus se sobreexpresa dentro de una sola célula.</td>
			<td>Diluir el virus o reducir el volumen de la inyección del virus.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Gráfico de solución de problemas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Figura suplementaria S1: Adquisición normal de la tarea de memoria espacial por ratones que se han sometido a cirugía. El gráfico muestra la cuantificación del número de ensayos completados en la sesión de 20 minutos cada día. Los datos se representan como media ± SEM. N = 3 ratones en el grupo con cirugía y 4 en el grupo sin cirugía. Para la comparación estadística se utilizó el ANOVA de dos vías. Abreviatura: ns = no significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video complementario S1: Datos brutos representativos de las imágenes de calcio en DG. Este video muestra la actividad del calcio durante un período de 5 minutos. El video se reproduce a 10 veces la velocidad original. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Video%20S1.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 1: El diseño de la placa de cabeza. Este archivo describe el dibujo en 2D del diseño de la placa principal. La producción de la placa principal implica el corte de acero inoxidable de acuerdo con el dibujo. Los dos pequeños orificios de la barra lateral deben golpearse con roscas M1.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: El diseño de la tapa protectora impresa en 3D. Este archivo proporciona el código g de las rebanadas de la tapa protectora que se pueden utilizar con una impresora 3D. En este protocolo, utilizamos plástico de ácido poliláctico como materia prima para la impresión. Los pequeños orificios en el lateral coinciden con las posiciones de los orificios roscados en la placa principal para la instalación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: El diseño del soporte del miniscopio. Este archivo proporciona el código g de las rebanadas del soporte del miniscopio que se pueden utilizar con una impresora 3D. El orificio cilíndrico se utiliza para la instalación en un soporte estereotáxico con un tornillo M4. Los orificios en el lateral están destinados a agregar tornillos para apretarlo, pero el soporte se puede usar sin esta característica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%203.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 4: Código de control de Arduino y scripts para el preprocesamiento de video de imágenes de calcio en bruto. Este archivo contiene los scripts para controlar Arduino y el código para preprocesar los datos de imágenes de calcio. El código de Arduino controla la configuración del comportamiento en la que el ratón aprende a lamer para obtener recompensas de agua en extremos alternos de una pista lineal. Al aprender la tarea, los ratones correrán repetidamente de un lado a otro en la pista. El código de preprocesamiento de imágenes de calcio realiza la conversión de formato de archivo, la corrección de movimiento, la reducción de la muestra espacial y la extracción de señales celulares a partir de los datos recopilados por el miniscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Supplemental%20File%204.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El giro dentado del hipocampo lleva a cabo funciones esenciales y distintas en el aprendizaje y la memoria. Este protocolo describe un conjunto de procedimientos robustos y eficientes para la obtención de imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado en ratones que se mueven libremente.

Imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado del hipocampo en ratones 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

in-vivo-calcium-imaging-granule-cells-dentate-gyrus-hippocampus

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución.

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

Fuente: Shannonhouse, J., et al. Imágenes de calcio in vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios de raíz dorsal intactos. J. Vis. Exp. (2023). El video muestra una técnica de imagen de calcio in vivo para monitorear la actividad neuronal en los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de un ratón transgénico. Las neuronas DRG expresan un indicador de calcio que aumenta la intensidad de la fluorescencia al unirse al calcio. Los estímulos...

Imágenes de calcio in vivo de conjuntos neuronales en los ganglios de la raíz dorsal intacta de un ratón

Source: Calvo-Rodríguez, et al. Imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia de Ca style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'&gt;2+ en neuronas del hipocampo envejecidas. J. Vis. Exp. (2015). Este video demuestra el uso de imágenes de fluorescencia para medir los niveles de calcio citosólico en cultivos de hipocampo de...

Imágenes de calcio in vitro en cultivos de hipocampo de rata a corto y largo plazo

Fuente: Lee, H. et. al., Imágenes exitosas de calcio in vivo con un microscopio miniaturizado de montaje en la cabeza en la amígdala de un ratón que se comporta libremente. J. Vis. Exp. (2020)Este video muestra imágenes de calcio in vivo en un ratón utilizando un índice de refracción de gradiente, o lente GRIN, y un microscopio miniaturizado. La configuración combina la fijación de la cabeza dentro de un sistema de jaula móvil sin fricción, estimulando las neuronas y desencadenando la entrada...

Imágenes microendoscópicas de calcio en tiempo real en un ratón que se mueve libremente

Aquí presentamos cómo exponer el ganglio geniculado de un ratón de laboratorio vivo y anestesiado y cómo usar imágenes de calcio para medir las respuestas de conjuntos de estas neuronas a los estímulos del sabor, lo que permite múltiples ensayos con diferentes estimulantes. Esto permite comparaciones en profundidad de qué neuronas responden a qué saborantes.

Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas de ratón a los estímulos del gusto

Presentamos un protocolo para exponer el médula oblonga del ratón adulto del lado ventral. Mediante el uso de una lente de índice de refracción de gradiente con un microscopio en miniatura, las imágenes de calcio se pueden utilizar para examinar la actividad de los somatas neuronales oliva inferiores in vivo.

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

El miniscopio de imágenes de calcio in vivo es una técnica poderosa para estudiar la dinámica neuronal y los microcircuitos en ratones que se comportan libremente. Este protocolo describe la realización de cirugías cerebrales para lograr buenas imágenes de calcio in vivo utilizando un miniscopio.

Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo

Este protocolo describe la exposición quirúrgica del ganglio de la raíz dorsal (GRD) seguida de GCaMP3 (indicador de Ca2+ codificado genéticamente; Proteína fluorescente verde-Calmodulina-M13 Proteína 3) Imagen de Ca2+ de los conjuntos neuronales utilizando ratones Pirt-GCaMP3 mientras se aplica una variedad de estímulos a la pata trasera ipsilateral.

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios intactos de la raíz dorsal

El presente protocolo describe imágenes de calcio in vivo para medir las respuestas de conjuntos de neuronas lumbar-6 DRG a estímulos somáticos y viscerales. Se pueden hacer comparaciones exhaustivas entre las neuronas que responden a diferentes estímulos. Este protocolo es valioso para investigar los mecanismos del dolor visceral y la estimulación somática, como la acupuntura.

in vivo Imágenes de calcio de la respuesta de las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal a estímulos somáticos y viscerales

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI, por sus siglas en inglés) permiten un análisis robusto a nivel poblacional de la señalización de las neuronas sensoriales. Aquí, hemos desarrollado un enfoque novedoso que permite la visualización in vivo de GECI de la actividad de las neuronas de los ganglios trigéminos de rata.

En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata

Este protocolo describe imágenes de calcio GCaMP in vivo de neuronas intactas del ganglio trigémino (TG). Esta descripción incluye cirugía de exposición TG, imágenes de microscopía confocal in vivo de neuronas TG, aplicación de estímulos somáticos durante imágenes microscópicas de neuronas TG y análisis de datos de imágenes de calcio GCaMP in vivo .

In vivo Imágenes de calcio de conjuntos neuronales en redes de neuronas sensoriales primarias en ganglios del trigémino intactos

Aprende a realizar imágenes de calcio in vivo en células granulosas del giro dentado del hipocampo en ratones libremente móviles. Este protocolo integra la inyección de virus y el implante de lente GRIN en un solo procedimiento quirúrgico para mejorar la calidad de los datos.

Imágenes de calcio in vivo de células granulosas en el giro dentado del hipocampo en ratones

Explorar más videos