Name: Aislamiento de capilares retinianos y matriz subendotelial de ratón para la medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprende a aislar capilares retinianos y matriz subendotelial en ratón para medir rigidez vascular mediante microscopía de fuerza atómica. Este método permite estudiar la mecanobiología en la retinopatía diabética.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el National Eye Institute/NIH Grant R01EY028242 (a K.G.), el Premio Catalyst de la Investigación para Prevenir la Ceguera/Fundación Internacional de Investigación de la Retina por Enfoques de Investigación Innovadores para la DMAE (a K.G.), la Beca Especial de la Iniciativa Stephen Ryan para la Investigación Macular (RIMR) de la Fundación W.M. Keck (al Instituto Oftalmológico Doheny), y la Beca Ursula Mandel y la Beca de Diversidad del Consejo de Graduados de UCLA (a I.S.T.). Este trabajo también fue apoyado por una subvención sin restricciones de Research to Prevent Blindness, Inc. para el Departamento de Oftalmología de UCLA. El contenido de este artículo es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Medición de la rigidez en los capilares de la retina y la matriz subendotelial de ratón

<ol><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+current+understanding%2C+mechanisms%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).</li>
<li>Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+pathological+changes+in+the+diabetic+retina%3A+Implications+for+targeting+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy.</a> Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).</li>
<li>Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+molecular+and+cellular+pathology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+retinal+vascular+inflammation+and+degeneration+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes.</a> Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subendothelial+matrix+stiffening+by+lysyl+oxidase+enhances+RAGE-mediated+retinal+endothelial+activation+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes.</a> Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+stiffening+promotes+retinal+endothelial+activation+associated+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes.</a> FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).</li>
<li>Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+Mechanotransduction+pathways+that+control+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology.</a> Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).</li>
<li>Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stresses+and+translational+distortion+of+the+nucleus+during+fibroblast+migration+on+a+physiologically+relevant+ECM+mimic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic.</a> Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).</li>
<li>Ghosh, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell+and+tissue+development%3A+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+cell+and+basement+membrane+architecture+contribute+to+sidestream+smoke-induced+choroidal+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+increases+choroidal+endothelial+stiffness+and+susceptibility+to+complement+injury%3A+Implications+for+choriocapillaris+loss+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell+stiffness+contributes+to+complement-mediated+injury+of+choroidal+endothelial+cells+in+a+monkey+model+of+early+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration.</a> J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Phys%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> J Vis Exp. (76), e50489(2013).</li>
<li>Beacham, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+extracellular+matrices+produced+by+cultured+and+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).</li>
<li>Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+stiffness+of+ex+vivo+mouse+aortas+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy.</a> J Vis Exp. (116), e54630(2016).</li>
<li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+intimal+stiffening+enhances+endothelial+permeability+and+leukocyte+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration.</a> Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).</li>
<li>Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+trypsin+and+elastase+digestion+techniques+for+isolation+of+murine+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature.</a> Microvasc Res. 154, 104682(2024).</li>
<li>Chaqour, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+measurements+of+retinal+microvessel+stiffness+in+mice+with+endothelial-specific+deletion+of+CCN1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1.</a> Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).</li>
<li>Ashraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+density+of+deep%2C+intermediate+and+superficial+vascular+plexuses+are+differentially+affected+by+diabetic+retinopathy+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).</li>
<li>Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+D%3A+an+Macrophage-derived+factor+mediating+increased+endothelial+cell+permeability+with+implications+for+alteration+of+the+blood-retinal+barrier+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy.</a> FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La MFA ha sido ampliamente utilizada para medir los cambios asociados a enfermedades en la rigidez de los vasos más grandes, como la aorta y las arterias16. Estos hallazgos han ayudado a establecer el papel de la mecanobiología endotelial en complicaciones cardiovasculares como la aterosclerosis17. Sobre la base de estos hallazgos, hemos comenzado a investigar el papel previamente no reconocido de la mecanobiología endotelial en el desarrollo de lesiones microvasculares de la retina en la RD temprana. El éxito en esta búsqueda, sin embargo, depende de la medición precisa de los cambios inducidos por la diabetes en la rigidez capilar de la retina. Estudios recientes han revelado que, al igual que en los grandes vasos, la rigidez de los capilares retinianos y de la matriz subendotelial retiniana secretada por la CE también puede medirse de forma directa, precisa y fiable utilizando AFM 4,5,6.
Este enfoque consiste en aislar los capilares de la retina de los ratones a partir de los ojos ligeramente fijados mediante la digestión con tripsina. Según la experiencia, este paso de fijación leve es necesario ya que los capilares aislados de los ojos no fijos (utilizando el método hipotónico) son frágiles y se fragmentan, lo que los hace inadecuados para la medición de la rigidez de la AFM4. Por el contrario, una fijación más fuerte y la consiguiente necesidad de una digestión extensa de tripsina, que se ha descrito en otros protocolos de digestión de tripsinaretiniana 18, también pueden comprometer la integridad estructural capilar, a juzgar por la interrupción de las uniones estrechas. Por lo tanto, la fijación capilar suave y la digestión suave de la tripsina empleadas aquí ayudan a reducir los artefactos de rigidez que surgen de la reticulación excesiva inducida por formalina y garantizan la integridad estructural de los capilares para una medición confiable de la rigidez de AFM.
Como enfoque alternativo, un estudio reciente reportó la medición de la rigidez de AFM de los capilares de la retina a partir de monturas planas de retina ligeramente fijadas19. Al realizar indentaciones de fuerza AFM en los capilares de la retina dentro de la retina intacta, este enfoque permite la medición de la rigidez in situ . Sin embargo, es probable que estas mediciones de rigidez capilar incluyan la rigidez de la membrana limitante interna. Además, este enfoque se restringe a la medición de solo los capilares superficiales que son accesibles en un montaje plano de la retina, dejando fuera el plexo capilar más profundo que se ve afectado específicamente a principios de DR20. Estos problemas se pueden abordar utilizando este enfoque, que extrae los vasos de manera limpia (desprovistos de tejido retiniano residual) de todas las capas de la retina. Actualmente estamos optimizando este protocolo para aislar vasos coroideos de modelos animales de DMAE temprana. Dicho esto, nos damos cuenta de que la fijación leve de formalina empleada en el protocolo puede causar un artefacto de endurecimiento asociado a la reticulación en las mediciones de AFM. Por lo tanto, sería prudente interpretar los valores de rigidez vascular obtenidos utilizando este enfoque más en términos de cambios relativos en la rigidez (entre diferentes grupos experimentales) que de rigidez absoluta.
A diferencia de los capilares retinianos que requieren una fijación leve, la matriz subendotelial obtenida de los cultivos de EC de retina puede evaluarse sin ninguna modificación. Esto se debe en gran medida a la robustez de la matriz depositada, que resulta de una combinación de varios factores, incluida la adición de ácido ascórbico en el medio de cultivo (que mejora la síntesis de colágeno15), la modificación química de los cubreobjetos de vidrio que evita el desprendimiento de la matriz durante la descelularización y la duración prolongada del cultivo (10-15 días). Es importante destacar que hemos demostrado que el aumento inducido por la hiperglucemia en la rigidez de la matriz subendotelial in vitro es consistente con el aumento inducido por la diabetes en la rigidez capilar de la retina observado in vivo4. Esto no es sorprendente, ya que se espera que un aumento en la rigidez de la matriz aumente la rigidez de las CE retinianas suprayacentes (debido a la reciprocidad mecánica) que, en conjunto, aumentan la rigidez capilar general. De hecho, recientemente demostramos que las CE de la retina se vuelven más rígidas cuando crecen en condiciones diabéticas4, probablemente a través de un aumento en la tensión del citoesqueleto de actina dependiente de Rho/ROCK21. Estos hallazgos también implican que el endurecimiento de la CE coroidea observado en el modelo de mono rhesus de DMAE temprana refleja el aumento de la rigidez de la matriz subendotelial coroidea y de los vasos intactos12, una idea que se está probando en estudios en curso. En general, el hecho de que las alteraciones de la rigidez en la matriz subendotelial de la retina no fijada y en las CE reflejen la tendencia observada en los vasos retinianos intactos ligeramente fijados atestigua la validez del enfoque de fijación leve.
La medición directa de la rigidez de los capilares de la retina a partir de modelos animales de RD no solo ayuda a establecer la mecanobiología endotelial como un nuevo objetivo terapéutico para el tratamiento de la RD, sino que también proporciona una sólida justificación para desarrollar nuevas técnicas de imagen sensibles para la evaluación no invasiva de la rigidez capilar de la retina en pacientes con RD en el futuro. Estas técnicas no invasivas podrían detectar cambios sutiles en el flujo sanguíneo que se espera que surjan del endurecimiento capilar, similares a los cambios en la velocidad de la onda del pulso arterial que se detectan comúnmente en las enfermedades cardiovasculares inducidas por la diabetes. Las mediciones de la rigidez de la AFM de los capilares de la retina aislados de ojos humanos post-mortem de donantes diabéticos proporcionarán una importante prueba de concepto a este respecto. Dado que la rigidez capilar de la retina aumenta temprano en el modelo de ratón (estreptozotocina) de diabetes tipo 14, el uso exitoso de la AFM para validar las modalidades de imagen de medición de la rigidez puede conducir a la identificación de la rigidez capilar como un biomarcador clínico para la patogénesis temprana de la RD.

Los capilares de la retina son esenciales para mantener la homeostasis de la retina y la función visual. De hecho, su degeneración en la diabetes temprana está fuertemente implicada en el desarrollo de complicaciones amenazantes para la visión de la retinopatía diabética (RD), una afección microvascular que afecta a casi el 40% de todos los individuoscon diabetes. La inflamación vascular contribuye significativamente a la degeneración capilar de la retina en la RD. Estudios anteriores han demostrado un papel importante de las señales moleculares y bioquímicas aberrantes en la inflamación vascular de la retina inducida por la diabetes 2,3. Sin embargo, trabajos recientes han introducido un nuevo paradigma para la patogénesis de la RD que identifica el endurecimiento capilar de la retina como un determinante crucial aún no reconocido de la inflamación y degeneración vascular de la retina 4,5,6.
Específicamente, el aumento de la rigidez capilar de la retina inducido por la diabetes es causado por la regulación positiva de la enzima reticulante de colágeno lisil oxidasa (LOX) en las células endoteliales de la retina (EC), lo que endurece la matriz subendotelial (membrana basal)4,5,6. El endurecimiento de la matriz, a su vez, endurece las CE retinianas suprayacentes (debido a la reciprocidad mecánica), lo que conduce al aumento general de la rigidez capilar de la retina4. De manera crucial, este endurecimiento capilar de la retina inducido por la diabetes por sí solo puede promover la activación de la EC en la retina y la muerte de la EC mediada por la inflamación. Esta regulación mecánica de los defectos de la CE en la retina puede atribuirse a la alteración de la mecanotransducción endotelial, el proceso por el cual las señales mecánicas se convierten en señales bioquímicas para producir una respuesta biológica 7,8,9. Es importante destacar que las señales mecánicas alteradas de la CE y la estructura de la matriz subendotelial también se han implicado en la degeneración vascular coroidea asociada con la degeneración macular asociada a la edad temprana (DMAE)10,11,12, lo que atestigua las implicaciones más amplias de la mecanobiología vascular en las enfermedades degenerativas de la retina.
En particular, el endurecimiento capilar de la retina se produce al principio de la diabetes, que coincide con el inicio de la inflamación de la retina. Por lo tanto, el aumento de la rigidez capilar de la retina puede servir como diana terapéutica y como marcador de diagnóstico precoz de la RD. Para ello, es importante obtener mediciones fiables y directas de la rigidez de los capilares de la retina y de la matriz subendotelial. Esto se puede lograr mediante el uso de un microscopio de fuerza atómica (AFM), que ofrece una técnica única, sensible, precisa y confiable para medir directamente la rigidez de las células, la matriz extracelular y los tejidos13. Un AFM aplica una fuerza de indentación diminuta (a nivel de nanoNewton) sobre la muestra cuya rigidez determina el grado en que se dobla el voladizo del AFM con indentación: cuanto más rígida es la muestra, más se dobla el voladizo y viceversa. Hemos utilizado ampliamente la AFM para medir la rigidez de células endoteliales cultivadas, matrices subendoteliales y capilares retinianos aislados de ratón 4,5,6,11,12. Estas mediciones de la rigidez de AFM han ayudado a identificar la mecanobiología endotelial como un determinante clave de la patogénesis de la RD y la DMAE. Para ayudar a ampliar el alcance de la mecanobiología en la investigación de la visión, aquí proporcionamos una guía paso a paso sobre el uso de AFM para mediciones de rigidez de capilares retinianos aislados de ratón y matriz subendotelial.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Aislamiento capilar de la retina</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 y micro; m Filtro de jeringa PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVM33RS</td><td>Baja Unión a Proteínas Durapore</td></tr><tr><td>10X Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio % magnesio</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td>Concentración final 1X, pH 7.4</td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>Falcon Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>Libre de Rnasa-Dnasa, No pirogénico</td></tr><tr><td>20 mL Jeringa Luer-Lok TIP</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 pulgadas Vidrio de borosilicato desechable/No estéril pipeta Pasteur</td><td>FisherBrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Placa de cultivo de tejidos</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos</td><td>Falcon Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Hold 2 Pap - Pluma de 13 mL</td><td>Laboratorio de Dispositivos Científicos</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Portacuchillas</td><td>X-ACTO Acero al</td><td></td><td></td></tr><tr><td>carbono Cuchilla quirúrgica #10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>Cera dental</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Am-scope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de formalina, tamponada neutra, 10%</td><td>Millipore Sigma</td><td>HT501128-4L Concentración</td><td>final 5% (v/v)</td></tr><tr><td>Kimwipes - toallitas húmedas</td><td>Kimtech Science</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Micro espátula</td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>Orbital</td><td>Shaker Lab Genius</td><td>SK-O180</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Economy #7 Acero inoxidable 115mm&nbsp; Pinza</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5667</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase</td><td>Nikon TS2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purifier Logic+ Clase II, Tipo A2 Cabina de bioseguridad</td><td>Labconco</td><td>302380001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Safe-Lock 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>AmScope</td><td>SM-3 Series Zoom Microscopio estereoscópico trinocular 3.5X-90X</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopía Superfrost Plus - Lengüeta blanca - Prelimpieza - 25x75x1,0 mm</td><td></td><td></td> Tampón Tris 1255015 <td></td></tr><tr><td>FisherBrand, solución 0,1M, pH 7,4 - Grado biotecnológico</td><td>VWR</td><td>E553-500ML</td><td>pH 8 para solución de tripsina</td></tr><tr><td>Tripsina 1:250 polvo Grado de cultivo de tejidos</td><td>VWR</td><td>VWRV0458-25G</td><td>10 % (p/v) solución de tripsina</td></tr><tr><td>Agua Grado de Biología Molecular Corning</td><td></td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Matriz subendotelial </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Corning</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS con calcio y magnesio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV anticuerpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-26549</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6140</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Invitrogen-Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio (12 mm)</td><td>Fisher</td><td>12-541-000</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales de la retina humana (HREC)</td><td>Cell Systems Corp</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>medio MCDB131</td><td>Corning</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales de la retina de ratón (mREC)</td><td>Cell Biologics</td><td>C57-6065</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>AFM Medición</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 y micro; m Sonda</td><td>Bruker</td><td>SAA-SPH-1UM</td><td>Una sonda hemisférica de 19 micras de altura con radio final de 1 micras, constante de resorte 0,25 N/m</td></tr><tr><td>70 nm Sonda LC</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-V2</td><td>Una sonda hemisférica de 19 micras de altura con radio final de 70 nm, &nbsp; Constante de resorte 0.1N/m</td></tr><tr><td>&nbsp; cámara</td><td>XCAM family</td><td>Toupcam</td><td>1080P</td></tr><tr><td>HDMI Desktop para ejecutar la cámara</td><td></td><td>Asus Asus desktop</td><td>Intel i5-6600 CPU , 8GB RAM</td></tr><tr><td>Soporte de plato para cubreobjetos</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td>29mm plato de fondo de vidrio con &nbsp; Micropocillo de 14 mm</td></tr><tr><td>Nanowizard 4</td><td>Bruker</td><td>Nanowizard 4</td><td>Microscopio de fuerza atómica Bioscience montado en un microscopio óptico para la medición sensible de las propiedades mecanoestructurales (rigidez y topografía) de muestras biológicas blandas</td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td>Microscopio invertido con objetivo 10X</td></tr></tbody></table>

aislamiento de capilares retinianos y matriz subendotelial de ratón para la medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

La degeneración capilar de la retina es un sello clínico de las primeras etapas de la retinopatía diabética (RD). Nuestros estudios recientes han revelado que el endurecimiento capilar de la retina inducido por la diabetes desempeña un papel causal crucial y previamente no reconocido en la degeneración de los capilares de la retina mediada por la inflamación. El aumento de la rigidez capilar de la retina es el resultado de la sobreexpresión de la lisil oxidasa, una enzima que se entrecruza y endurece la matriz subendotelial. Dado que se espera que el abordaje de la RD en una etapa temprana prevenga o ralentice la progresión de la RD y la pérdida de visión asociada, la matriz subendotelial y la rigidez capilar representan objetivos terapéuticos relevantes y novedosos para el tratamiento temprano de la RD. Además, la medición directa de la rigidez capilar de la retina puede servir como un paso crucial de validación preclínica para el desarrollo de nuevas técnicas de imagen para la evaluación no invasiva de la rigidez capilar de la retina en sujetos animales y humanos. Con este punto de vista en mente, aquí proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento y la medición de la rigidez de los capilares de la retina y la matriz subendotelial de ratón utilizando microscopía de fuerza atómica.

Capilares retinianos de ratón La medición de la rigidez de la AFM de los capilares retinianos aislados implica pasos de manipulación de muestras que podrían dañar su integridad mecanoestructural. Para evitar esto y, por lo tanto, garantizar la viabilidad, fiabilidad y reproducibilidad de las mediciones de AFM, los ojos enucleados se fijan en formalina al 5% durante la noche a 4 °C antes del aislamiento del vaso. Este protocolo de fijación suave con concentración reducida de formalina, baja temperatura de fijación, tiempo de fijación limitado y ausencia de punción corneal se desarrolló para minimizar cualquier posible artefacto de reticulación/endurecimiento causado por la fijación química. Como se muestra en la Figura 2B, C, esta fijación relativamente suave asegura que la vasculatura retiniana aislada sea estructuralmente robusta y lo suficientemente duradera para la medición de AFM. Por el contrario, los vasos retinianos aislados de ojos no fijos (utilizando el método hipotónico)4 u ojos brevemente fijos (durante 8 h) se fragmentan o colapsan, lo que los hace inadecuados para la medición de la MFA (Figura 2B).
Matriz subendotelial de la retina La rigidez vascular refleja la rigidez combinada de las células vasculares y la membrana basal (matriz subendotelial)4. Dado que las células se adaptan a la rigidez de la matriz experimentando un cambio similar en su propia rigidez, un proceso denominado reciprocidad mecánica9, la rigidez de la matriz subendotelial, se convierte en un determinante importante de la rigidez vascular general. Para la medición de la rigidez de la matriz, es importante obtener una matriz subendotelial homogéneamente densa. En el caso de las CE de retina humana cultivadas en un medio de cultivo suplementado con ácido ascórbico, esto suele tardar entre 10 y 15 días (Figura 3A)4,5,6. Esta diferencia en el período de cultivo puede deberse a diferencias entre lotes en las CE retinianas primarias disponibles comercialmente. Además, generalmente encontramos que las EC retinianas disponibles comercialmente de ratones C57BL/6 depositan una matriz más densa en comparación con el cultivo primario de EC de retina humana, lo que indica diferencias específicas de la especie. Como se muestra en la Figura 3A, las imágenes de contraste de fase solo proporcionan una vista bruta de la matriz a escala macro. Sin embargo, la estructura fibrilar más fina de nano a microescala se hace evidente en las imágenes de fluorescencia confocal de alta resolución de la matriz inmunomarcada con anticuerpos contra las proteínas estructurales de la matriz colágeno IV y fibronectina (Figura 3B). Cabe señalar que estas proteínas de la matriz también proporcionan señales instructivas a las células endoteliales al unirse a receptores específicos de integrinas9.
Medición de la rigidez AFM La selección de la rigidez del voladizo (constante de resorte, k) y la dimensión de la sonda adecuadas es esencial para mediciones confiables y sensibles. Estos parámetros deben elegirse para que coincidan con la rigidez y las dimensiones de la muestra biológica. Una vez que el voladizo seleccionado se ha montado en el AFM, el rayo láser infrarrojo debe enfocarse en la punta del voladizo y el punto láser reflejado debe centrarse en el fotodetector. Esta alineación láser garantiza una detección precisa y sensible de la deflexión del voladizo y, en consecuencia, la medición de la rigidez. Una medición de rigidez AFM comienza con el piezoeléctrico z moviendo el voladizo verticalmente hacia la muestra. No hay deflexión en voladizo en este momento, lo que produce una línea de base plana de la curva de aproximación (Figura 4A). A medida que la sonda en voladizo entra en contacto con la muestra y la muesca, el voladizo se dobla, lo que provoca una deflexión láser en el fotodetector, que se representa mediante la deflexión vertical de la curva de aproximación. Después de aplicar una fuerza de indentación preestablecida (fuerza de consigna) sobre la muestra, el voladizo se retrae a la posición inicial (altura objetivo Z) lejos de la muestra. A continuación, la curva de retracción desviada se ajusta al modelo de Hertz/Sneddon para calcular el módulo de Young (rigidez) de la muestra.
A partir de la medición representativa de la indentación de la fuerza que se muestra en la Figura 4, está claro que las curvas de aproximación y retracción obtenidas de un capilar retiniano aislado de un ratón diabético (Figura 4B) son sustancialmente más pronunciadas que las obtenidas de un ratón no diabético (Figura 4A). La pendiente más pronunciada de las curvas de indentación de fuerza indica una mayor deflexión en voladizo causada por una mayor resistencia de la muestra a la indentación de fuerza, lo que refleja una mayor rigidez de la muestra13. De hecho, el análisis posterior de datos de múltiples curvas de indentación de fuerza reveló que los capilares de la retina del ratón se vuelven significativamente más rígidos en la diabetes4. También debe tenerse en cuenta que el contacto entre la sonda en voladizo y las muestras biológicas a menudo causa una adhesión superficial inespecífica, lo que conduce a una deflexión negativa del voladizo durante la retracción, como se ve en la extensión de la curva de retracción más allá de la línea de base (Figura 4B). Además, las muestras biológicas como las células, la matriz y los vasos sanguíneos son viscoelásticas por naturaleza y, por lo tanto, pueden sufrir alguna deformación permanente y/o cambio en la rigidez aparente después de la indentación por fuerza. Si es así, esto se reflejará en la desalineación de las curvas de aproximación y retracción (histéresis). De hecho, la comparación de la Figura 4A y la Figura 4B confirma la tendencia esperada en la que la indentación forzada de los capilares más blandos en ratones no diabéticos produce una histéresis mayor que la observada en sus homólogos más rígidos. Como se informó anteriormente 5,6, la rigidez (módulo de Young) de las matrices subendoteliales obtenidas de cultivos de EC de retina también se calcula de la manera antes mencionada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig01.jpg"> Figura 1: Ilustración esquemática del corte de incisión realizado en un ojo de ratón para el aislamiento de la retina. Usando pinzas para sujetar el nervio óptico, se usa un bisturí para hacer una incisión completa posterior al limbo para separar la retina del ratón del cristalino y la cámara anterior. La línea discontinua morada muestra la ubicación de la incisión vertical. Este esquema se dibujó utilizando un software científico de imagen e ilustración. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig02.jpg"> Figura 2: Optimización del protocolo para el aislamiento de vasos retinianos intactos de ratón para la medición de AFM. (A) La imagen estereoscópica muestra una retina intacta aislada de un ojo de ratón ligeramente fijo antes de los pasos de aislamiento capilar. Barra de escala: 2 mm. (B) Imágenes representativas de contraste de fase con un aumento de 4x muestran vasos retinianos de ratón obtenidos utilizando los diferentes métodos de aislamiento. Comparando la integridad estructural y la durabilidad de los vasos aislados, se encontró que la digestión de tripsina de las retinas de ojos enucleados fijados en formol al 5% durante 24 h a 4 °C (caja roja) produjo la vasculatura retiniana más adecuada para la medición de la rigidez de la AFM. Los vasos retinianos aislados con este método exhibieron una red vascular clara que se extendió uniformemente a lo largo de la superficie del vidrio. Barra de escala: 500 μm. (C) La vista de alto aumento (20x) de una red capilar retiniana intacta, similar a la que se muestra en (B), confirma la alta integridad estructural de los capilares obtenidos de ojos ligeramente fijos. Barra de escala: 100 μm. Esta cifra ha sido modificada de4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig03.jpg"> Figura 3: Matrices descelularizadas obtenidas a partir de cultivos primarios de REC humanos y de ratón. (A) Imágenes representativas de contraste de fase con un aumento de 20x que muestran agregados de matriz subendotelial en cubreobjetos de vidrio después de la descelularización de cultivos de REC de 10 días (10 d) o 15 días (15 d) de REC humanos o de ratón. Barra de escala: 100 μm. (B) Imágenes representativas de fluorescencia confocal de alto aumento (100x) de matrices descelularizadas obtenidas de cultivos REC humanos de 15 d y marcadas con anticuerpos anti-colágeno IV y anti-fibronectina revelan un colágeno nanofibrilar IV denso y matriz de fibronectina. Barra de escala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig04.jpg"> Figura 4: Curvas de fuerza-distancia de la medición de la rigidez de AFM de los capilares de la retina de ratón. Los gráficos de líneas indican una curva representativa de aproximación (color claro) y retracción (color oscuro) a partir de una sola medición de indentación de fuerza en una ubicación de un capilar retiniano de ratón aislado de un ratón (A) no diabético o (B) diabético. Las curvas de fuerza obtenidas utilizando una sonda de voladizo hemisférica SAA-SPH de 1 μm de radio, trazan la relación entre la distancia en voladizo y la muestra (controlada por el z-piezoeléctrico) y la fuerza vertical aplicada que causa la deflexión del voladizo. (A) La flecha amarilla indica el enfoque en voladizo impulsado por pie en z hacia la muestra, la flecha blanca indica el punto de contacto donde la sonda en voladizo hace contacto con la muestra y la flecha verde indica la deflexión del voladizo hasta una fuerza de indentación de punto de ajuste (pico) (*). (B) Tanto las curvas de aproximación como las de retracción obtenidas de un capilar retiniano aislado de ratones diabéticos exhiben una pendiente marcadamente más pronunciada que las de sus contrapartes no diabéticas (mostradas en A), lo que indica una mayor rigidez capilar en ratones diabéticos. La punta de flecha indica una caída en la curva de retracción por debajo de la línea de base, que refleja la deflexión negativa de la sonda en voladizo causada por la adhesión entre la sonda y la muestra durante la indentación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Recientemente identificamos el endurecimiento capilar de la retina como un nuevo paradigma para la disfunción retiniana asociada con la diabetes. Este protocolo detalla los pasos para el aislamiento de los capilares de la retina del ratón y la matriz subendotelial de los cultivos endoteliales de la retina, seguido de una descripción de la técnica de medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica.

Aislamiento de capilares retinianos y matriz subendotelial de ratón para la medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica

Retinal capillary degeneration is a clinical hallmark of the early stages of diabetic retinopathy (DR). Our recent studies have revealed that ...

isolation-mouse-retinal-capillaries-subendothelial-matrix-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La rigidez de la matriz extracelular influye fuertemente en múltiples conductas de las células adherentes. Matriz de rigidez varía espacialmente a lo largo de un tejido, y sufre modificaciones en las condiciones de diversas enfermedades. Aquí desarrollamos métodos para caracterizar las variaciones espaciales en la rigidez de los tejidos del ratón normal de los pulmones y fibrosis con microindentation microscopia de fuerza atómica.

Micro-Mecánica Caracterización del tejido pulmonar con microscopía de fuerza atómica

Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Presentamos protocolos detallados para el aislamiento de aortas de ratones y la medición de su módulo elástico utilizando microscopía de fuerza atómica.

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Presentamos un método para investigar los cambios osteoartríticos tempranos a nivel celular en el cartílago articular mediante el uso de microscopía de fuerza atómica (AFM).

Aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana

Presentamos un protocolo para medir los módulos elásticos de áreas ricas en colágeno en hígado normal y enfermo utilizando microscopía de fuerza atómica. El uso simultáneo de microscopía de polarización proporciona una alta precisión espacial para localizar áreas ricas en colágeno en las secciones hepáticas.

Medición de la rigidez hepática mediante microscopía de fuerza atómica junto con microscopía de polarización

Este documento tiene como objetivo instruir al lector en la operación de una fuerza integrada atómica microscopio óptico de imagen para la estimulación mecánica de las células vivas en la cultura. Un protocolo de paso a paso se presenta. Un conjunto representativo de datos que muestra la respuesta de células vivas a la estimulación mecánica se presenta.

Respuesta de células vivas a la estimulación mecánica estudiados por microscopía óptica integrada la Fuerza Atómica y

El efecto de la rigidez del sustrato en la función celular puede ser...

El estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles

En este video, vamos a demostrar cómo aislar las células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo del ratón y hacer crecer en cultivo de forma clonal esferas de retina. Las esferas que se encuentran aisladas poseen las propiedades cardinales de las células madre: la auto-renovación y multipotencialidad.

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

La unión de viriones a una superficie es un requisito para la obtención de imágenes de viriones individuales mediante imágenes de fluorescencia de súper resolución o microscopía de fuerza atómica (AFM). Aquí se demuestra un método de preparación de la muestra para la adhesión controlada de viriones a las superficies de vidrio adecuado para su uso en AFM y super-resolución de imágenes de fluorescencia.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de entero, intacto el ratón glándulas mamarias para investigar la expresión de matriz extracelular (ECM) y morfología ductal. Las glándulas abdominales de ratón #4 se extrajeron de ratones femeninos nulíparas del 8-10 semanas de edad fijado en formalina tamponada neutra, seccionadas y teñido mediante inmunohistoquímica para las proteínas de la ECM.

Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula

Aprende a aislar capilares retinianos y matriz subendotelial en ratón para medir rigidez vascular mediante microscopía de fuerza atómica. Este método permite estudiar la mecanobiología en la retinopatía diabética.

Aislamiento de capilares retinianos y matriz subendotelial de ratón para la medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de capilares retinianos y matriz subendotelial de ratón para la medición de la rigidez mediante microscopía de fuerza atómica

Explorar más videos