Name: Generación y caracterización de organoides de útero de rata a partir de células madre epiteliales endometriales de rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprende a generar organoides de útero de rata a partir de células madre epiteliales endometriales. Este protocolo reproducible facilita el estudio de enfermedades endometriales y aplicaciones en edición génica.

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<ol><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li>
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<li>Esfandiari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometriosis+organoids%3A+prospects+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Endometriosis organoids: prospects and challenges.</a> Reprod Biomed Online. 45 (1), 5-9 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Anti-CD15 (SSEA-1)</td><td>Abcam</td><td>ab135377</td><td>Conejo, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Receptor antiestrógeno alfa</td><td>Abcam</td><td>ab32063</td><td>Conejo, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-citoqueratina</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>Ratón, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>Receptor anti-progesterona</td><td>Abcam</td><td>ab101688</td><td>Conejo, 1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab279653</td><td>Ratón, 1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>A8301</td><td>TargetMol</td><td>909910-43-6</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Merck</td><td>E8875</td><td></td></tr><tr><td>Kit de recuento de células-8</td><td>Beyotime</td><td>C0038</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>BioLegend</td><td>109819</td><td>1:20 (FC), Pacific Blue</td></tr><tr><td>CD24</td><td>BioLegend</td><td>101806</td><td>1:20 (FC), FITC</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>303120</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>301703</td><td>1:20 (FC), PE</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>TargetMol</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Solución de recolección de organoides</td><td>R& D Systems</td><td>3700-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 TSA Kit de sistema de fluorescencia</td><td>APExBIO</td><td>K1051</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 TSA Kit de sistema de fluorescencia</td><td>APExBIO</td><td>K1052</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>BioLegend</td><td>369803</td><td>1:20 (FC),</td></tr><tr><td>Kit de sistema de fluorescencia PerCP Fluorescein TSA</td><td>APExBIO</td><td>K1050</td><td></td></tr><tr><td>IgG anticonejo de cabra, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG anti-ratón de cabra, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anticuerpo IgG/HRP anti-conejo de cabra</td><td>APExBIO</td><td>bs-0295G-HRP</td><td></td></tr><tr><td>Reemplazo de suero knockout</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix</td><td>Takara</td><td>RR063A</td> Progesterona <td></td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>57-83-0</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley rat&nbsp;</td><td>Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>BioLegend</td><td>323047</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>TB Green Fast qPCR Mix</td><td>Takara</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>TriZOL</td><td>Invitrogen</td><td>15596026CN</td><td>Extracción de ARN</td></tr><tr><td>u-Slide placas de 8 pocillos</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TargetMol</td><td>146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td><cebadores fuertes>qPCR de genes diana&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genes</td><td>Company</td><td>Sequences</td><td></td></tr><tr><td>rata GAPDH F</td><td>Sangon biotech</td><td>GACATGCCGCCTGGAGAAAC</td><td></td></tr><tr><td>rata GAPDH R</td><td>Sangon biotech</td><td>AGCCCAGGATGCCCTTTAGT rata</td><td></td></tr><tr><td>Nanog F</td><td>Sangon biotech</td><td>GACTAGCAACGGCCTGACTCA</td><td></td></tr><tr><td>rata Nanog R&nbsp;</td><td>Sangon biotech</td><td>CTGCAATGGATGCTGGGATA rata</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 F</td><td>Sangon biotech</td><td>ATTACCCGCAGCAAAATGAC</td><td></td></tr><tr><td>rata Sox2 R</td><td>Sangon biotech</td><td>ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT</td><td></td></tr><tr><td>rat Oct4 F</td><td>Sangon biotech</td><td>CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA rata</td><td></td></tr><tr><td>Oct4 R</td><td>Sangon biotech</td><td>ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG</td><td></td></tr></tbody></table>

generación y caracterización de organoides de útero de rata a partir de células madre epiteliales endometriales de rata

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

Las reESCs y los organoides del útero de rata se establecieron a partir de seis ratas hembras Sprague-Dawley con un peso de entre 200 g y 250 g siguiendo el protocolo descrito en la Figura 1. Basándose en el éxito del cultivo a largo plazo de células madre epiteliales endometriales humanas, la formulación de REEM consistió principalmente en Y27632, A8301 y CHIR99021. Para estabilizar las reESCs in vitro, inicialmente aislamos células endometriales de endometrio de rata utilizando técnicas enzimáticas y mecánicas. El análisis de citometría de flujo en la Figura 2A reveló que las células endometriales primarias comprendían aproximadamente un 50% de células epiteliales que expresaban CD9 (49,8%), con niveles bajos de EpCAM (4,49%) y CD24 (2,64%). El marcador SSEA-1 para las reESC estuvo presente en un 6,58%, mientras que los marcadores endoteliales CD31 (30,9%) y CD45 (70,3%) fueron relativamente altos.
Sin embargo, el cultivo en REEM dio como resultado que las reESC P1 mostraran una morfología uniforme en espiral o poliédrica y formaran estructuras clonales compactas (Figura 2D). La eliminación gradual de factores individuales de REEM condujo a una disminución correspondiente en la capacidad proliferativa de las reESC. El ensayo de formación de clones destacó el papel crítico de Y27632 en el cultivo estable de reESC (Figura 2B, C). En el tercer pasaje, las reESCs exhibieron una expresión consistente de SSEA-1 y citoqueratina, lo que indica una expansión exitosa de las reESCs primarias durante el cultivo (Figura 2F). Además, las reESCs mantuvieron una capacidad proliferativa robusta y estable incluso en los últimos pasos (Figura 2E), lo que demuestra su exitoso aislamiento y expansión en el sistema REEM actual.
Los cultivos de organoides se establecieron siguiendo un sistema previamente reportado derivado de células madre endometriales humanas8. En 3 días, las reESCs exhibieron una rápida autoorganización en estructuras similares a organoides con un centro hueco, que posteriormente aumentaron en tamaño y grosor (ver Figura 3A). En la Figura 3B se presentan los resultados típicos de la tinción de HE que ilustran la formación de organoides por reESCs. Estos cultivos de organoides pueden sostenerse a través del paso, como lo demuestra la alta viabilidad celular indicada por la tinción con Ki67 después de los ciclos de paso directo y congelación-descongelación. Además, se realizó la tinción de HE en la 10ª generación de organoides, y los resultados mostraron que la estructura del organoide podía mantenerse intacta (véase la Figura 3E). Además, los resultados de la qPCR indicaron que Nanog, Sox2 y Oct4 se expresaron a niveles comparables a los de la generación P1 (Figura 3F). Este hallazgo sugiere el potencial para el cultivo a largo plazo de organoides dentro del sistema actual.
Nuestro estudio llevó a cabo una investigación preliminar sobre la respuesta de las estructuras similares al útero de rata a E2 y P4. La tinción de inmunofluorescencia en la Figura 4A reveló la presencia de receptores de estrógeno y progesterona. Después de la suplementación conE2 , estos organoides experimentaron una transición de una forma esférica hueca a un patrón de crecimiento interno más densamente poblado (Figura 4C). La exposición posterior a P4 condujo a una disminución de la permeabilidad de las estructuras densas, lo que finalmente resultó en su desintegración (Figura 4B). Estos hallazgos sugieren que E2 potencialmente impulsa una mayor diferenciación de estructuras similares al útero de rata, mientras que P4 puede desencadenar vías apoptóticas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Procedimientos utilizados para establecer células madre epiteliales endometriales de rata y organoides de útero de rata. Abreviatura: SD = Sprague-Dawley. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Generación y cultivo a largo plazo de células madre epiteliales endometriales de rata in vitro. (A) Análisis de citometría de flujo que muestra la proporción de células positivas en el endometrio de rata. (B) Tinción violeta cristalina de clones en REEM con o sin A8301, Y27632 o CHIR99021, respectivamente. Barras de escala = 1 cm. (C) Los números de clonación en REEM con o sin factores. Las barras de error representan la desviación estándar; n = 3 donantes (***, p&lt;0,001). (D) Imágenes de microscopía óptica de células madre epiteliales endometriales de rata P1 con y sin tinción de violeta cristalino. (E) Análisis CCK-8 de células madre epiteliales endometriales de rata en el pasaje 1, el pasaje 7 y el pasaje 14. Las barras de error representan la desviación estándar, n = 3. (F) Análisis de inmunofluorescencia que demuestren la expresión de citoqueratina y SSEA-1. Abreviatura: REEM = medio de expansión reESCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Generación y cultivo a largo plazo de organoides endometriales de rata in vitro. (A) Imágenes de microscopía óptica de organoides endometriales de rata P1. (B) Tinción de H&amp;E para organoides P1 de células madre epiteliales endometriales de rata. (C) Análisis de inmunofluorescencia que demuestren la expresión de citoqueratina y SSEA-1. (D) Análisis de inmunofluorescencia que demuestren la expresión de Ki67 y SSEA-1. (E) Tinción de H&amp;E para organoides de rata P 10. (F) Análisis de qPCR para la expresión de Nanog, Sox2 y Oct-4 en organoides endometriales de rata P1 y P10. Expresión normalizada a GAPDH (n = 3, prueba t desapareada de dos colas, n.s. = no significativa). Abreviatura: H&amp;E = hematoxilina y eosina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig04.jpg"> 
Figura 4: Cultivo secuencial de organoides conE2 y P4. (A) Análisis de inmunofluorescencia que demuestran la expresión del receptor de estrógeno, el receptor de progestágeno y SSEA-1. (B) Descripción general de las imágenes de microscopía óptica de organoides de rata cultivados en E2 y P4. (C) Las imágenes de microscopía óptica demuestran la transformación de una esfera hueca en densa dentro de la cavidad interna de los organoides después de ser cultivados 7 días en E2. Abreviaturas: ER = receptor de estrógeno; PR = receptor de progestágeno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Generación y caracterización de organoides de útero de rata a partir de células madre epiteliales endometriales de rata

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Aprende a generar organoides de útero de rata a partir de células madre epiteliales endometriales. Este protocolo reproducible facilita el estudio de enfermedades endometriales y aplicaciones en edición génica.

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