Name: Modelo quirúrgico para tubos uroteliales de ingeniería tisular de una sola etapa en minicerdos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 5 s
Description: Aprenda a crear tubos uroteliales de ingeniería tisular en minicerdos Gottingen mediante un procedimiento quirúrgico de una sola etapa con microinjertos autólogos. Este método simplifica la derivación urinaria.

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Los autores desean agradecer al personal del Departamento de Medicina Experimental (AEM) de la Universidad de Copenhague por su ayuda en la planificación y realización de cirugías y cría de animales, y a ELLA-CS, s.r.o, Hradec Kralove, República Checa, por proporcionar los stents biodegradables personalizados utilizados en el estudio. La Sociedad Sueca de Investigación Médica, la Fundación Promobilia, la Fundación Rydbeck, la Fundación Samariten, la Fundación para la Atención de la Salud Pediátrica, la Fundación Frimurare Barnhuset de Estocolmo y la Fundación Novo Nordisk (NNFSA170030576).

Este experimento se llevó a cabo en una instalación experimental acreditada por la AAALAC de acuerdo con la legislación europea sobre el uso de animales en el laboratorio y tras el permiso ético concedido por el Ministerio de Alimentación y Agricultura danés (Ref. nº 2022-15-0201-01206).
1. Procedimiento quirúrgico
<ol><li>Preparación animal<ol><li>Ayunar una hembra adulta de un minicerdo de Gotinga durante al menos 12 h antes de la operación.</li>
		<li>Prepare la mesa quirúrgica con todos los utensilios estériles como se describe a continuación.</li>
		<li>En el caso de minicerdos adultos de tamaño estándar, sedar al animal mediante inyección intramuscular con 1,0-1,4 ml/10 kg con una solución de 125 mg de zolazepam y 125 mg de tiletamina suspendida en 1,25 ml de ketamina (100 mg/ml), 6,25 ml de xilacina (20 mg/ml), 1,25 ml de metadona (10 mg/ml) y 2 ml de butorfanol (10 mg/ml) (más adelante denominada mezcla de sedación).</li>
		<li>Realizar intubación endotraqueal guiada visualmente. Confirmar la anestesia mediante signos vitales y pruebas de reflejos oculares e interdigitales. Aplicar la pomada oftálmica bilateralmente.</li>
		<li>Instalar catéteres auditivos bilaterales y mantener la anestesia con propofol (10-15 mg/kg/h) y fentanilo (5-15 mg/kg/h).</li>
		<li>Inserte un catéter urinario de 8 Fr y llene la vejiga con 250 mL de solución salina isotónica fisiológicamente templada utilizando una jeringa Luer Lock del tamaño adecuado.</li>
		<li>Coloque al cerdo en posición supina, luego rasee y frote el abdomen. Después de dos rondas más de limpieza de la piel con etanol al 70%, enmarque el campo quirúrgico con un paño estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Recolección de tejidos e implantación de andamios quirúrgicos<ol><li>Realizar una laparotomía estándar de la línea media inferior con bisturí y cauterización, dividiendo la piel, el músculo y el peritoneo, y tirar de la vejiga urinaria intraperitoneal hasta la herida.</li>
		<li>Realizar hemostasia profiláctica en la pared anterior de la vejiga y extirpar un segmento de pared completa de 2cm2 , dejando una abertura proximal de 1cm2 mientras se cierra la pared vesical restante con una sutura trenzada de reabsorción rápida.</li>
		<li>Diseccionar cuidadosamente la capa mucosa de la muestra resecada y picar una muestra de mucosa de 2cm2 en microinjertos de 1mm2 para la inclusión en el andamio (descrito a continuación en la sección 2).</li>
		<li>Después de completar el andamio, anastomése la construcción tubular a la abertura restante en la pared anterior de la vejiga con una sutura de monofilamento de reabsorción lenta.</li>
		<li>Utilice un colgajo peritoneal del ligamento pubovesical para parchear el andamio tubular y coloque un tapón de enema de colon anterógrado (ECA) intraluminal de 14 Fr en el andamio tubular.</li>
		<li>Limine el extremo distal del conducto con una sutura de monofilamento 4-0 de reabsorción lenta para evitar que la orina se escape, e inyecte un total de 250 ml de solución salina estéril con jeringas a través del catéter vesical para confirmar la permeabilidad anastomótica.</li>
		<li>Diseccionar sin rodeos un canal transfascial lateralmente a la línea media, 2-3 cm caudalmente a la glándula mamaria caudal en el lado derecho, y colocar el conducto en un bolsillo subcutáneo. Fijar el conducto distal con dos suturas transcutáneas de monofilamento no reabsorbibles para marcar la localización a nivel de la piel.</li>
		<li>Cierre la fascia muscular anterior del músculo abdominal con una sutura de monofilamento reabsorbible lentamente, adapte el subcutis con una sutura de carrera trenzada de reabsorción rápida y cierre la piel con una sutura de carrera de monofilamento no reabsorbible.</li>
		<li>Después de suspender la anestesia, extubar al animal y obsérvalo en los establos hasta que esté completamente ambulante y pueda beber y comer de manera segura.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Construcción de andamios
<ol><li>Preparación del andamio compuesto<ol><li>Antes de la cirugía (máximo 2 h), preparar una solución líquida de colágeno cola de rata tipo I como se ha descrito anteriormente17. En resumen, agregue 4:1 de medio esencial mínimo (MEM) 10x a la solución de colágeno y aproxime el pH a 7.4 con 1 M de NaOH, y finalmente agregue 1x MEM, con el objetivo de una concentración final de colágeno de 1.64 mg/mL. Guarde la solución en un vial estéril con hielo hasta su uso posterior.</li>
		<li>Después de la resección quirúrgica del tejido y el picado, coloque manualmente las partículas de mucosa (es decir, microinjertos) en una malla biodegradable de 2 cm x 6 cm con una tasa de expansión de 1:6 (p. ej., un tejido mucoso de 2cm2 se expande a una malla de 12cm2 ) con pinzas.</li>
		<li>Prepare un molde de acero rectangular estéril de 1 cm x 3 cm x 6 cm (alto x ancho x largo) encima de una placa de acero estéril y coloque la malla en el molde de acero con los microinjertos hacia arriba. Vierta suavemente 20 ml de la solución de colágeno en el molde, asegurándose de no enjuagar los microinjertos de la malla. Transfiera todo el producto a una cámara de calentamiento estéril a 38 °C y déjelo solidificar durante cinco minutos.</li>
		<li>Después de una solidificación suficiente, deslice el hidrogel sobre una malla de nailon que descansa sobre una placa de acero perforada y retire suavemente el molde.</li>
		<li>Expulse el agua del hidrogel colocando una malla de nailon y luego una placa de acero encima del gel, y luego comprima pasivamente con un peso de 120 g (en este caso equivalente al molde de acero utilizado para la incrustación) colocado encima de la placa de acero durante 5 min.</li>
		<li>Después de la compresión, enrolle el andamio aplanado alrededor de un stent biodegradable, microinjertos frente al stent, que mida 5 cm x 0,6 cm (largo x diámetro interior), y suture el andamio en su lugar longitudinalmente con una sutura de monofilamento de reabsorción lenta. El conducto terminado ya está listo para la implantación quirúrgica.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Manejo postoperatorio
<ol><li>Analgesia y profilaxis antibiótica<ol><li>Administrar buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg/8 h por vía intravenosa) durante los 3 primeros días, meloxicam (0,4 mg/kg/día por vía intramuscular u oral) durante los 4 primeros días, y trimetoprima (2,7 mg/kg/día por vía intramuscular o 4,2 mg/kg/día por vía oral) y sulfadoxina (13,3 mg/kg/día por vía intramuscular o 20,8 mg/kg/día por vía oral) durante los primeros 5 días. Administrar las inyecciones intramusculares en el postoperatorio mientras el animal aún está anestesiado.</li>
		<li>Alojar a los animales en un solo lugar para evitar el mordisqueo de los catéteres venosos externos y el material de sutura. Proporcionar contacto visual con los minicerdos vecinos a través de ventanas de plexiglás y la posibilidad de contacto con el hocico entre los corrales. Proporcionar diariamente paja y heno frescos, así como juguetes y suministro de agua ad libitum y alimento dos veces al día.</li>
		<li>Monitoree a los animales diariamente para determinar el comportamiento natural, los hábitos alimenticios, la producción de orina y heces, y evalúe el peso corporal semanalmente.</li>
		<li>Al final del período de observación (6 semanas), sedar a los animales con una inyección intramuscular de 1-1,4 mL/10 kg de mezcla de sedación y terminar el animal con una inyección letal de pentobarbital (100 mg/kg por vía intravenosa).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Evaluaciones post mortem
<ol><li>Anatomía macroscópica<ol><li>Después de la terminación, diseccione el conducto distal a nivel de la piel y retire el tapón ACE. Cierre la uretra con una pinza de plástico e inyecte 250 ml de una solución de contraste 1:20 de iohexol en solución salina isotónica a través de la abertura del conducto distal utilizando un catéter.</li>
		<li>Evalúe al animal con un escáner de tomografía computarizada de 64 cortes. Visualice imágenes mediante la reconstrucción multiplanar y analice todas las imágenes mediante software de procesamiento de imágenes médicas.</li>
		<li>Realizar un examen endoscópico de la vejiga y del conducto luminoso con un cistoscopio flexible de 16,2 Fr a través de la uretra nativa.</li>
		<li>Reseque el conducto en bloque mientras evalúa cuidadosamente cualquier hallazgo anatómico macroscópico. Además, resecar biopsias vesicales de pared completa con un margen de 2 cm hasta la anastomosis del conducto y procesar de manera similar para obtener valores de referencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Procesamiento histológico<ol><li>Fijar la muestra extirpada en formol al 10% durante 24 h.</li>
		<li>Divida el conducto ortogonalmente con un bisturí en secciones separadas de igual tamaño de segmentos de conducto proximal, medial y distal. Deshidratar las muestras con concentraciones crecientes de etanol e incrustarlas en parafina antes del corte del micrótomo.</li>
		<li>Teñir secciones de 5 μm con hematoxilina y eosina (H&E) y pancitoqueratina CK-AE y explorar con un escáner digital de histología digital.</li>
	</ol></li>
</ol>

Acceso al andamio de colágeno para la cirugía de derivación urinaria de una sola etapa en cerdos

<ol><li>Surer, I., Ferrer, F. A., Baker, L. A., Gearhart, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continent+urinary+diversion+and+the+exstrophy-epispadias+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Continent urinary diversion and the exstrophy-epispadias complex.</a> J Urol. 169 (3), 1102-1105 (2003).</li>
<li>Cranidis, A., Nestoridis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Urogynecol+J+Pelvic+Floor+Dysfunct%22%5BJournal%5D)">Bladder augmentation.</a> Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 11 (1), 33-40 (2000).</li>
<li>Atala, A., Bauer, S. B., Hendren, W. H., Retik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+gastric+augmentation+on+bladder+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">The effect of gastric augmentation on bladder function.</a> J Urol. 149 (5), 1099-1102 (1993).</li>
<li>Husmann, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+following+augmentation+cystoplasty%3A+A+transitional+urologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Urol%22%5BJournal%5D)">Mortality following augmentation cystoplasty: A transitional urologist's viewpoint.</a> J Pediatr Urol. 13 (4), 358-364 (2017).</li>
<li>Mitrofanoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-appendicular+continent+cystostomy+in+the+management+of+the+neurogenic+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Chir+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Trans-appendicular continent cystostomy in the management of the neurogenic bladder.</a> Chir Pediatr. 21 (4), 297-305 (1980).</li>
<li>Leslie, B., Lorenzo, A. J., Moore, K., Farhat, W. A., Bägli, D. J., Pippi Salle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+followup+and+time+to+event+outcome+analysis+of+continent+catheterizable+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Long-term followup and time to event outcome analysis of continent catheterizable channels.</a> J Urol. 185 (6), 2298-2302 (2011).</li>
<li>Horst, M., Eberli, D., Gobet, R., Salemi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+in+pediatric+bladder+reconstruction-The+road+to+success%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering in pediatric bladder reconstruction-The road to success.</a> Front Pediatr. 7, 91(2019).</li>
<li>Ajalloueian, F., Lemon, G., Hilborn, J., Chronakis, I. S., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+biomechanics+and+the+use+of+scaffolds+for+regenerative+medicine+in+the+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Uro%22%5BJournal%5D)">Bladder biomechanics and the use of scaffolds for regenerative medicine in the urinary bladder.</a> Nat Rev Uro. 15 (3), 155-174 (2018).</li>
<li>Dorin, R. P., Pohl, H. G., De Filippo, R. E., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubularized+urethral+replacement+with+unseeded+matrices%3A+what+is+the+maximum+distance+for+normal+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Uro%22%5BJournal%5D)">Tubularized urethral replacement with unseeded matrices: what is the maximum distance for normal tissue regeneration.</a> World J Uro. 26 (4), 323-326 (2008).</li>
<li>El Kassaby, A. W., AbouShwareb, T., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+comparative+study+between+buccal+mucosal+and+acellular+bladder+matrix+grafts+in+complex+anterior+urethral+strictures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Randomized comparative study between buccal mucosal and acellular bladder matrix grafts in complex anterior urethral strictures.</a> J Urol. 179 (4), 1432-1436 (2008).</li>
<li>Casarin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+small+intestinal+submucosa+%28SIS%29+as+a+suitable+scaffold+for+the+creation+of+a+tissue-engineered+urinary+conduit%3A+Decellularization%2C+biomechanical+and+biocompatibility+characterization+using+new+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Porcine small intestinal submucosa (SIS) as a suitable scaffold for the creation of a tissue-engineered urinary conduit: Decellularization, biomechanical and biocompatibility characterization using new approaches.</a> Int J Mol Sci. 23 (5), 2826(2022).</li>
<li>Casarin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+hybrid+membrane+for+urinary+conduit+substitutes+based+on+small+intestinal+submucosa+coupled+with+two+synthetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">A novel hybrid membrane for urinary conduit substitutes based on small intestinal submucosa coupled with two synthetic polymers.</a> J Funct Biomater. 13 (4), 222(2022).</li>
<li>Drewa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+artificial+conduit+for+urinary+diversion+in+rats%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">The artificial conduit for urinary diversion in rats: a preliminary study.</a> Transplant Proc. 39 (5), 1647-1651 (2007).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+tubular+graft+for+urinary+diversion+after+radical+cystectomy+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered tubular graft for urinary diversion after radical cystectomy in rabbits.</a> J Surg Res. 182 (2), 185-191 (2013).</li>
<li>Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. I., Nordenskjöld, A., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologous+minced+bladder+mucosa+for+a+one-step+reconstruction+of+a+tissue+engineered+bladder+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit.</a> Biomed Res Int. 2013, 212734(2013).</li>
<li>Ajalloueian, F., Nikogeorgos, N., Ajalloueian, A., Fossum, M., Lee, S., Chronakis, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compressed+collagen+constructs+with+optimized+mechanical+properties+and+cell+interactions+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Compressed collagen constructs with optimized mechanical properties and cell interactions for tissue engineering applications.</a> Int J Biol Macromol. 108, 158-166 (2018).</li>
<li>Chamorro, C. I., Zeiai, S., Engberg, G. R., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minced+tissue+in+compressed+collagen%3A+A+cell-containing+biotransplant+for+single-staged+reconstructive+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Minced tissue in compressed collagen: A cell-containing biotransplant for single-staged reconstructive repair.</a> J Vis Exp. (108), e53061(2016).</li>
<li>Juul, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+cellular+behavior+and+micromolecular+communication+in+urothelial+micrografts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Insights into cellular behavior and micromolecular communication in urothelial micrografts.</a> Sci Rep. 13 (1), 13589(2023).</li>
<li>Reinfeldt Engberg, G., Chamorro, C. I., Nordenskjöld, A., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+submucosal+bladder+wall+tissue+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Expansion of submucosal bladder wall tissue in vitro and in vivo.</a> Biomed Res Int. 2016, 5415012(2016).</li>
<li>Juul, N., Ajalloueian, F., Willacy, O., Chamorro, C. I., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+autologous+urothelial+micrografting+and+composite+tubular+grafts+for+future+single-staged+urogenital+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Advancing autologous urothelial micrografting and composite tubular grafts for future single-staged urogenital reconstructions.</a> Sci Rep. 13 (1), 15584(2023).</li>
<li>Willacy, O., Juul, N., Taouzlak, L., Chamorro, C. I., Ajallouiean, F., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perioperative+layered+autologous+tissue+expansion+graft+for+hollow+organ+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">A perioperative layered autologous tissue expansion graft for hollow organ repair.</a> Heliyon. 10 (3), e25275(2024).</li>
<li>Chamorro, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+concept+of+in+vivo+guided+tissue+engineering+by+a+single-stage+surgical+procedure+in+a+rodent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploring the concept of in vivo guided tissue engineering by a single-stage surgical procedure in a rodent model.</a> Int J Mol Sci. 23 (20), 12703(2022).</li>
<li>Casarin, M., Morlacco, A., Dal Moro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+substitution%3A+The+role+of+tissue+engineering+and+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Process%22%5BJournal%5D)">Bladder substitution: The role of tissue engineering and biomaterials.</a> Process. 9 (9), 1643(2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Este protocolo presenta una técnica sencilla y accesible para futuras cirugías reconstructivas. Un inconveniente común en la ingeniería de tejidos, incluida la expansión celular autóloga, son los costosos y sustanciales pasos preliminares necesarios antes de la implantación quirúrgica. El microinjerto autólogo puede simplificar muchos de estos pasos y potencialmente permitir procedimientos en una sola etapa. Mediante el autotrasplante de entidades histológicas complejas, se induce la señalización paracrina pro-regenerativa18. En estudios previos, experimentamos que los microinjertos solos son vulnerables a los ambientes físicos a menos que se unan adecuadamente a un andamio15,19. El colágeno ha sido estudiado como un entorno viable para la expansión tisular in vitro y fue elegido para nuestro propósito debido a su biocompatibilidad favorable y disponibilidad comercial. El andamio compuesto presentado aquí ha sido previamente optimizado durante experimentos in vitro que evaluaron variaciones en la inclusión de microinjertos y concentraciones de colágeno 20,21,22. Antes de las pruebas in vivo, se han evaluado in vitro las propiedades del andamio en cuanto a permeabilidad, biomecánica y degradación. Además, la expansión tisular in vivo basada en andamios fue validada previamente en modelos de roedores y conejos21,22.
Se eligió el modelo quirúrgico para evaluar una versión tubular del andamio, que imita el contexto clínico de una derivación urinaria para la disfunción neurógena de la vejiga en pacientes pediátricos o adolescentes. Los pasos críticos incluyen la disección exacta de los microinjertos de mucosa y el mantenimiento de un ambiente húmedo desde el momento de la resección hasta la inclusión del andamio. Otro paso crítico incluye la solidificación adecuada del hidrogel; El pipeteo cuidadoso del colágeno garantiza que no se formen burbujas de aire dentro del gel, y los ajustes de temperatura correctos y las soluciones de componentes garantizan que el gel se solidifique correctamente. Si no se obtiene un gel solidificado, aumentará el riesgo de delaminación del colágeno y desprendimiento del microinjerto. Para la parte quirúrgica, el manejo cuidadoso durante la implantación es crucial para evitar dañar los microinjertos debido a un traumatismo mecánico o disociación. Antes de cerrar el abdomen, la permeabilidad del líquido debe tratarse cuidadosamente insuflando la vejiga con líquidos.
Las limitaciones de la técnica incluyen el grosor del andamio, que intuitivamente tiene límites superiores en cuanto a la difusión de nutrientes desde el entorno externo a los microinjertos. Por otro lado, una reducción en el grosor del andamio puede conducir a una permeabilidad inapropiadamente alta y fugas de orina. Nuestra composición actual se basa en evaluaciones in vitro previas, donde se comparó la regeneración celular en diferentes concentraciones de colágeno20. El microinjerto de tejidos autólogos también se basa en tejido de injerto sano, lo que hace que el procedimiento actual no sea adecuado para enfermedades malignas en las que no se puede descartar adecuadamente el riesgo de retrasplante canceroso23; Sin embargo, la técnica actual fue diseñada para casos con discapacidad funcional miccional donde esto no se considera un riesgo. Aunque el modelo imita varios pasos del entorno clínico (es decir, el procedimiento de apendicovesicostomía), este experimento no utiliza un estoma completamente funcional para la derivación urinaria, ya que el conducto está ligado distalmente. Además, dado que las complicaciones clínicas pueden ocurrir durante toda la vida, un período de observación de 6 semanas puede proporcionar un conocimiento limitado sobre los resultados específicos de las estenosis y la continencia. Por lo tanto, se podría agregar un seguimiento adicional de 6 meses al estudio después de anastomosar el conducto cicatrizado al nivel de la piel.
La perspectiva de esta técnica se relaciona con el diseño simple, que permite aplicaciones universales en caso de que el biomaterial de soporte y origen de tejido del microinjerto sea reemplazado por otras alternativas relevantes. Estos componentes pueden modificarse para adaptarse a fines específicos de órganos relacionados con la resistencia, la elasticidad y la biodegradación del andamio. Por último, los costos accesibles y de bajo costo permiten la reproducibilidad y una traducción ampliada de la técnica.

En las malformaciones urogenitales, la cirugía reconstructiva puede ser necesaria para restaurar la anatomía funcional, a menudo por indicación vital 1,2. Los enfoques quirúrgicos convencionales han utilizado tejidos nativos de otros sistemas de órganos (como el tracto gastrointestinal) para reconstruir los órganos malformados o faltantes; sin embargo, a menudo con el riesgo de complicaciones postoperatorias graves 3,4. En el caso de la derivación urinaria para pacientes con disfunción vesical neurogénica que necesitan cateterismo a largo plazo, el apéndice o los segmentos del intestino delgado readaptados se utilizan a menudo para construir un conducto urinario 5,6. La ingeniería de tejidos ofrece una alternativa de injerto de tejido que se puede adaptar para cumplir con las características específicas de los órganos, minimizando así la morbilidad postoperatoria de los pacientes 7,8. Mientras que los andamios de varios tipos pueden implantarse por sí solos, se ha demostrado que la celularización adicional de los andamios, preferiblemente con células autólogas, mejora los resultados regenerativos después de la implantación 9,10,11,12,13,14. Sin embargo, los andamios de ingeniería tisular suelen estar compuestos por componentes complejos y costosos y, en segundo lugar, los requisitos para el cultivo de células ex vivo y la siembra de andamios son laboriosos y requieren muchos recursos. Estos factores han dificultado la traslación clínica de los andamios de ingeniería tisular a pesar de varias décadas de investigación en el área. Al reducir la complejidad, así como los requisitos monetarios y materialistas, los andamios de ingeniería tisular podrían implementarse en la cirugía moderna a gran escala, abordando tanto procedimientos raros como más comunes.
El colágeno se ha establecido previamente como una plataforma viable para la expansión celular y, además, actúa como un bioadhesivo favorable cuando se adhieren células o tejidos a un andamio para la implantación quirúrgica 15,16,17. El microinjerto autólogo perioperatorio evita la necesidad de cultivo celular ex vivo al recolectar el tejido de interés durante el procedimiento primario y reimplantarlo directamente. Al picar el tejido resecado en partículas más pequeñas, se aumenta el área superficial y el potencial de crecimiento, lo que permite una mayor relación de expansión en el andamio18. El andamio a base de colágeno no se adhiere específicamente a las reconstrucciones urogenitales, pero teóricamente puede aplicarse a múltiples áreas de reconstrucción de órganos huecos.
En este manuscrito presentamos un protocolo para la construcción de un andamio tubular, combinando colágeno con microinjertos uroteliales autólogos embebidos, y un modelo de minipig que evalúa la viabilidad técnica y la seguridad, así como el rendimiento regenerativo, del andamio in vivo. El modelo se evaluó en 10 minicerdos hembras adultas utilizando el protocolo y el método presentados aquí. La principal ventaja del andamio es la simplicidad de la construcción y la implantación en una sola etapa, lo que evita al paciente varios procedimientos quirúrgicos posteriores. El procedimiento puede ser realizado en entornos quirúrgicos convencionales por personal quirúrgico regular y requiere equipo y materiales estándar. El modelo animal permite un entorno controlado para estudiar la implantación mientras el animal vuelve rápidamente a su comportamiento normal, con la posibilidad añadida de implementar variaciones en el andamio y el procedimiento.

<table><tbody><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>2517592</td><td>Preparación de colágeno</td></tr><tr><td>1x MEM</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.</td><td>2508924</td><td>Preparación de colágeno</td></tr><tr><td>Ambu aScope 4 Cysto</td><td>Ambu A/S, Ballerup, DK</td><td></td><td>1000682507 Cistoscopio</td></tr><tr><td>Aquaflush ACE Tapón</td><td>Abena, Taastrup, DK</td><td>ACE12/220501</td><td>ACE</td></tr><tr><td>Borgal vet inj opl 200 + 40 mg/mL</td><td>Ceva Animal Health A/S</td><td>510460</td><td>Sulfonamida/Trimetoprima</td></tr><tr><td>Bupaq multidosis veterinaria 0,3 mg/mL</td><td>Salfarm Danmark A/S, DK</td><td></td> 502763 <td>Buprenorfina</td></tr><tr><td>Butomidor vet inj 10 mg/mL</td><td>Salfarm Danmark A/S, DK</td><td></td> 531943 <td>Buthorphanol</td></tr><tr><td>Comfortan vet inj 10 mg/mL</td><td>Dechra Veterinary Products A/S, DK</td><td></td> 492312 <td>Metadone</td></tr><tr><td>Sutura Ethilon 3-0</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, EE. UU.</td><td>SGBCXV</td><td>Monofilamento no reabsorbible</td></tr><tr><td>Fentanilo inj 50 y micro; g/mL(hamel)</td><td>Hameln Pharma ApS, DK</td><td>432520</td><td>Fentanilo</td></tr><tr><td>Ketador vet inj 100 mg/mL</td><td>Salfarm Danmark A/S, DK</td><td></td> 115727 <td>Ketamina</td></tr><tr><td>Metacam inj 20 mg/mL t.bovino/cerdo/caballo</td><td>Boehringer Ingelheim Animal, DE</td><td>6443</td><td>Meloxcicam</td></tr><tr><td>Metacam suspensión oral 15 mg/mL cerdos</td><td>Boehringer Ingelheim Animal, DE</td><td>482780</td><td>Meloxcicam</td></tr><tr><td>Omnipaque</td><td>GF Healthcare, Oslo, NO</td><td>16173849</td><td>Contraste para CT</td></tr><tr><td>Pancitoqueratina CK-AE</td><td>DAKO Agilent, EE. UU</td>. <td>GA053</td><td>Clon AE1/AE3</td></tr><tr><td>Sutura PDS 3-0</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, EE. UU.</td><td>SEMMTQ</td><td>Sutura de Prolene monofilamento de reabsorción lenta</td></tr><tr><td>4-0</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, EE. UU.</td><td>PGH187</td><td>Monofilamento no reabsorbible</td></tr><tr><td>Propoliplípido t.inj/inf 10 mg/mL</td><td>Fresenius Kabi, DK</td><td>21636</td><td>Propofol</td></tr><tr><td>Colágeno de cola de rata tipo I</td><td>First Link Ltd, Wolverhampton, Reino Unido</td><td>60-30-810</td><td>2,06 mg/mL de proteína en ácido acético al 0,6%</td></tr><tr><td>Suprim vet&nbsp; 20 + 100 mg (Solución para uso en agua potable)</td><td>Dechra Veterinary Products A/S, DK</td><td>33661</td><td>Sulbonamida/Trimetoprima</td></tr><tr><td>SX-ELLA Biliar degradable stent DV</td><td>ELLA-CS, Trebes, CZ</td><td>S23000056-01</td><td>&oslash; 6 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Malla Vicryl</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, EE. UU.</td><td>VM1208</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de malla Vicryl 4-0</td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, EE. UU.</td><td>SMBDGDR0</td><td>Traidor de reabsorción rápida</td></tr><tr><td>Xysol vet inj 20 mg/mL</td><td>ScanVet Animal Health A/S, DK</td><td>54899</td><td>Xilacina</td></tr><tr><td>Zoletil 50 vet plv/sol t.inj 25 + 25 mg/mL</td><td>Virbac Danmark A/S, DK</td><td></td> 568527 <td>Tiletamina y Zolazepam</td></tr></tbody></table>

modelo quirúrgico para tubos uroteliales de ingeniería tisular de una sola etapa en minicerdos

Surgical Model for Single-Staged Tissue-Engineered Urothelial Tubes in Minipigs

Las cirugías reconstructivas a menudo se ven desafiadas por la falta de tejido de injerto. En el tratamiento de las malformaciones urogenitales, la solución convencional ha sido la recolección de tejido gastrointestinal para la reconstrucción no ortotópica debido a su abundancia para restablecer la función normal en el paciente. Los resultados clínicos después de reorganizar los tejidos nativos dentro del cuerpo a menudo se asocian con una morbilidad significativa; Por lo tanto, la ingeniería de tejidos tiene un potencial específico dentro de este campo de la cirugía. A pesar de los avances sustanciales, los andamios de ingeniería tisular aún no se han establecido como una alternativa de tratamiento quirúrgico válida, principalmente debido a los costosos y complejos requisitos de materiales, producción e implantación. En este protocolo, presentamos un andamio tubular simple y accesible a base de colágeno incrustado con partículas de tejido autólogo específico de órganos, diseñado como un conducto para el desvío urinario. El andamio se construye durante el procedimiento quirúrgico primario, comprende materiales quirúrgicos comúnmente disponibles y requiere habilidades quirúrgicas convencionales. En segundo lugar, el protocolo describe un modelo animal diseñado para evaluar los resultados in vivo a corto plazo después de la implantación, con la posibilidad de variaciones adicionales al procedimiento. Esta publicación tiene como objetivo demostrar el procedimiento paso a paso, con especial atención al uso de tejido autólogo y una forma tubular.

En este estudio, la expansión del tejido urotelial in vivo se logra en un andamio tubular a base de colágeno. Al incrustar el andamio con partículas de tejido autólogo, recolectadas y procesadas perioperatoriamente, el procedimiento permite la implantación de andamio en una sola etapa sin la necesidad de un tratamiento inmunosupresor concomitante en el postoperatorio. El manejo quirúrgico se posibilita reforzando el andamio con una malla y un stent biodegradables (Figura 1). Después de 6 semanas de observación, la evaluación macroscópica del tejido no reveló signos de rechazo o infección del huésped, y el andamio tubular presenta permeabilidad y sin obstrucciones (Figura 2). A partir de las evaluaciones histológicas, se observa un epitelio luminal estratificado de origen urotelial que cubre la totalidad del andamio, y los restos de los biomateriales de refuerzo aún son visibles después de 6 semanas (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66936/66936fig01.jpg"> Figura 1: Construcción e implantación de andamios. El tejido vesical se disecciona perioperatoriamente (arriba a la izquierda). Los microinjertos de mucosa picada se expanden sobre una malla quirúrgica (arriba en el centro) y se incrustan en colágeno solidificado (arriba a la derecha). Se comprime el colágeno para expulsar agua y se prepara un stent (abajo a la izquierda). El andamio se tubulariza alrededor del stent y se coloca un tapón de ECA dentro del stent (parte inferior central). La vejiga se cierra parcialmente y el constructo se incorpora finalmente a la vejiga en el sitio original de la escisión del tejido (abajo a la derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66936/66936fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66936/66936fig02.jpg"> Figura 2: Evaluación macroscópica del andamio. Después de 6 semanas, el animal es sacrificado y el andamio (flecha) se disecciona a nivel de la piel (arriba a la izquierda). La vejiga se llena con contraste (amarillo) y se realiza una tomografía computarizada para evaluar la permeabilidad y los signos de formación de estenosis (arriba a la derecha) del conducto (flecha). Se realiza una cistoscopia a través de la uretra para evaluar la vejiga y la anastomosis (flecha) después de 6 semanas (abajo a la izquierda). Una vez más, se prueba la permeabilidad del conducto insertando un catéter (flecha) a través de la abertura externa y dentro de la vejiga (abajo a la derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66936/66936fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66936/66936fig03.jpg"> Figura 3: Evaluación microscópica del andamio. Se fija el conducto resecado y se realizan cortes transversales ortogonales para evaluar el conducto en la dirección proximal-distal. Después de 6 semanas, se evalúa la luz del conducto (1) para confirmar la epitelización (parte superior ampliada). Los restos del stent biodegradable (2) y los materiales de malla (fondo ampliado) todavía son visibles en este punto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66936/66936fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los implantes de ingeniería tisular para cirugía reconstructiva rara vez progresan más allá de los ensayos preclínicos debido al laborioso cultivo ex vivo , que incluye componentes de andamios complejos y costosos. Aquí, presentamos un procedimiento de una sola etapa diseñado para la derivación urinaria con un andamio tubular accesible a base de colágeno que contiene microinjertos autólogos.

Modelo quirúrgico para tubos uroteliales de ingeniería tisular de una sola etapa en minicerdos

Reconstructive surgeries are often challenged by a lack of grafting tissue. In the treatment of urogenital malformations, the conventional solution has ...

surgical-model-for-single-staged-tissue-engineered-urothelial-tubes

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Los tumores de vejiga se establecen en las hembras de una forma mínimamente invasiva a través de cateterismo, la cauterización local, y posterior adhesión de las células cancerosas a los sitios de quema.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga murino

La técnica establecida para inocular ortotópico xenoinjertos de cáncer de vejiga invasivos primarios requiere laparotomía y la movilización de la vejiga. Este procedimiento inflige una morbilidad significativa en los ratones, es técnicamente difícil y consume mucho tiempo. Lo tanto, desarrolló una alta precisión, abordaje percutáneo utilizando la guía del ultrasonido.

Mínimamente Invasiva Establecimiento de murino ortotópico xenoinjertos vejiga

El modelo murino de obstrucción ureteral unilateral irreversible (UUO) se presenta junto con el modelo de UUO reversible en el que la obstrucción ureteral se alivia mediante la anastomosis del uréter cortado en la vejiga. Estos modelos permiten el estudio de la inflamación y la cicatrización renal, así como la remodelación de los tejidos.

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Este estudio describe los procedimientos quirúrgicos y técnicas experimentales para realizar cistometría despierta en un ratón que se mueve libremente. Además, proporciona evidencia experimental para apoyar su optimización y estandarización.

Evaluación del procedimiento para realizar cistometría despierta en un modelo de ratón

En el presente protocolo, se desarrolló una inducción de estenosis uretral en ratas Wistar, seguida de una reconstrucción uretral con un injerto de mucosa bucal. Se realizó un uretrograma retrógrado y una evaluación Doppler láser, validando la reconstrucción uretral (después de la formación de estenosis) y la colocación del injerto.

Inducción de estenosis uretral seguida de uretroplastia de injerto de mucosa bucal en un modelo de rata

El presente protocolo describe un modelo reproducible paso a paso de la obstrucción ureteral unilateral.

Un modelo murino inmaduro de obstrucción ureteral unilateral reversible

En este artículo se explica un nuevo modelo animal diseñado para analizar materiales de injerto suburetral. En este modelo, se implanta una cinta de malla a través de una incisión vaginal en ovejas, y los animales se observan durante un período de tres meses. Este modelo es esencial ya que sienta las bases para la investigación experimental sobre injertos.

Una técnica quirúrgica novedosa en un modelo de oveja para la implantación de injerto suburetral

Este estudio propone un modelo preclínico de trasplante ortotópico de corazón en cerdos miniatura Bama, utilizando la técnica biauricular. El modelo es aplicable para la inmunología de trasplantes, la evaluación de fármacos y la optimización de técnicas quirúrgicas, proporcionando soporte para aplicaciones clínicas de trasplante de corazón.

Un modelo preclínico de trasplante ortotópico de corazón en cerdos miniatura Bama mediante técnica biauricular

El procedimiento muestra la metodología de la elastografía por resonancia magnética para supervisar el desenlace de ingeniería de tejido adiposo y las construcciones de ingeniería tisular a través de osteogénicas evaluación no invasiva local de las propiedades mecánicas mediante la elastografía por resonancia magnética microscópica (μMRE).

Metodología elastografía por resonancia magnética para la Evaluación de los tejidos Diseñado crecimiento Construct

Se ha renovado el interés en el desarrollo de válvulas de polímero. Aquí, los objetivos son para demostrar la viabilidad de la modificación de un duplicador de pulso comercial para dar cabida a geometrías tri-prospecto y para definir un protocolo para presentar los datos hidrodinámicos de la válvula de polímero en comparación con los datos de la válvula nativa y protésica recogidos en condiciones casi idénticas.

Protocolo para la evaluación relativa hidrodinámico de Tri-lámina polimérica Válvulas

Aprenda a crear tubos uroteliales de ingeniería tisular en minicerdos Gottingen mediante un procedimiento quirúrgico de una sola etapa con microinjertos autólogos. Este método simplifica la derivación urinaria.

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