Name: Mediciones de microscopía de fuerza atómica de cartílago en extremidades de ajolote intactas y en regeneración (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprende a medir propiedades mecánicas del cartílago en extremidades de ajolote mediante microscopía de fuerza atómica. Este protocolo permite estudiar señales mecánicas en regeneración tisular.

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<meta charset="utf8"></head><body>Caracterización mecánica de la rigidez tisular durante la regeneración de extremidades de ajolote

<ol><li>Mills, L. A., Aitken, S. A., Simpson, A. H. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+non-union+per+fracture%3A+current+myths+and+revised+figures+from+a+population+of+over+4+million+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Orthop%22%5BJournal%5D)">The risk of non-union per fracture: current myths and revised figures from a population of over 4 million adults.</a> Acta Orthop. 88 (4), 434-439 (2017).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Affinity Designer</td><td>Affinity</td><td>&nbsp; versión 1.10.4</td><td>Para el montaje de figuras</td></tr><tr><td>Agarosa Low Melt</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td>Para la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Para teñir tejido</td></tr><tr><td>Axiozoom</td><td>Zeiss</td><td>Ir a la</td><td></td> muestra de imágenes bajo el AFM</tr><tr><td>Benzocaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Para anestesiar a los animales</td></tr><tr><td>Butorfanol (+)-tartrato sal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; B9156</td><td>Como analgésico</td></tr><tr><td>Cantilever</td><td>NanoWorld</td><td>Arrow TL1</td><td>Para mediciones de indentación AFM</td></tr><tr><td>Configuración Cellhesion 200 equipada con una etapa motorizada</td><td>JPK/Bruker</td><td></td><td>Para mediciones de indentación AFM</td></tr><tr><td>Entrada</td><td></td><td></td> CellSense <td>Para imágenes en estereoscopio Olympus UC90</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS, 1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Para limpiar muestras y secciones bajo vibratomo</td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ2)</td><td>https://imagej.net/software/fiji</td><td>versión 2.9.0/1.53t</td><td>Para el procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Prisma GraphPad</td><td>Software GraphPad</td><td>(versión 8.4.3)</td><td>Para graficar y analizar estadísticamente los datos</td></tr><tr><td>FBS inactivado por calor</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Para célula medio de cultivo</td></tr><tr><td>Pegamento de histoacrílico (2-butil-cianoacrilato)</td><td>Braun</td><td></td><td>Para pegar la muestra a las placas de Petri</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>Para teñir tejido</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>Para medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Microscopio confocal invertido</td><td>Zeiss</td><td>780 LSM</td><td>Para obtener imágenes de secciones</td></tr><tr><td>de tejido Microscopio confocal invertido</td><td>Zeiss</td><td>980 LSM</td><td>Para obtener imágenes de secciones de tejido</td></tr><tr><td>JPK/Bruker software de procesamiento de datos</td><td>JPK/Bruker</td><td>SPM 6.4</td><td>Para analizar curvas de fuerza-distancia</td></tr><tr><td>Medio L15 (Leibovitz)</td><td>Sigma</td><td>L1518</td><td>Para medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>Para medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Para célula medio de cultivo</td></tr><tr><td>perlas de poliestireno ( 20 &micro; m de diámetro); )</td><td>microParticles</td><td></td><td>Para mediciones de indentación AFM</td></tr><tr><td>Pyjibe</td><td>escrito por Paul M&uuml; ller https://github.com/AFM-analysis/PyJibe</td><td>0.15.0</td><td>Para análisis viscoelástico</td></tr><tr><td>Estereoscopio Olympus SX10</td><td>Olympus</td><td>SX10</td><td>Para amputaciones de extremidades y montaje de tejidos</td></tr><tr><td>Estereoscopio Olympus UC90</td><td>Olympus</td><td>UC90</td><td>Para la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Vibratome Leica Leica</td><td>VT</td><td>1200S</td><td>Para el corte de tejidos</td></tr></tbody></table>

mediciones de microscopía de fuerza atómica de cartílago en extremidades de ajolote intactas y en regeneración

Atomic Force Microscopy Measurements of Cartilage in Intact and Regenerating Axolotl Limbs

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, medimos el módulo de Young aparente de los tejidos cartilaginosos de las extremidades de ajolote en condiciones homeostáticas ("intactas"), durante las etapas tempranas de histólisis del cartílago y posteriores de condensación del cartílago (Figura 1A). También probamos las propiedades mecánicas de los elementos esqueléticos en diferentes regiones, incluyendo su centro y periferia, como se muestra en las imágenes que muestran la posición en voladizo (Figura 1B). Para mostrar la arquitectura del tejido y correlacionarla con las mediciones de rigidez, se fijaron secciones transversales de tejido o el bloque de tejido donde se realizaron las mediciones y se tiñeron para los filamentos y núcleos de actina con Alexa Fluor 488 conjugado con faloidina y Hoechst, respectivamente (Figura 1C). En las extremidades intactas, el radio es claramente mayor que el cúbito, pero ambos elementos esqueléticos cartilaginosos tienen una morfología similar, con núcleos redondos distribuidos uniformemente en el centro, rodeados por un anillo de núcleos aplanados correspondientes al pericondrio24. Durante la fase de histólisis, se detectaron cambios drásticos en la arquitectura de los tejidos, con núcleos desorganizados y menos densamente empaquetados dentro de los elementos esqueléticos. En la fase posterior de condensación del cartílago, los núcleos se organizan de nuevo, con una clara delimitación entre el cartílago recién formado y los tejidos regeneradores circundantes. Sin embargo, en esta etapa, la mayoría de los núcleos están aplanados y no hay diferencias morfológicas claras entre el centro y la periferia.
Cuando se midieron las secciones transversales de ambos elementos esqueléticos presentes en la región zeugopodial (radio y cúbito), se detectaron módulos de Young aparentes indistinguibles en miembros intactos, con valores medianos de 10,95 ± 11,69 kPa y 15,71 ± 6,49 kPa, respectivamente (Figura 2D, izquierda), lo que concuerda con sus similitudes anatómicas (Figura 1C). Curiosamente, el análisis del centro del cartílago frente a la periferia mostró que, en condiciones intactas, los módulos de Young aparentes en el centro eran más altos que en la periferia, con valores medios de 16,48 ± 6,86 kPa frente a 7,53 ± 4,63 kPa, respectivamente (Figura 2E, izquierda). El día 5 después de la amputación, correspondiente a la fase de histólisis, los módulos de Young aparentes en el radio y el cúbito disminuyeron considerablemente (0,03 ± 0,02 kPa y 0,13 ± 0,09 kPa, respectivamente, Figura 2D, derecha), pero también desaparecieron las diferencias entre el centro y la periferia, con módulos de Young medianos de 0,11 ± 0,07 kPa y 0,27 ± 0,34 kPa, respectivamente (Figura 2E, derecha). Al analizar las propiedades del cartílago durante una etapa de regeneración posterior, en el momento en que el cartílago comienza a condensarse, se detectó un aumento significativo en los módulos de Young aparentes, alcanzando valores intermedios entre las fases intacta e histolítica (0,77 ± 0,29 kPa, Figura 2F).
Como se puede ver en las curvas de ejemplo proporcionadas (Figura 2B), la histéresis ocurrió entre la mayoría de los pares de curvas de aproximación y retracción, lo que indica una respuesta viscoelástica del tejido bajo fuerza. Además, nos propusimos analizar con más detalle las propiedades viscoelásticas de los diferentes tejidos. Dado que las mediciones oscilatorias en múltiples frecuencias requieren mucho tiempo y son algo críticas con respecto a la preservación de la integridad del tejido, especialmente cuando se mapean múltiples regiones de tejido, utilizamos un método publicado anteriormente por Abuhattum et al. que permite ajustar la parte de aproximación de las curvas de fuerza-distancia antes de la retracción inmediata del voladizo26. El modelo se basa en los elementos del modelo de Kelvin-Voigt Maxwell y se ha aplicado previamente para el análisis de las propiedades viscoelásticas de células e hidrogeles26, así como de tejido pancreático27. La mediana de los módulos no relajados (Intacto: 23,05 kPa, Histólisis: 0,20 kPa y Cartílago de condensación: 1,60 kPa) y los módulos aparentes de Young (Intactos: 17,54 kPa, Histólisis: 0,07 kPa y Cartílago de condensación: 1,54 kPa) derivados para los tejidos en las diferentes etapas de regeneración revelaron diferencias significativas (Figura 2G-H). En general, se observó una respuesta predominantemente elástica de los tejidos a la deformación a la tasa de deformación elegida, como se refleja en la gran similitud de los módulos elásticos no relajados y aparentes (Figura 2G, H). Se obtuvieron valores de viscosidad aparente mediana significativamente más bajos para la etapa histolítica (0,72 Pa·s) en comparación con las etapas de cartílago intacto (2,06 Pa·s) y de cartílago condensante (2,32 Pa·s) (Figura 2I). Como era de esperar, los módulos aparentes de Young del análisis PyJjibe (Figura 2H) estuvieron en alta concordancia con los valores obtenidos por el software de procesamiento de datos JPK (Figura 2F).
En conclusión, la caracterización mecánica refleja la reestructuración dinámica de los tejidos durante el proceso de regeneración. Estas mediciones están de acuerdo con las observaciones anatómicas, donde la rigidez del tejido disminuye junto con las alteraciones observadas en la arquitectura del tejido (Figura 1C) y se recupera gradualmente durante la regeneración.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig01v2.jpg"> Figura 1: Mediciones de la indentación del cartílago de la extremidad del ajolote durante la regeneración. (A) Representación esquemática de las etapas de regeneración. La línea discontinua indica el sitio aproximado de la sección transversal generada por el vibratomo donde se realizaron las mediciones. (B) Imágenes representativas de las mediciones del centro (arriba) y la periferia (abajo) en el cartílago de la extremidad. La punta negra es el voladizo. Barra de escala: 100 μm. (C) Arquitectura de tejido en extremidades intactas (izquierda), tejido sometido a histólisis (centro) y cartílago en condensación (derecha). Verde: núcleos (Hoechst), magenta: filamentos de actina (Phalloidin). Barra de escala: 500 μm. C' Región ampliada delineada en el panel. Barra de escala: 100 μm. Las cuadrículas de sangría de 70 μm x 70 μm se indican con cuadrados punteados blancos (centro) y amarillos (periferia). En los paneles B y C, las letras R y U indican el radio y el cúbito, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5.jpg"> Figura 2: Medición de la rigidez del cartílago durante la regeneración de la extremidad del ajolote con AFM. (A) Esquemas del experimento de indentación de AFM que se muestra como fuerza en función del tiempo (arriba) y fuerza en función de la distancia entre el indentador y la muestra (abajo). Las curvas de aproximación y retracción se muestran en azul y rojo, respectivamente. El punto de contacto se muestra mediante una línea discontinua vertical negra. Las curvas de fuerza-indentación se ajustaron dentro de la parte de aproximación de la curva, ya sea utilizando el modelo Hertz/Sneddon (software de procesamiento de datos JPK y Pyjibe) o la extensión del modelo KVM viscoelástico en Pyjibe. (B) Curvas representativas de fuerza-distancia de las mediciones de AFM en extremidades intactas y en regeneración durante las etapas de histólisis y cartílago de condensación. El porcentaje de curvas analizables (es decir, sin artefactos) se indica en la esquina superior derecha de cada curva. (C) Ejemplos de artefactos típicos en curvas de fuerza-indentación, por ejemplo, debido a un contacto inadecuado del indentador con la superficie. Los ejemplos mostrados corresponden a extremidades intactas, pero se observaron tipos equivalentes de artefactos en todas las condiciones. Para B-C: Se ajustaron curvas representativas de fuerza-distancia y se mostraron utilizando Pyjibe. La curva azul claro representa la parte de aproximación de la curva y la curva roja clara es la parte de retracción. La línea azul más oscura es el Hertz/Sneddon aplicado apto para un dentador esférico. A continuación se muestran los residuos respectivos del ajuste para las curvas de fuerza-distancia inferiores. Los valores residuales trazados representan la diferencia entre los valores de fuerza real y de ajuste. (D) Módulos aparentes de Young de radio y centros de cúbito medidos en extremidades intactas y sometidas a histólisis. (E) Módulos de Young aparentes del centro del cartílago frente a la periferia (Peri) en extremidades intactas y durante la histólisis. (F) Módulos de Young aparentes medidos para el centro del cartílago en las etapas analizadas de la regeneración. Para D-F: Cada punto se deriva de una curva de fuerza-distancia analizada con éxito, y los puntos más grandes corresponden a los valores medianos por muestra. Los módulos aparentes de Young se obtuvieron utilizando el ajuste del modelo Hertz/Sneddon del software JPK Bruker. (G-I) Módulo (G) no relajado, módulo de Young aparente (H) y viscosidad aparente (I) calculados utilizando PyJibe (extensión KVM) a partir de mediciones del centro del cartílago en las etapas analizadas de la regeneración. Cada punto se deriva de una curva de fuerza-distancia analizada con éxito. Las líneas corresponden a los valores medianos de todas las mediciones por condición. Para D-I: Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Diferentes letras representan condiciones que son estadísticamente diferentes entre sí (p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66946/66946fig2v5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Mediciones de microscopía de fuerza atómica de cartílago en extremidades de ajolote intactas y en regeneración

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