Name: Monitorización de la actividad de repeticiones ricas en leucina que contiene 8 canales (LRRC8/VRAC) mediante transferencia de energía de resonancia de Förster de emisión sensibilizada (SE-FRET) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprende a monitorizar la actividad de canales LRRC8/VRAC mediante SE-FRET en células HeLa bajo condiciones osmóticas variables. Este método permite estudiar la regulación dinámica de estos canes aniónicos en compartimentos subcelulares inaccesibles para la electrofisiología tradicional.

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<meta charset="utf8"></head><body>Método basado en FRET para monitorizar la actividad del canal LRRC8 sin electrofisiología

Los canales iónicos compuestos por heterómeros de proteínas de la familia 8 (LRRC8) se encuentran en todas las células de los vertebrados, participando en una amplia gama de funciones fisiológicas 1,2. Estos canales LRRC8, identificados por primera vez como canales aniónicos regulados por volumen (VRAC) o canales rectificadores externos sensibles al volumen (VSOR), desempeñan un papel crucial en la disminución del volumen regulatorio celular 3,4. Facilitan la expulsión de iones de cloruro y osmolitos orgánicos, a lo que sigue el flujo de agua en respuesta a la hinchazón osmótica. Más allá de su papel en la respuesta al estrés osmótico, su papel en la regulación del volumen celular se ha relacionado con la proliferación y migración celular, la apoptosis, la espermiogénesis y la integridad epitelial 5,6,7. Se ha demostrado que la alteración del potencial de membrana tras la activación de LRRC8/VRAC contribuye a la diferenciación de los miotubos8 y a la secreción de insulina por las células β pancreáticas 9,10,11. Además, los canales LRRC8 conducen una variedad de osmolitos orgánicos como las moléculas de señalización purinérgicas ATP y cGAMP o el aminoácido excitador glutamato, colocando estos canales en la comunicación célula-célula en el sistema inmune o en la interacción glía-neurona 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Incluso los xenobióticos, como el colorante fluoresceína, el antibiótico blasticidina S o el fármaco anticancerígeno cisplatino, son conducidos por los canales LRRC8 23,24,25.
Existen numerosos informes sobre la transducción de señales que conduce a la activación de LRRC8/VRAC 26,27,28. Sin embargo, el mecanismo sigue sin estar claro, y la literatura presenta una amplia gama de mecanismos potenciales que podrían depender del proceso fisiológico específico. Estos incluyen cambios en la fuerza de los iones citosólicos, la interacción con el citoesqueleto, la composición de la membrana, las proteínas G, el estado redox y las cascadas de fosforilación 2,27,29,30,31.
Los canales LRRC8/VRAC contienen LRRC8A como una subunidad esencial 3,4 que debe heteromerizarse con al menos uno de sus parálogos LRRC8B-E para formar canales fisiológicamente funcionales 4,14,32. La composición de la subunidad determina las propiedades biofísicas del canal, como la rectificación y la inactivación dependiente de la despolarización 4,29,32,33,34, la especificidad del sustrato 15,17,20,21,24,35 y algunas vías de activación 36,37. Las estructuras de criomicroscopía electrónica (crio-EM) muestran que los homómeros de LRRC8A, así como los heterómeros, se ensamblan como hexámeros38,39,40, mientras que las quimeras de LRRC8A/LRRC8C que forman canales funcionales son heptámeros41. La parte N-terminal de todas las proteínas LRRC8 comprende cuatro hélices transmembrana, y la parte C-terminal contiene un dominio con repeticiones ricas en leucina (LRRD). Las estructuras complejas LRRC8 disponibles proporcionan evidencia de que los LRRDs, que se extienden hacia el citosol 3,4,23, pueden sufrir reordenamientos conformacionales durante la compuerta del canal 34,42,43. Esta noción se ve corroborada por el hallazgo de que la fusión C-terminal de proteínas fluorescentes da lugar a la actividad del canal basal14 y que la unión de los nanocuerpos a los dominios puede modular la actividad del canal44. Además, las alteraciones conformacionales de los terminales C se mostraron mediante la transferencia de energía de resonancia de Förster intracompleja (FRET)45.
El método más común para estudiar la actividad de los canales iónicos son las mediciones electrofisiológicas46, que se aplicaron ampliamente en la investigación de los VRAC antes de su identificación molecular47. Sin embargo, existen varias formas adicionales de monitorear la actividad de VRAC indirectamente, incluida la medición de sus sustratos conducidos -iones de haluro u osmolitos orgánicos- o su efecto sobre el volumen celular48. De hecho, la identificación de las proteínas LRRC8 como VRAC se basó en un ensayo basado en el enfriamiento de una proteína fluorescente sensible a haluros49 mediante la entrada de yoduro en la célula a través de VRACs activados 3,4. Otro método para monitorear la actividad del canal LRRC8/VRAC hace uso del movimiento de los dominios citosólicos que se puede observar, como en otros canales iónicos 50,51,52,53, por cambios en FRET45. Con este fin, las proteínas fluorescentes que sirven como pares FRET, como la proteína cian-fluorescente (CFP)/mCerulean3 como donante y la proteína amarillo-fluorescente (YFP)/mVenus como aceptor, se fusionaron con el C-terminal de las proteínas LRRC8 (Figura 1). La FRET intracompleja entre las subunidades de LRRC8 se demostró mediante experimentos de fotoblanqueo de aceptores45. Evitando el método de fotoblanqueo destructivo, los cambios de FRET a lo largo del tiempo se monitorearon mediante FRET de emisión sensibilizada (SE-FRET), donde básicamente se mide la emisión sensibilizada del aceptor al excitar el donante debido a la superposición del espectro de emisión del donante con el espectro de excitación del aceptor. La aplicación de hipotonicidad extracelular, un estímulo para la activación de LRRC8/VRAC, resultó en una reducción reversible en la intensidad de SE-FRET45. Es importante destacar que las mediciones simultáneas de patch-clamp de células enteras y la monitorización de FRET durante el tratamiento hipotónico mostraron que esta reducción de FRET reflejaba la activación de LRRC8/VRAC45. Este método, que evita la alteración de la membrana plasmática o la alteración del entorno intracelular mediante una solución de pipeta, ofrece una alternativa para monitorizar la actividad de LRRC8/VRAC. Es particularmente útil en entornos fisiológicos donde el mantenimiento del citosol nativo es crucial, es necesaria la resolución subcelular o se requiere una observación prolongada de la actividad del canal.
Aquí, presentamos un protocolo para estudiar LRRC8 / VRAC con una lectura basada en FRET. El protocolo describe cómo manipular y transfectar células, adquirir imágenes de muestra y control, analizar los datos y calcular los valores de FRET (SE-TRAST) de emisión sensibilizada.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Esquema del sistema de pares FRET LRRC8. mCerulean3 se muestra en cian y mVenus se muestra en amarillo. Después de la apertura del VRAC, la distancia (y/o la orientación espacial) entre los fluoróforos cambia, lo que resulta en una menor transferencia de energía entre el donante (Don) y el aceptor (Acc) y, a su vez, reduce el FRET observado. Creado con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA</td><td>gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cámara DFC9000GTC</td><td>Leica</td><td>11547007</td><td></td></tr><tr><td>CFP-18aa-YFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Elder et al. 2009 PMCID: PMC2706461; Donación de C.F. Kaminski (Universidad de Cambridge, Reino Unido)</td></tr><tr><td>Cicloheximida (CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66-81-9</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Manitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Solución salina tampón de fosfato de Dulbecco)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Rueda de filtro de emisiones (460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100%</td><td>)Leica</td><td>11525480</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Suero Fetal Bovino)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro</td><td>CYR71010 Leica</td><td>11525416</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Platos de cultivo con fondo de vidrio 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td><td>ACC 57</td><td>Carcinoma de cuello uterino de mamíferos/ Obtenido de Leibniz Forschungsinstitut DSMZ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Disch 35 mm</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>KCl (Cloruro de potasio)</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>LAS X FRET Wizard</td><td>Leica</td><td></td><td></td>11640862</tr><tr><td>Fuente de luz LED8 Leica</td><td></td><td>11504256</td><td></td></tr><tr><td>LRRC8A-mCerulean3</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>LRRC8E-mVenus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml; nig et al. 2019</td></tr><tr><td>Luna-II Automated Cell Counter</td><td>logos biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Luna-II Cell Counter Slides logos</td><td>biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (Cloruro de magnesio)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio THUNDER Imager de célula viva</td><td>Leica</td><td>11525681</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Cloruro de sodio)</td><td>Carl Roth</td><td>9263</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo HC PL APO 63x/1.40 ACEITE</td><td>Leica</td><td>11506349</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>gibco</td><td>11058</td><td></td></tr><tr><td>Osmómetro OM807</td><td>Vogel</td><td>V04807</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina (Pen Step)</td><td>gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripán (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Factor de necrosis tumoral (TNF)-a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94948-59-1</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión por gravedad controlada con válvula</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>VC3-4xG</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorización de la actividad de repeticiones ricas en leucina que contiene 8 canales (lrrc8/vrac) mediante transferencia de energía de resonancia de förster de emisión sensibilizada (se-fret)

Monitoring Leucine-Rich Repeat Containing 8 Channel (LRRC8/VRAC) Activity Using Sensitized-Emission F&#246;rster Resonance Energy Transfer (SE-FRET)

Con este método basado en FRET, se puede monitorizar la actividad de LRRC8/VRAC durante la estimulación osmótica, y la reducción de SE-FRET se correlaciona con el grado de hipotonicidad extracelular45. Aquí también se muestran resultados representativos de la activación del canal inducida por hipotonía (Figura 3 y Figura 4). Además, se puede observar la activación de LRRC8/VRAC por diferentes estímulos isismóticos, como la manipulación de la señalización de diacilglicerol45 o durante la activación de miocitos56.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig04.jpg"> 
Figura 4: Trazas de SE-FRET. (A) Trazas aparentes de SE-FRET de 5 experimentos independientes. Los datos representan la media ± DE de N = 2 a N = 7 celdas por campo de visión (FOV). (B) Media ± DE de todas las celdas (N = 31 celdas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Dado que los canales LRRC8/VRAC también están implicados en la disminución del volumen apoptótico24,57, la observación de la actividad del canal tras la inducción de la apoptosis sería otra aplicación para el método descrito aquí. En consecuencia, el protocolo para monitorizar SE-FRET en células HeLa que expresan LRRC8A-mCerulean3 y LRRC8E-mVenus se llevó a cabo mientras se aplicaban fármacos inductores de apoptosis mediados por receptores de muerte. Previamente se demostró que el factor de necrosis tumoral (TNF)-α y la cicloheximida (CHX) evocan corrientes VRAC en pocos minutos58. Después de la adición de 2 ng/mL de TNF-α y 1 μg/mL de CHX en tampón isotónico, hubo una disminución robusta de SE-FRET (Figura 5). Al reemplazar el tampón por un medio hipertónico, aunque contenga TNF-α y CHX, los valores de SE-FRET se recuperaron cerca de la línea de base (Figura 5A), lo que corresponde a la disminución de las corrientes de VRAC en la solución de baño hipertónica durante el tratamiento con el ligando Fas58 inductor de apoptosis. El tratamiento de las células con DMSO, el disolvente del TNF-α y el CHX, no dio lugar a una reducción de SE-FRET. TNF-α + CHX no afectó a SE-FRET de CFP-18aa-YFP, una construcción en tándem de EYFP y ECFP como control FRET59, lo que demuestra la especificidad para LRRC8/VRAC (Figura 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig05v2.jpg"> 
Figura 5: Activación isosmótica de VRAC por apoptosis mediada por receptores de muerte. (A) Valores normalizados de SE-FRET de células HeLa que expresan LRRC8A-mCer/LRRC8E-mVen (n = 8 platos, 23 células) a lo largo del tiempo. Después de 15 ciclos en tampón de imagen isotónica (línea de base), la solución de baño se reemplazó por tampón isotónico suplementado con 2 ng/mL de TNF-α y 1 μg/mL de cicloheximida (CHX) durante 30 ciclos, seguidos de 20 ciclos de tampón de imagen hipertónica con TNF-α y CHX. El valor medio bruto de SE-FRET de cada ROI y punto de tiempo se normalizó a la media del valor basal (isotónico) para el ROI respectivo. (B) Cuantificación de los valores normalizados de SE-FRET de las células HeLa que expresan LRRC8A/E como en A con una solución isotónica que contiene DMSO como vehículo de control para CHX (n = 5 platos, 12 células) o tampón isotónico que contiene inductores de apoptosis como en A (n = 8 platos, 23 células), o de células HeLa que expresan CFP-18aa-YFP con inductores de apoptosis (n = 3 platos, 9 células). Los datos representan la media de los últimos 10 puntos de tiempo en el búfer respectivo de celdas individuales (símbolos) y la media de todas las celdas ± SD; ** p &lt; 0,01 ANOVA ordinario de un factor seguido de la prueba post-hoc de comparación múltiple de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig05largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Monitorización de la actividad de repeticiones ricas en leucina que contiene 8 canales (LRRC8/VRAC) mediante transferencia de energía de resonancia de Förster de emisión sensibilizada (SE-FRET)

Members of the LRRC8 protein family form heteromeric ion and osmolyte channels with roles in numerous physiological processes. As volume-regulated anion ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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