Name: Optimización de la recolección de lágrimas en ratones para el análisis de ARNm y proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a optimizar la recolección de lágrimas en ratones para aislar proteínas y ARN como biomarcadores. Este protocolo facilita diagnósticos tempranos de enfermedades oculares y sistémicas mediante biopsias líquidas mínimamente invasivas.

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Este trabajo contó con el apoyo de VELUX STIFTUNG [proyecto 1852] a M.L. y becas de posgrado de CONAHCYT a M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) y A.M.F (CVU 1317418). Un sincero agradecimiento a todos los miembros del laboratorio, del Centro de Investigación sobre el Envejecimiento y del Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) por sus contribuciones a las estimulantes discusiones.

Todos los procedimientos aquí descritos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Los animales de laboratorio fueron tratados y manipulados en estricta conformidad con las pautas de uso animal de la revista y de acuerdo con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y visual. La salud ocular antes y después de los procedimientos se evaluó mediante la evaluación de las secreciones oculares, los párpados hinchados, las anomalías oculares y los cambios de comportamiento.
1. Animales y preparación de reactivos
<ol><li>Utilice tres ratones macho C57BL/6 de 2 meses de edad por réplica para el procedimiento, con un peso inicial de ~25 g (Figura 1). Procese cada mouse individualmente y colóquelo en una almohadilla térmica para mantener el calor.</li>
	<li>Para inducir la secreción lagrimal, prepare una solución madre de pilocarpina a 20 mg/ml con agua estéril.</li>
	<li>Corte las tiras reactivas de Schirmer a 5 mm de largo y doble cada tira en la muesca en un ángulo de 90°.</li>
	<li>Prepare 250 μL de agua estéril con un inhibidor de la proteasa (1 comprimido por 50 mL, según las instrucciones del fabricante).</li>
</ol>2. Estimulación de la producción y recolección de lágrimas
<ol><li>Pesar cada ratón individualmente para calcular la dosis adecuada de tratamientos.</li>
	<li>Para estimular la producción de lágrimas, administrar 30 mg/kg de pilocarpina por vía intraperitoneal con una jeringa de insulina de 6 mm (Figura 1B). Espere 2 minutos después de la inyección del medicamento para que se manifiesten sus efectos. NOTA: No fue posible obtener datos de animales no estimulados debido a la disponibilidad limitada de líquido lagrimal.</li>
	<li>Recoja las lágrimas colocando el extremo de cada fragmento de tira de Schirmer sobre el centro del párpado inferior con un par de pinzas y manténgalo en su lugar hasta que la lágrima alcance el límite de la tira (Figura 1C). Luego, reemplace la tira. Coloque secuencialmente 2 tiras de Schirmer en cada ojo, con un intervalo de 2 minutos entre tiras para la recolección. El proceso de recolección de lágrimas requiere alrededor de cuatro fragmentos de tira durante 10 minutos por ratón.</li>
	<li>Coloque los fragmentos de la tira Schirmer en tubos estériles sobre hielo para evitar la degradación de los componentes. Tan pronto como termine la recolección, comience el procesamiento de lágrimas.</li>
</ol>3. Aislamiento de proteínas
<ol><li>Colocar los fragmentos de tira en un tubo de microcentrífuga de 600 μL que contenga 20 μL de agua estéril con un inhibidor de la proteasa y centrifugar durante 1 h a 600 x g a 4 °C, como se muestra anteriormente17 (Figura 1D).</li>
	<li>Realice una punción con una aguja inyectora de acero inoxidable de 7,5 cm en la punta del tubo de 600 μL que contiene la muestra (Figura 1E). A continuación, transfiera este tubo perforado a un nuevo tubo esterilizado de 1,5 mL y centrifugue las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C, como se informó anteriormente17, para recuperar el volumen de lágrimas diluidas. El volumen de la película lagrimal (sobrenadante) estará en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Cree un grupo de proteínas combinando el sobrenadante recuperado de todas las muestras. En este experimento se obtuvo un volumen total de aproximadamente 200 μL. NOTA: La producción de lágrimas puede durar más de 1 hora. Durante este tiempo, aún se pueden recoger las lágrimas.</li>
	<li>Cuantificar el contenido total de proteínas de la piscina lagrimal utilizando el método estándar de Bradford22.</li>
</ol>4. Análisis SDS-PAGE
<ol><li>Calentar las muestras de proteínas a 99 °C durante 4 min para desnaturalizar las proteínas. Agite las muestras brevemente para mezclar los componentes.</li>
	<li>Cargue 30 μg de contenido de proteína cuantificada de cada muestra en un gel SDS-PAGE al 10% (Tabla 1) y ejecute las muestras a 90 V durante 2 h utilizando un método estándar23.</li>
	<li>Después de la electroforesis, cubra el gel con solución de tinción (Tabla 1) e incube durante 30 min para teñir las proteínas.</li>
	<li>Enjuague el gel con la solución decolorante varias veces hasta que el fondo se aclare y las bandas de proteínas sean visibles.</li>
	<li>Adquiera imágenes con un sistema de documentación de gel.</li>
</ol>5. Aislamiento de ARNm para qPCR y PCR digital
<ol><li>Coloque las tiras en un tubo de microcentrífuga de 600 μL que contenga 20 μL de agua estéril. Realizar una punción en la punta del tubo que contiene la muestra, introducirla en un nuevo tubo esterilizado de 1,5 mL y centrifugar, como se informó anteriormente en lágrimas humanas3, durante 20 min a 2.000 x g a 4 °C (Figura 1E-H).</li>
	<li>Cree un grupo a partir de todas las muestras. El volumen recuperado de este experimento fue de aproximadamente 22 μL de sobrenadante por cada ratón, es decir, 66 μL de volumen total. Coloque los tubos sobre hielo seco para evitar la degradación de la biomolécula.</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidinio (obtenido comercialmente) y homogeneizar por pipeteo. Deje reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente. En esta etapa, las muestras pueden almacenarse a -20 °C durante varias semanas o a -70 °C durante varios meses.</li>
	<li>Añadir 40 μL de cloroformo y mezclar en un vórtice durante 15 s. Deje reposar durante 2 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a 10.000 x g durante 15 min a 4°C.</li>
	<li>Transfiera con cuidado la fase acuosa (sin tomar la interfase) a un nuevo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Añadir 0,5 μL de glucógeno (0,05 μg/μL) a 100 μL de isopropanol y mezclar mediante pipeteo. El glucógeno se precipita conjuntamente con el ARN y no interfiere con los pasos posteriores.</li>
	<li>Dejar reposar durante 10 min a -20 °C. Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. Decanta rápidamente el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 200 μL de etanol frío al 75% y resuspender el pellet de ARN por vórtice. Centrifugar a 8.000 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Decantar el etanol. Sin invertir el tubo, déjalo secar al aire durante 20-30 min. Añadir 20 μL de agua sin RNasa y volver a suspender.</li>
	<li>Proceda a leer la densidad óptica en el espectrofotómetro de microvolumen a 260 nm y 280 nm para evaluar la pureza del ARN. Las muestras deben estar en hielo. NOTA: Las bandas ribosómicas 28S y 18S no se pueden observar utilizando un gel de agarosa debido a la naturaleza de la muestra. La presencia de otros ARN, como los miRNAs o los ARNm, puede ser analizada utilizando un bioanalizador, como se ha demostrado anteriormente18.</li>
	<li>Sintetice el ADNc a partir de ARN de lágrimas utilizando un kit comercial según el protocolo del fabricante.<ol><li>Comience con un ARN de entrada en un rango de 10 ng-5000 ng; según el kit utilizado, mézclalo con 1 μL de Oligo (dT) y hasta 12 μL de agua libre de RNasa. Girar a 500 x g durante 30 s e incubar a 65 °C durante 5 min.</li>
		<li>Añadir al tubo de mezcla 4 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de inhibidor de RNasa, 2 μL de mezcla de dNTP y 1 μL de transcriptasa inversa.</li>
		<li>Gire el tubo a 500 x g durante 30 s para bajar la mezcla. A continuación, incubar el tubo a 42 °C durante 60 min. Termine la reacción incubando el tubo a 70 °C durante 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Debido a la baja concentración de ARNm en las lágrimas, se recomienda utilizar ADNc sin diluir para la qPCR24. Para este experimento se utilizaron 150 ng de ADNc. Realice qPCR con cebadores DNMT3a : Adelante: GCCGAATTGTGTGTGTGTGTGGATGACA, Reverso: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA y GAPDH cebadores: Adelante: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTGTTCTTA, Reverso: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC siguiendo las instrucciones de los fabricantes y los procedimientos del equipo.<ol><li>Para el ciclo de qPCR, utilice el siguiente programa: Desnaturalización inicial: 95 °C durante 10 min seguido de 45 ciclos de C 95 °C - 15 s, 60 °C - 30 s y 72 °C - 30 s, finalizando con una extensión final a 72 °C durante 5 min.</li>
		<li>Realice un análisis de la curva de fusión para evaluar la presencia de dímeros de cebadores o amplicones inespecíficos en la reacción. La rampa de temperatura comenzó desde los 50 °C hasta los 99 °C finales, con una retención inicial de 90 s para el primer escalón y una retención de 5 s entre cada escalón.</li>
		<li>Para la dPCR25, realice diluciones en serie para optimizar la cantidad de ADNc que se requiere para detectar el ARNm de interés. En este experimento, utilice las siguientes diluciones de ADNc en agua sin nucleasas: 150 ng, 75 ng, 37,5 ng y 18,75 ng de ADNc. Se utilizaron cebadores para DNMT3a mencionados anteriormente. Para el ciclo de dPCR, utilice el siguiente programa: desnaturalización inicial: 95 °C durante 2 min seguido de 40 ciclos de 95 °C - 15 s y 60 °C - 30 s.</li>
	</ol></li>
</ol>

Protocolo para la extracción de proteínas lagrimales en modelos animales experimentales

<ol><li>Ravishankar, P., Daily, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tears+as+the+next+diagnostic+biofluid%3A+A+comparative+study+between+ocular+fluid+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Sci%22%5BJournal%5D)">Tears as the next diagnostic biofluid: A comparative study between ocular fluid and blood.</a> Appl Sci. 12 (6), 2884(2022).</li>
<li>Masoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+human+tear+film%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of human tear film: A review.</a> Exp Eye Res. 220, 109101(2022).</li>
<li>Dara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+RNA+extraction+method+from+human+tears%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel RNA extraction method from human tears.</a> Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).</li>
<li>Amorim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+biomarkers+in+tears+for+diabetic+retinopathy+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Med+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis.</a> Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).</li>
<li>Arslan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+biochemical+analyses+of+human+tear+fluid%3A+Polyvalent+faces+of+the+Schirmer+strip%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip.</a> Exp Eye Res. 237, 109679(2023).</li>
<li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+th17-associated+cytokines+and+clinical+correlations+in+patients+with+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease.</a> PloS one. 12 (4), e0173301(2017).</li>
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<li>Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tears+and+ocular+surface+disorders%3A+Usefulness+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers.</a> J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).</li>
<li>Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tears+as+a+source+of+biomarkers+for+ocular+and+systemic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases.</a> Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).</li>
<li>Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+fluid+collection+methods%3A+Review+of+current+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Tear fluid collection methods: Review of current techniques.</a> Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).</li>
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<li>Khanna, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+lipidomics+approaches+in+human+tears%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review.</a> Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).</li>
<li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid%3A+From+sampling+to+preanalytical+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing.</a> Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).</li>
<li>Koduri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+tear+protein+elution+from+Schirmer%27s+strips+in+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease.</a> Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).</li>
<li>Kakan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+miRNAs+identified+in+a+murine+model+of+sjogren%27s+syndrome+as+potential+diagnostic+biomarkers+and+indicators+of+disease+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren's syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism.</a> Front Immunol. 13, 833254(2022).</li>
<li>Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tear+secretion+by+lacrimal+glands+in+transgenic+mice+lacking+water+channels+aqp1%2C+aqp3%2C+aqp4+and+aqp5%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5.</a> Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).</li>
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</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

El líquido lagrimal es fácilmente accesible, y la determinación de biomarcadores en las lágrimas puede emplearse como una técnica complementaria exitosa para el diagnóstico temprano de diversas enfermedades humanas27. Si bien el análisis bioquímico de la composición de las lágrimas en modelos animales experimentales complementa este enfoque y promete avances significativos en la comprensión de las bases moleculares de las enfermedades, existe una escasez de datos y protocolos disponibles, lo que nos llevó a desarrollar uno. El método descrito en este informe es técnicamente sencillo de realizar y permite la identificación preliminar de la expresión diferencial de diferentes moléculas candidatas asociadas a enfermedades.
La recolección de lágrimas se puede lograr a través de varios métodos, como tubos capilares y tiras de Schirmer16,17, hisopos28y esponjas29. Se prefirió el método de tiras de Schirmer debido a su facilidad de acceso, capacidades cuantitativas, adaptabilidad durante la recolección de muestras, costo y simplicidad en la extracción de componentes de lágrimas para el procesamiento en laboratorio. Además, este método es rentable, mínimamente invasivo y no presenta riesgo de lesiones o daños en la córnea, gracias a la composición de la tira de filtro de papel16,17. Los pasos críticos de este protocolo incluyen la necesidad de estimulación farmacológica de la producción de lágrimas mediante pilocarpina y la selección de un tampón de elución adecuado.
La pilocarpina es un agonista colinérgico que se une a los receptores muscarínicos M3 y puede causar estimulación farmacológica de las glándulas exocrinas, mejorando la producción de lágrimas, la secreción salival y la micción. Aunque los estudios en humanos demostraron que la estimulación lagrimal no cambia la osmolaridad del líquido recolectado30, claramente influye en los perfiles proteicos31. El uso de pilocarpina como estimulador farmacológico colinérgico de las glándulas exocrinas y potenciador de la secreción lagrimal ha sido reportado con éxito en conejos y ratones 19,32,33, pero no se ha evaluado el efecto de la estimulación sobre el contenido proteico. Para evitar esta limitación y permitir una comparación precisa de los perfiles de lágrima entre las condiciones experimentales, es crucial tener en cuenta la configuración específica de la colección. Del mismo modo, la introducción de un paso de enjuague antes de la recolección de lágrimas podría ser beneficiosa para evitar la contaminación previa de la superficie ocular. En este protocolo se empleó una concentración de 30 mg/kg de pilocarpina13. Como los ratones permanecieron inmóviles y tranquilos después de la inyección de este medicamento, las lágrimas se recogieron sin anestesia, lo que facilitó la recolección de muestras.
La elección de un tampón de elución adecuado está estrechamente relacionada con el método seleccionado para analizar la composición bioquímica de una muestra de lágrima y la tasa de recuperación de material biológico de la tira. Por ejemplo, en un estudio comparativo centrado en la retención de proteínas de las tiras de Schirmer en pacientes, se estableció que un tampón compuesto por 100 mM de bicarbonato de amonio junto con un 0,25% de Nonidet P40 (NP40) produjo resultados superiores para aplicaciones de proteómica o análisis ELISA multiplex17. En nuestras manos, el uso de agua estéril demostró ser suficiente para visualizar extractos de proteínas totales en SDS-PAGE y para detectar el ARNm de los genes de interés por PCR.
Para evaluar la presencia de DNMT3a y ARNm de GAPDH en lágrimas de ratones, comparamos el rendimiento de qPCR y dPCR. La presencia de dímeros cebadores observados en la curva de fusión de qPCR se atribuye a la baja abundancia del transcrito DNMT3a . Como se ha demostrado, la dPCR tiene una sensibilidad y eficacia significativamente mayores en la detección del ARNm diana en estas muestras en muestras diluidas y sin diluir. Esta capacidad de detección precisa hace que la dPCR sea el método preferido para el análisis de lágrimas en ratones, ofreciendo a los investigadores y médicos una herramienta fiable para futuros estudios y posibles aplicaciones clínicas.
El desarrollo de un protocolo estandarizado para la recolección de muestras de lágrimas en modelos animales representa un avance significativo en la investigación. Este protocolo no solo facilita la recogida sistemática y precisa de muestras de lágrimas, sino que también abre un amplio abanico de posibilidades para su aplicación en diversas áreas de estudio. La capacidad de obtener muestras de lágrimas de modelos animales permite la investigación de un amplio espectro de enfermedades y afecciones, así como la exploración de nuevos biomarcadores y posibles terapias. Además, al establecer un protocolo estandarizado, se promueve la reproducibilidad de los resultados en diferentes estudios y laboratorios, contribuyendo así a la validez y fiabilidad de la investigación. En última instancia, este avance en la metodología de recolección de muestras de lágrimas en modelos animales tiene el potencial de impulsar importantes descubrimientos y mejorar la comprensión de la fisiopatología de diversas enfermedades, abriendo nuevas vías para el diagnóstico, el tratamiento y la prevención.

Las lágrimas se consideran un ultrafiltrado plasmático y también se han descrito como un fluido intermedio entre el suero plasmático y el líquido cefalorraquídeo debido a una superposición significativa en las biomoléculas que comparten1. Se ha reportado que las lágrimas humanas contienen proteínas, lípidos lagrimales, metabolitos y electrolitos2. Recientemente, también se han identificado otras biomoléculas como ARNm, miARN y vesículas extracelulares 3,4,5,6,7.
En los seres humanos, las lágrimas basales se localizan en la película lagrimal, que consta de tres capas: la capa lipídica externa, que mantiene la superficie lagrimal lisa para permitirnos ver a través de ella y evitar la evaporación de la lágrima; la capa acuosa intermedia, que mantiene el ojo hidratado, repele las bacterias, protege la córnea y constituye el 90% de la película lagrimal; Y por último, la capa de mucina, una familia de proteínas de alto peso molecular que están en contacto con la córnea y permiten que la lágrima se adhiera al ojo8. La distribución de las lágrimas a través de la superficie ocular comienza con la secreción de la glándula lagrimal. Luego, este líquido se guía a través de los conductos lagrimales para pasar sobre la superficie del ojo y fluir hacia los canales de drenaje. Cada parpadeo permite que las lágrimas se dispersen uniformemente por todo el ojo, manteniéndolo húmedo9.
La película lagrimal es un biofluido altamente dinámico capaz de reflejar los cambios moleculares que ocurren no solo en la superficie ocular sino también en otros tejidos y órganos. El análisis de la expresión diferencial en este biofluido representa un enfoque prometedor para el descubrimiento de biomarcadores en enfermedades humanas10,11. La utilización de la película lagrimal como fuente de biomarcadores para el diagnóstico precoz de diversas patologías se ha visto facilitada en gran medida por la presencia de métodos de recogida no invasivos. El método más común para la recolección de lágrimas en clínicas humanas y veterinarias involucra un soporte basado en membranas (tira de Schirmer), que opera según el principio de acción capilar, permitiendo que el agua en las lágrimas viaje a lo largo de una tira reactiva de papel o tubos capilares colocados en el saco conjuntival inferior del sujeto 12,13,14. A pesar de la limitación inherente a la obtención de un pequeño volumen de muestra a través de este método, el análisis bioquímico de la composición lagrimal mediante diversas técnicas sensibles ha facilitado la identificación de potenciales moléculas biomarcadoras11,15. Los protocolos para optimizar y evaluar la elución de proteínas lagrimales de tiras de Schirmer y capilares en pacientes humanos están bien documentados16,17. Sin embargo, las descripciones completas de los protocolos optimizados diseñados específicamente para extraer información molecular relacionada con las lágrimas de modelos animales experimentales están disponibles, pero son escasas. Los métodos existentes, como la inducción de lágrimas a través de la estimulación directa de la glándula lagrimal18, si bien permiten la recolección de mayores volúmenes, son invasivos y pueden causar molestias a los animales. Los métodos no invasivos, como la recolección de lágrimas de la superficie ocular, han sido descritos como una forma de aislar el ADN y los miRNAs19,21.
Este protocolo tiene como objetivo establecer un método rentable y optimizado para recolectar y procesar lágrimas en ratones. El método prioriza la no invasividad y la obtención de volúmenes de lágrimas suficientes adecuados para el análisis molecular a través de técnicas como SDS-PAGE, qPCR y dPCR. La proteína extraída y la información sobre el contenido de ARNm se pueden utilizar para identificar posibles biomarcadores en los modelos experimentales existentes de la enfermedad.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>1985023</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampón Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>16-0737</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Química Meyer</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Bradford</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1003045143</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Azul R 250</td><td>Biológica de EE. UU.</td><td>6104-59-2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Química Rique</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de ADN GeneRuler 1kb plus</td><td>Thermofisher científico</td><td>Referencia SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Biológica de EE. UU.</td><td>G8145</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC- 29096</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Hcl</td><td>Química Rique</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Química Rique</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Química Meyer</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos 1,5 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos 600 &micro; l</td><td>Axygen</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR y Tiras</td><td>Novasbio</td><td>PCR 0104</td><td></td></tr><tr><td>Pilocarpina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6503-10g</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de PCR QIAcuity EvaGreen (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>250112</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity Nanoplate 26k 24 pocillos (10)</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>Real qPlus 2x Master Mix Verde</td><td>Ampliqon</td><td>A323402</td><td></td></tr><tr><td>Kit de síntesis de ADNc RevertAid First Strad</td><td>Thermofisher científico</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Tiras reactivas de Schirmer</td><td>Laboratorio Santgar</td><td>SANT1553</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma aldrich</td><td>102560430</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo TRI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9424-200ML</td><td>Solución monofásica de fenol e isotiocianato de guanidinio</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biológica de EE. UU.</td><td>T8650</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Chem Cruz</td><td>sc-3715A</td><td></td></tr></tbody></table>

optimización de la recolección de lágrimas en ratones para el análisis de arnm y proteínas

Optimizing Tear Collection in Mice for mRNA and Protein Analysis

La película lagrimal es un biofluido altamente dinámico capaz de reflejar cambios moleculares asociados a la patología, no solo en la superficie ocular sino también en otros tejidos y órganos. El análisis molecular de este biofluido ofrece una forma no invasiva de diagnosticar o controlar enfermedades, evaluar la eficacia del tratamiento médico e identificar posibles biomarcadores. Debido al volumen limitado de muestras, la recolección de muestras de lágrimas requiere habilidades específicas y herramientas adecuadas para garantizar una alta calidad y la máxima eficiencia. Se han descrito varias metodologías de muestreo de lágrimas en estudios en humanos. En este artículo, se presenta una descripción completa de un protocolo optimizado, diseñado específicamente para extraer información de proteínas relacionadas con el desgarro de modelos animales experimentales, especialmente ratones. Este método incluye la estimulación farmacológica de la producción de lágrimas en ratones de 2 meses de edad, seguida de la recolección de muestras mediante tiras de Schirmer y la evaluación de la eficacia y eficiencia del protocolo a través de procedimientos estándar, SDS-PAGE, qPCR y PCR digital (dPCR). Este protocolo se puede adaptar fácilmente para la investigación de la firma de la proteína lagrimal en una variedad de paradigmas experimentales. Al establecer un protocolo de muestreo de lágrimas asequible, estandarizado y optimizado para modelos animales, el objetivo era cerrar la brecha entre la investigación en humanos y animales, facilitando los estudios traslacionales y acelerando los avances en el campo de la investigación de enfermedades oculares y sistémicas.

El protocolo descrito en este artículo proporciona un método fácil y asequible para obtener información molecular a partir del líquido lagrimal utilizando técnicas comúnmente disponibles en la mayoría de los laboratorios de biología molecular. Además, el protocolo puede ampliarse mediante el empleo de técnicas altamente sensibles como ELISA para la detección de actividad enzimática.
Después de estos procedimientos, el rendimiento total de proteínas fue de aproximadamente 3-4 μg/μL. El análisis de la página SDS teñido con Coomassie de extractos de proteínas totales revela patrones de expresión de proteínas en la retina total y las lágrimas (Figura 2A).
El ARN aislado tuvo una relación de absorción UV de 260/280 entre 1,9 y 2,0. El rendimiento promedio fue de 134,8 ng/μL. La qPCR se realizó utilizando juegos de cebadores para un gen de mantenimiento (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, GAPDH)3 y un gen biomarcador putativo (ADN-metiltransferasa 3a, DNMT3a)26. Se utilizó una muestra de ADNc sin diluir 1:1 (150 ng).
Se realizó un análisis de la curva de fusión y se calcularon las tasas de Ct en el software qPCR. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. El análisis reveló valores de Ct entre 20 y 24, que es un rango adecuado de cantidad inicial de ARNm objetivo en la muestra (Figura 2B). Sin embargo, el análisis de la curva de fusión en la Figura 2C sugiere la baja presencia de ARNm objetivo. No obstante, el gel de agarosa al 2% confirmó la presencia de amplicones en el tamaño esperado (Figura 2D).
La dPCR se realizó utilizando el mismo par de juegos de cebadores para DNMT3a. La dilución de las muestras de ADNc utilizada fue 1:1 (150 ng), 1:2 (75 ng), 1:4 (37,5 ng), 1:8 (18,75 ng). Todos los experimentos se realizaron por duplicado. La dPCR fue capaz de detectar desde 1,33 copias/μL en la muestra sin diluir, hasta 0,45 copias/μL en la muestra diluida 8 veces (Figura 3A,3B). Por lo tanto, la dPCR mostró una mayor sensibilidad al ARNm diana presente en las lágrimas en comparación con la qPCR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66955/66955fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del protocolo de extracción de lágrimas de ratones. a) Recogida de lágrimas. Se utilizaron tres ratones C57BL/6J de 2 meses de edad. (B) La producción de lágrimas fue inducida farmacológicamente por la administración intraperitoneal de pilocarpina. Fotografía que ilustra la colocación de la tira de Schirmer. (C) Procesamiento de lágrimas. A continuación, se recogieron las lágrimas con tiras Schirmer durante 10 min y se transfirieron a tubos de microcentrífuga. (D) Las lágrimas recogidas en las tiras de Schirmer se centrifugaron con agua estéril e inhibidores de la proteasa o simplemente agua estéril. (E, F) Estos tubos se perforaron en la parte inferior y posteriormente se transfirieron a un nuevo tubo esterilizado de 1,5 mL para facilitar la elusión del líquido. (G, H) Las lágrimas se recogen en el tubo de 1,5 ml. (I) Fotografía representativa del procedimiento de recolección de lágrimas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66955/66955fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66955/66955fig02.jpg"> Figura 2: Análisis posterior de la película lagrimal para aplicaciones moleculares. (A) SDS-PAGE de lágrimas de ratón y un extracto de proteína de retina. MW: Marcador de peso molecular.; carril 1: Perfiles proteicos de la retina (30 μg); Carril 2: Perfiles proteicos de las lágrimas (30 μg). (B) qPCR para GAPDH y DNMT3a en lágrimas de ratones. En la Tabla 2 se muestran la TC y la ΔCT promedio. (C) Análisis de la curva de fusión para productos DNMT3a y GAPDH PCR. El eje y representa la tasa de cambio de fluorescencia en la reacción de amplificación (dF/dT), y el eje x representa la temperatura en °C (D) Análisis del amplicón de PCR en electroforesis en gel de agarosa al 2% que contiene 0,5 μg/mL de bromuro de etidio. Carril M: 1 kb Plus Escalera de ADN. Carril 1,2: GAPDH y DNMT3a PCR amplicon, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66955/66955fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66955/66955fig03v2.jpg"> Figura 3: PCR digital (dPCR) para la expresión de DNMT3a en lágrimas de ratones. (A) Los resultados de la dPCR se muestran como un diagrama de dispersión 1D que muestra en puntos azules las copias de la transcripción de DNMT3a . Los puntos negros son particiones sin las copias de transcripción DNMT3a presentes. (B) Se generó una serie de dilución de ADNc para determinar la concentración óptima para cuantificar las copias de la transcripción de DNMT3a . Las barras de error representan la desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66955/66955fig03largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre del material</td>
			<td colspan="5">Descripción</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">10% Gel SDS</td>
			<td colspan="5">Para un gel separador: 3,8 mL de H2O destilado; 2,6 mL de Tris; pH 8,8; 1,5 M 3,4 mL de acrilamida; 100 μL 10% SDS; 100 μL 10% APS; 4 μL TEMED.</td>
		</tr><tr><td colspan="5">Por un gel recolector: 2,72 mL de H2O destilado, 0,52 mL de Tris; pH 6,8; 1,5 M, 0,68 mL de acrilamida, 40 μL 10% SDS, 40 μL 10% APS, 4 μL TEMED.</td>
		</tr><tr><td>Tampón de electroforesis</td>
			<td colspan="5">250 mM de base Tris, 2 M de glicina, 1% de SDS</td>
		</tr><tr><td>Solución de tinción</td>
			<td colspan="5">Disolver los siguientes reactivos en 43 mL de agua (almacenar a temperatura ambiente en un frasco ámbar): Coomassie 0,25 g; ácido acético 7 mL; metanol 50 mL</td>
		</tr><tr><td>Solución decolorante</td>
			<td colspan="5">Disolver los siguientes reactivos en 63 mL de agua (almacenar a temperatura ambiente): ácido acético 7 mL; etanol 30 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1. Configuración para SDS-Page. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre del gen</td>
			<td>CT1</td>
			<td>CT2</td>
			<td>Promedio con SD</td>
			<td>ΔCT</td>
		</tr><tr><td>GAPDH</td>
			<td>20.14</td>
			<td>20.73</td>
			<td>20,44±0,17</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>DNMT3a</td>
			<td>24.59</td>
			<td>24.97</td>
			<td>24,78±0,07</td>
			<td>4.35</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2. Valores de Ct de DNMT3a y GAPDH en lágrimas de ratones.

La identificación de biomarcadores de ARN y proteínas a partir de lágrimas en modelos de ratón es muy prometedora para el diagnóstico temprano de diversas enfermedades. Este manuscrito proporciona un protocolo completo para optimizar la eficacia y la eficiencia del aislamiento de ARNm y proteínas de las lágrimas de ratón.

Optimización de la recolección de lágrimas en ratones para el análisis de ARNm y proteínas

The tear film is a highly dynamic biofluid capable of reflecting pathology-associated molecular changes, not only in the ocular surface but also in other ...

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