Sistemas AAV y modelos murinos para investigar la expresión ectópica de Neurod1 en células transducidas en momentos subagudos y crónicos posteriores al ictus isquémico

Estamos explorando la expresión ectópica de factores de transcripción neurogénica mediada por AAV como un posible tratamiento para el accidente cerebrovascular isquémico. Nuestro objetivo es ver si la expresión de Neurod1 en las células que expresan GFAP durante las fases subaguda y crónica después de un accidente cerebrovascular aumenta las neuronas transducidas y se correlaciona con mejoras en la función motora. Hallazgos recientes muestran que la expresión génica en la corteza varía según la región con el mismo AAV Nuestra investigación encontró que el promotor GFAP es más activo en la corteza prefrontal medial que en la corteza motora, lo que indica que las células transducidas responden de manera diferente a promotores específicos.

Por lo tanto, las terapias que involucran factores de transcripción neurogénica deben adaptarse a la región del cerebro objetivo. Los desafíos actuales incluyen la variabilidad en el tamaño de las lesiones cerebrales debido a variables como las tasas de inyección de ET-1 y las eficiencias de transducción entre regiones cerebrales. Los títulos de AAV y el tropismo en regiones cerebrales y cepas de ratones pueden afectar a la eficiencia de la transducción, lo que afecta a la evaluación celular de la expresión ectópica de Neurod1 después de un accidente cerebrovascular.

El principal desafío en la conversión de astrocitos en neuronas es distinguir las neuronas reprogramadas de las preexistentes. Nuestro laboratorio tiene como objetivo confirmar que esta reprogramación se produce in vivo mediante el desarrollo de herramientas novedosas. En última instancia, buscamos comprender cómo la expresión ectópica del factor de transcripción neuronal mejora la recuperación en animales con lesiones cerebrales.

Para comenzar, retire el animal anestesiado de la cámara y colóquelo sobre una superficie limpia. Después de limpiar el área quirúrgica del ratón, coloque su nariz en el cono de la nariz estereotáxica y estabilice el cráneo con barras para los oídos. Con una hoja de bisturí número 10, haga una incisión vertical paralela al plano sagital desde detrás del punto medio de los ojos hasta el hueso parietal.

Luego, retrae suavemente la piel para exponer el cráneo. A continuación, use un hisopo para romper la fascia en el cráneo y permitir que el cráneo se seque para exponer completamente el bregma. Con un taladro estereotáxico de alta velocidad, perfore tres agujeros de rebaba en las coordenadas de la corteza sensoriomotora derecha.

Luego, reemplace el taladro con una jeringa de calibre 26 equipada con una aguja que mide 0.375 pulgadas de largo. Cargue 1,5 microlitros de solución de endotelina-1 de 400 micromolares disuelta en PBS estéril en la jeringa. Libere un pequeño volumen de endotelina-1 para observar una gota en la punta de la aguja, asegurando un buen flujo.

Baje la punta de la aguja más allá del cráneo hasta el orificio de la rebaba central sin perforar la duramadre. Una vez alineada, baja la aguja un milímetro en el cerebro. Con la jeringa Hamilton, dispense 0,1 microlitros a la vez y espere un minuto antes de inyectar los siguientes 0,1 microlitros.

Para evitar que la aguja se bloquee entre y después de las inyecciones, libere un pequeño volumen de endotelina-1 hasta que aparezca una gota en la punta de la aguja. Con un hisopo estéril, limpie el exceso de endotelina-1 antes de la inyección. Finalmente, sutura la piel recubierta en el cráneo usando una sutura estéril 4-0 para cerrar la herida.

Después de anestesiar el ratón tratado con endotelina-1, transfiera el ratón al marco estereotáxico. Con unas tijeras quirúrgicas, corte las suturas de la herida. Con fórceps, retire la costra y retraiga la piel para exponer el cráneo.

Luego, use un hisopo estéril para secar la superficie del cráneo y ubicar los orificios de rebaba. Coloque los brazos manipuladores del aparato estereotáxico. Coloque un soporte para agujas que lleve una jeringa de calibre 26 con una aguja que mida 0.375 pulgadas de largo.

Ahora, cargue 3,4 microlitros de solución de AAV en la jeringa. Baje la punta de la aguja más allá del cráneo hasta el primer orificio de rebaba más anterior. Asegúrese de que la aguja no perfore la duramadre, luego baje un milímetro en el cerebro.

Con la jeringa Hamilton, inyecte un microlitro de solución de AAV dispensando 0,1 microlitros a la vez, como se demostró anteriormente. A continuación, sutura la piel suprayacente del cráneo para cerrar la herida con una sutura de poliéster Polysorb 4-0. Retire el ratón del marco estereotáxico y transfiéralo a una jaula de alojamiento de animales limpia y precalentada en el área de recuperación.