Name: Sistemas AAV y modelos murinos para investigar la expresión ectópica de Neurod1 en células transducidas en momentos subagudos y crónicos posteriores al ictus isquémico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: Aprende a utilizar vectores AAV y modelos murinos para investigar la expresión ectópica de Neurod1 en células transducidas tras ictus isquémico. Este método evalúa la recuperación neuronal y la mejora de la función motora en fases subaguda y crónica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Sistemas AAV y modelos de ratón para estudiar la expresión ectópica de Neurod1 después de un accidente cerebrovascular

<ol><li>GBD 2016 Stroke Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+burden+of+stroke%2C+1990-2016%3A+A+systematic+analysis+for+the+global+burden+of+disease+study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016.</a> Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).</li>
<li>Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+stroke%3A+Mechanisms%2C+modulation%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential.</a> J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).</li>
<li>Kuriakose, D., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+treatment+of+stroke%3A+Present+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives.</a> Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).</li>
<li>Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+degeneration+of+neurons+in+the+penumbra+region+following+a+small%2C+focal+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke.</a> Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).</li>
<li>Burda, J. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+gliosis+and+the+multicellular+response+to+CNS+damage+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease.</a> Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).</li>
<li>Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin-1+and+endothelin+receptor+antagonists+in+inflammatory+response+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+scar+is+more+than+just+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The glial scar is more than just astrocytes.</a> Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
<li>Adams, K. L., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+and+disparity+of+the+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The diversity and disparity of the glial scar.</a> Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).</li>
<li>Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+overview+of+neuroinflammation+in+an+experimental+mouse+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model.</a> Sci Rep. 9 (1), 507(2019).</li>
<li>Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+Bridging+the+gap+between+basic+science+and+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).</li>
<li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurod1+aav-based+gene+therapy+for+functional+brain+repair+after+ischemic+injury+through+in+vivo+astrocyte-to-neuron+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion.</a> Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).</li>
<li>Ghazale, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascl1+phospho-site+mutations+enhance+neuronal+conversion+of+adult+cortical+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo.</a> Front Neurosci. 16, 917071(2022).</li>
<li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+astrocyte+to+neuron+conversion+with+lineage+tracing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo.</a> Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).</li>
<li>Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aav+tools+fail+to+detect+neurod1-mediated+neuronal+conversion+of+muller+glia+and+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo.</a> EBioMedicine. 90, 104531(2023).</li>
<li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promise+for+neuronal+repair%3A+Reprogramming+astrocytes+into+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo.</a> Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).</li>
<li>Hickmott, J. W., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-to-neuron+reprogramming+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Glia-to-neuron reprogramming to the rescue.</a> Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).</li>
<li>Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+reactive+glia+into+iPSCs+to+produce+new+neurons+in+the+cortex+following+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury.</a> Sci Rep. 6, 22490(2016).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).</li>
<li>Livingston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+neurod1+is+sufficient+for+functional+recovery+following+a+sensory-motor+cortical+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke.</a> Biomedicines. 12 (3), 663(2024).</li>
<li>Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+through+in+vivo+cell+fate+reprogramming+for+neural+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair.</a> Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+conversion+of+striatal+astrocytes+into+gabaergic+neurons+in+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).</li>
<li>Roome, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+endothelin-1+model+of+forelimb+motor+cortex+stroke+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse.</a> J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).</li>
<li>Islam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+apoptosis+in+a+model+of+ischemic+stroke+leads+to+enhanced+cell+survival%2C+endogenous+neural+precursor+cell+activation+and+improved+functional+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes.</a> Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).</li>
<li>Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+post-stroke+behavior+in+mouse+models+of+focal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-titer+AAV+disrupts+cerebrovascular+integrity+and+induces+lymphocyte+infiltration+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102(2023).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).</li>
<li>Jiang, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+reactive+astrocytes+to+induced+neurons+enhances+neuronal+repair+and+functional+recovery+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke.</a> Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), e76310(2013).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+specificity+of+GFAP+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Expression specificity of GFAP transgenes.</a> Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).</li>
<li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+gene+delivery+to+the+brain+using+AAV+and+ultrasound+depends+on+serotypes+and+brain+areas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas.</a> J Control Release. 351, 667-680 (2022).</li>
<li>He, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+murine+genetic+background+in+adeno-associated+virus+transduction+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).</li>
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<li>Botterill, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+expression+of+cre-dependent+adeno-associated+viruses+in+wild-type+c57bl%2F6j+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice.</a> eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).</li>
<li>Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+astrocyte+subtypes+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain.</a> Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).</li>
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<li>Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+Impact+to+brain+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease.</a> Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).</li>
<li>Miller, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system.</a> Front Cell Neurosci. 12, 401(2018).</li>
<li>Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+advanced+age+upon+astrocyte-specific+responses+to+acute+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).</li>
<li>Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+tamoxifen-induced+cre+activity+and+its+effect+on+immune+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations.</a> Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).</li>
<li>Gresita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+efficiency+of+direct+reprogramming+of+astrocytes+into+neurons+in+the+brains+of+young+and+aged+mice+after+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia.</a> Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>#77 Broca (.018")</td><td>David Kopf Instruments</td><td>8177</td><td></td></tr><tr><td>AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCre</td><td>Vector&nbsp; </td> Sutura absorbible de Biolabs <td></td><td></td></tr><tr><td>con aguja Polysorb&trade; Poliéster CV-15 3/8 Aguja de punta cónica circular tamaño 4 - 0 Trenzado</td><td>Covidien</td><td>GL-881</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-NeuN (conejo)&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>ABN78&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Ratones</td><td>Charles River</td><td>027</td><td></td></tr><tr><td>Solución de clorhexidina</td><td>Partnar</td><td>PCH-020</td><td></td></tr><tr><td>Contec&trade; &nbsp; PREempt&trade; Solución desinfectante RTU</td><td>Fisher Scientific</td><td>29-636-6212</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>HM525 NX&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Endotelina 1</td><td>Millipore Sigma</td><td>05-23-3800-0.5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pluma Maquinilla de afeitar de seguridad Hojas de micrótomo</td><td>Pluma</td><td>12-631P</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Cubreobjetos: Rectángulos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje de fluorescencia</td><td>Agilent Technologies</td><td>S3023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Hamilton Hamilton Company</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>Taladro estereotáxico de alta velocidad</td><td>David Kopf Instruments</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Solución Metacam (Meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/5-GFAP-iCre</td><td>Vector Builder</td><td>P190924-1001suq</td><td></td></tr><tr><td>Pomada Polyderm USP</td><td>TARO</td><td>2181908</td><td></td></tr><tr><td>SOMNI Scientific&trade; &nbsp; La almohadilla térmica para temperatura animal</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-777-177</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos estereotáxicos</td><td>David Kopf Instruments Modelo</td><td>902</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio, blanco</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>tdTomato Reporter Ratones&nbsp;</td><td>El sistema</td><td></td> de anestesia para animales de laboratorio de mesa Jackson Laboratory 007914 <td></td></tr><tr><td>V-1</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr></tbody></table>

sistemas aav y modelos murinos para investigar la expresión ectópica de neurod1 en células transducidas en momentos subagudos y crónicos posteriores al ictus isquémico

AAV Systems and Mouse Models for Investigating Ectopic Expression of Neurod1 in Transduced Cells at Subacute and Chronic Times Post-Ischemic Stroke

Examinar los resultados celulares de la expresión ectópica de Neurod1 impulsada por el promotor corto de GFAP (gfaABC(1)D) en cepas reporteras de tdTom-Cre de tipo salvaje (C57BL/6J) y transgénicas (específicamente, B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 se utilizaron dos sistemas basados en AAV5 en ratones lesionados por ET-1 (Figura 1A-C). En un modelo subagudo de accidente cerebrovascular, Neurod1 se empaquetó en el sistema Cre-Flex AAV y se administró a ratones de tipo salvaje el día 7 después del accidente cerebrovascular (Figura 1B). El segundo vector Flex contiene la secuencia invertida para GFP impulsada por el promotor CAG que está flanqueada por sitios de recombinación heterotípicos y antiparalelos de tipo loxP (Figura 1B). Ambas construcciones virales se inyectan juntas al mismo tiempo después del accidente cerebrovascular. Una vez que Cre se expresa en las células transducidas, la GFP se invierte y se extirpa en los sitios de recombinación, orientando la secuencia en la dirección del sentido, lo que permite la expresión de GFP. Por lo tanto, las células que expresan Cre serán GFP positivas, lo que indica que han sido transducidas por los vectores Cre-Flex. En el modelo subagudo, los ratones se sacrificaron a los 21 días después de la transducción (es decir, 28 días después del accidente cerebrovascular), y el número de células transducidas (GFP+), así como el número de células NeuN+GFP+ (células transducidas que expresan NeuN), se contaron en el parénquima de los cerebros lesionados por el accidente cerebrovascular. Como se observa en la Figura 2A, las neuronas se pierden en el sitio de la lesión isquémica. La cuantificación de las células transducidas en el paradigma subagudo utilizando el sistema Cre-Flex AAV revela significativamente más neuronas marcadas (células NeuN+GFP+/GFP+) en los ratones tratados con Neurod1 en comparación con los ratones de control Stroke-Cre (43,05 +/- 5,50% frente a 18,43 +/- 3,03% de células NeuN+GFP+/GFP+, en Stroke-Neurod1 frente a Ratones tratados con Stroke-Cre (control), respectivamente) (p = 0,0172) (Figura 2B,C).
En un conjunto separado de experimentos, la conversión de AtN se realizó en un modelo crónico de accidente cerebrovascular (Figura 1B, C). El factor de transcripción Neurod1 se administró a ratones reporteros tdTom-Cre lesionados por ET-1 el día 21 después del accidente cerebrovascular (Figura 1C). De forma idéntica al sistema Cre-Flex utilizado en ratones de tipo salvaje, la expresión de Neurod1 fue impulsada por el promotor corto de GFAP. Sin embargo, en este sistema, se utilizó un único constructo de AAV con Cre recombinasa después de Neurod1 (Figura 1B). Por lo tanto, las células que expresan GFAP producirán Cre recombinasa, induciendo el reportero de tdTom, lo que indica células que han sido transducidas por AAV. Los ratones fueron sacrificados a los 77 días después del accidente cerebrovascular (8 semanas después del AAV) (Figura 1C). Como se observa en la Figura 3A, se observa una lesión cortical en el día 77 después del accidente cerebrovascular en ratones tdTom-Cre. Se cuantificó el número de células transducidas que expresan el marcador neuronal, NeuN+, (porcentaje relativo de células (NeuN+tdTom+/tdTom+) en la etapa crónica posterior al accidente cerebrovascular y se encontró que los ratones que recibieron Stroke-Neurod1 tenían significativamente más neuronas marcadas en comparación con los ratones de control Stroke-Cre (74,81 +/- 4,835% frente a 53,05 +/- 5,028% células NeuN+tdTom+/tdTom+ en Stroke-Neurod1vs. Ratones tratados con Stroke-Cre (control), respectivamente) (p = 0,0355) (Figura 3B, C).
En general, los resultados demuestran la transducción basal de las neuronas y un mayor número de células transducidas que expresan NeuN+ con la entrega de Neurod1 en las fases subaguda y crónica posterior al accidente cerebrovascular en ratones indicadores de tipo salvaje y tdTom-Cre, con dos sistemas diferentes basados en AAV.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig01.jpg"> 
Figura 1: Expresión ectópica de Neurod1, vectores y líneas de tiempo. (A) Representación gráfica de la inducción de un accidente cerebrovascular mediante la inyección de endotelina-1 (ET-1) en la corteza motora del ratón. El virus adenoasociado (AAV) se administra en 3 sitios, en el sitio de inyección de ET-1, así como en los sitios que rodean la lesión, 1 mm anterior y posterior. Panel ampliado que muestra células transducidas con AAV-Neurod1 en la corteza motora. (B) Esquema de los dos vectores AAV en el sistema Cre-Flex suministrados a ratones de tipo salvaje (panel superior). El vector 1 de AAV5 contiene el promotor corto de GFAP, el factor de transcripción Neurod1 y la secuencia de recombinasa Cre flanqueada por un sitio loxP (triángulo negro) y por un sitio lox2272 (triángulo blanco). El vector 2 de AAV5 lleva la secuencia reportera del gen GFP invertida flanqueada por un par de sitios loxP y lox2272. La transducción de ambos vectores en las células da como resultado la escisión e inversión mediada por Cre, lo que permite que la expresión de GFP marque las células transducidas. Neurod1 también se administró a ratones tdTom-Cre utilizando un vector AAV5 (panel inferior). En el vector 1 de AAV5 se empaquetan el promotor corto de GFAP, el factor de transcripción Neurod1 y la secuencia de recombinasa Cre. La expresión de Cre en las células transducidas impulsa la escisión del codón Stop en los sitios loxP (triángulo negro), lo que permite la expresión de tdTomato. (C) El sistema Cre-Flex se probó en ratones de tipo salvaje con AAV inyectados en el período subagudo posterior al accidente cerebrovascular (día 7 posterior al accidente cerebrovascular). Los ratones de tipo salvaje fueron sacrificados 21 días después de la transducción de AAV (28 días después del accidente cerebrovascular). El AAV se administró a los ratones tdTom-Cre en el período crónico posterior al accidente cerebrovascular (día 21 después del accidente cerebrovascular), y los ratones se sacrificaron 56 días después de la transducción del AAV (77 días después del accidente cerebrovascular). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig02v4.jpg"> 
Figura 2: La administración ectópica de Neurod1 utilizando AAV Cre-Flex en la fase subaguda posterior al accidente cerebrovascular conduce a un mayor número de células transducidas que expresan NeuN. (A) Inmunotinción de secciones cerebrales coronales a través de la corteza motora en el día 28 después del accidente cerebrovascular de ratones de control Stroke-Cre (izquierda) y Stroke-Neurod1 (derecha). Se observa pérdida neuronal en el sitio de la lesión (líneas blancas discontinuas). En la corteza se observan células transducidas (GFP+, verde), neuronas (NeuN+, rojo) y células NeuN+GFP+ (naranja) colocalizadas. Barras de escala: 250 μm. (B) Imágenes representativas del tejido cerebral de control Stroke-Cre (arriba) y Stroke-Neurod1 (abajo) que muestran neuronas (NeuN+, rojo) y GFP+ transducido por AAV (verde). Los recuadros delineados en blanco muestran un primer plano de las celdas de cada canal individual. Las puntas de flecha blancas indican células transducidas por AAV (GFP+). Las flechas blancas indican células NeuN+GFP+ colocalizadas. Barras de escala: 125 μm. (C) Cuantificación de células NeuN+GFP+/GFP+ en ratones Stroke-Cre y Stroke-Neurod1. N = 3 ratones por grupo. Los datos se representan como promedio ± SEM. Prueba de Shapiro-Wilk (p = 0,3223). Prueba t no apareada, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig03.jpg"> 
Figura 3: La administración ectópica de Neurod1 en ratones reporteros de tdTom-Cre en la fase crónica posterior al accidente cerebrovascular conduce a un mayor número de células transducidas que expresan NeuN. (A) Inmunotinción de secciones coronales del cerebro a través de la corteza motora en el día 77 después del accidente cerebrovascular en ratones de control Stroke-Cre y Stroke-Neurod1 . La pérdida neuronal se observa en el sitio de la lesión isquémica (líneas discontinuas blancas). Las células transducidas se marcan con tdTom (rojo) en el periinfarto. NeuN+tdTom+ (naranja) son células transducidas que expresan marcadores neuronales. Barras de escala: 250 μm. (B) Imágenes representativas del tejido cerebral de control Stroke-Cre (arriba) y Stroke-Neurod1 (abajo) que muestran neuronas (NeuN+, verde) y células transducidas AAV (tdTom+, rojo). Los recuadros delineados en blanco muestran un primer plano de las celdas de cada canal individual. Las puntas de flecha blancas indican células transducidas AAV (tdTom+). Las flechas blancas indican células NeuN+tdTom+ colocalizadas. Barras de escala: 125 μm. (C) La cuantificación de las células NeuN+tdTom+/tdTom+ en el paradigma crónico muestra significativamente más células transducidas que expresan NeuN+ (células NeuN+tdTom+/tdTom+) en los ratones tratados con Neurod1 . N = 3 ratones por grupo. Los datos se representan como promedio ± SEM. Prueba de Shapiro-Wilk (p = 0,2044). Prueba t no apareada, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Sistemas AAV y modelos murinos para investigar la expresión ectópica de Neurod1 en células transducidas en momentos subagudos y crónicos posteriores al ictus isquémico

Ectopic expression of neurogenic factors in vivo has emerged as a promising approach for replacing lost neurons in disease models. The use of neural basic ...

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Sistemas AAV y modelos murinos para investigar la expresión ectópica de Neurod1 en células transducidas en momentos subagudos y crónicos posteriores al ictus isquémico (Video) | JoVE Journal

Sistemas AAV y modelos murinos para investigar la expresión ectópica de Neurod1 en células transducidas en momentos subagudos y crónicos posteriores al ictus isquémico

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