Name: Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Aprende a editar genes en células T primarias mediante transducción retroviral y CRISPR-Cas9 para estudiar la diferenciación de Th17 in vitro. Este protocolo permite investigar la regulación genética de respuestas inmunes.

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<meta charset="utf8"></head><body>Transducción retroviral de ARN guía para la edición génica en la diferenciación Th17

<ol><li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th+17+cells+in+development%3A%3A+An+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li>
<li>Patel, D. D., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cell+pathway+in+human+immunity%3A+Lessons+from+genetics+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions.</a> Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+Th17+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgrna+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+t-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of t-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SAMHD1+restriction+by+flow+cytometry+in+human+myeloid+U937+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells.</a> J Vis Exp. (172), (2021).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+A+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+cas9+rna-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+helper+T+cells+as+a+genetic+approach+to+study+mechanisms+controlling+their+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function.</a> J Vis Exp. (117), e54698(2016).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+Rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+Size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters.</a> BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J Vis Exp. (44), 2307(2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Solarbio</td><td>E1170</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de células y tejidos de 100 mm</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010100</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes (Ácido libre, estéril)</td><td>Solarbio</td><td>H1090</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular y tisular de 24 pocillos</td><td>NEST</td><td>702002</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular y tisular de 48 pocillos</td><td>NEST</td><td>748002</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin Una solución (1.000x)</td><td>BioLegend</td><td>420601</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 anti-ratón Anticuerpo CD4 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td>100546</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD3e (145-2C11), grado funcional, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>16-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD44 (IM7), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0441-83</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD62L (L-selectina) (MEL-14), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0621-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto 2000</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (40 &mu; m)</td><td>biosharp</td><td>BS-40-CS</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (70 &mu; m)</td><td><a name="¡RANGO! B14">biosharp</a></td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5425&nbsp; Centrífuga R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q411-02</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II Kit de clonación de un solo paso</td><td>Vazyme</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; Células competentes</td><td>Sangon Biotech</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep de ARN de zol</td><td>directo ZYMO RESEARCH</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medio</td><td>BasalMedia</td><td>L110KJ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de aislamiento de células T CD4+ para ratones</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Tinte de viabilidad fijable eFluor 660</td><td>Invitrogen</td><td>65-0864-18</td><td></td></tr><tr><td>Kit de mini plásmido EndoFree II</td><td>TIANGEN</td><td>DP118-02</td><td></td></tr><tr><td>ExFect Transfection Reagent</td><td>Vazyme</td><td>T101-01</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, Premium Plus</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>FITC anticuerpo IL-17A antiratón (TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506907</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Macklin</td><td>F864792</td><td></td></tr><tr><td>HiScript IV RT SuperMix para qPCR?+limpiador de ADNg?</td><td>Vazyme</td><td>R423-01</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Beyotime</td><td>S1672</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Maokang Biotechnology</td><td>7/7/1950</td><td></td></tr><tr><td>Ratón GRCm38</td><td>NCBI</td><td>RefSeq v.108.20200622</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM Medio de suero reducido</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>medio de suero reducido</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-ratón Anticuerpo CD4 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>100531</tr><tr><td>PE/Cyanine7 anticuerpo CD25 de ratón (PC61)</td><td>BioLegend</td><td>102015</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 anticuerpo CD4 de ratón (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PMA/TPA&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>S1819</td><td></td></tr><tr><td>R26-CAG-Cas9 ratones&nbsp;</td><td>Centro de Organismos Modelo de Shanghái</td><td>Cat. Nº NM-KI-00120</td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante humana TGF-beta 1 (expresada por CHO), CF</td><td>R& D Systems</td><td>11409-BH</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Murine IL-6</td><td>PeproTech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de células de investigación</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de células de investigación</td><td>SONY</td><td>MA900</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>BasalMedia</td><td>L210KJ</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador SimpliAmp Sistema de PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Solución de piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Anticuerpo CD28 anti-ratón purificado (37.51)</td><td>BioLegend</td><td>102121</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purificado anti-ratón IFN-&gamma; Anticuerpo (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505847</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Anticuerpo IL-4 purificado contra el ratón (11B11)</td><td>BioLegend</td><td>504135</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ratón IL-12/IL-23 p40 purificado Ultra-LEAF (C17.8)</td><td>BioLegend</td><td>505309</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol (50 mM)</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr></tbody></table>

segmentación génica retroviral mediada por crispr/cas9 para el estudio de la diferenciación de th17 in vitro

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

En el estudio, clonamos el objetivo de sgRNA a Rorc y secuencias codificantes no dirigidas a sgRNA en el vector pMX-U6-MCS con proteína fluorescente mCherry (Figura 1A,B). La producción de retrovirus se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo descrito en la Figura 2. La transfección se inició el día 0 y la recolección retroviral se produjo el día 2. La eficiencia de la transfección se puede probar mediante la intensidad de fluorescencia de mCherry (Figura 1C). Antes de cosechar el virus, se clasificaron y activaron las células T CD4+ vírgenes. A continuación, estos linfocitos T CD4+ activados se infectaron mediante infección por espín, seguido de la continuación de los pasos de diferenciación descritos. Finalmente, se evaluó la eficiencia de la transducción y los resultados de la diferenciación mediante análisis de citometría de flujo y análisis de qPCR.
La Figura 3 ilustra la estrategia de compuerta aplicada para clasificar las células T CD4+ vírgenes. Después de seleccionar la población celular principal y las células singlete (como se muestra en las dos primeras puertas de la Figura 3), las células FVD-CD4+ se comprimieron para distinguir las células T CD4 en células polarizadas a Th17 de las de las APC. Finalmente, la IL-17A producida por las células T CD4 representa la eficiencia de diferenciación Th17, que indica la eficiencia de knockout. El porcentaje de células mCherry positivas refleja la eficiencia de la infección retroviral, mientras que la eficiencia de knockout se indica por el porcentaje de células IL-17A positivas. Para mejorar la viabilidad celular y minimizar la duración de la clasificación, los esplenocitos se enriquecieron utilizando un kit de aislamiento de células T CD4+ de ratón, lo que resultó en una eficiencia de enriquecimiento superior al 90%.
La eficacia de la infección por retrovirus, indicada por la presencia de células mCherry positivas, suele ser de alrededor del 40% (Figura 4A). Aunque la eficiencia de la infección se puede aumentar a través de la concentración del virus, este enfoque se produce a expensas de una duración experimental prolongada y costos más altos. En nuestros experimentos, las células infectadas cultivadas sin el cóctel de diferenciación celular Th17 sirvieron como control negativo de diferenciación Th17, designado como Th0. Se utilizó un sgRNA no dirigido como control positivo, denominado sgNT. Para la edición de genes, empleamos ARNg dirigido al gen RORγt (sgRNA-Rorc), lo que redujo significativamente la eficiencia de diferenciación de Th17 (Figura 4A). Esta intervención también condujo a una disminución sustancial en los niveles de expresión de Rorc e IL-17a (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig1.jpg"> 
Figura 1: Ejemplo de sgRNA subclonado en un vector retroviral y eficiencia de transfección. Se utilizó el vector pMX-U6-MCS como construcción inicial. El andamio de ARNg, junto con las secuencias de ARNg (la parte naranja) dirigidas al sitio codificado (A) y al Rorc (B), se insertaron aguas abajo del promotor U6 (la parte verde como sección para la secuenciación con cebadores U6). Las ubicaciones de los cebadores que contienen sgRNA y los sitios de cebadores de secuenciación se indican debajo del vector circular Los nombres completos de las abreviaturas en el plásmido son los siguientes. Abreviaturas: AmpR = resistencia a ampicilina, carbenicilina y antibióticos relacionados; LTR = repetición terminal larga; MMLVψ = señal de empaquetamiento del virus de la leucemia murina de Moloney; gag = gen gag truncado del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV) que carece del codón de inicio. (C) Imágenes microscópicas de mCherry en células Plat-E transfectadas con ADN plasmídico. Barra de escala: 500 px. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig2.jpg"> 
Figura 2: Ilustración esquemática del protocolo. El día antes de la transfección, la densidad de las células Plat-E debe ajustarse a un rango adecuado. Al día siguiente (día 0), realice la transfección y reemplace el medio 12 h después. El día 1, clasifique y active las células T ingenuas de ratones que expresan Cas9. Posteriormente (día 2), recoja el sobrenadante de cultivo que contiene el virus y combínelo con las células T activadas para la transducción retroviral. A continuación, las células infectadas se diferencian en células Th17 durante 3-4 días y se analizan mediante FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig3.jpg"> 
Figura 3: Estrategia de compuerta para clasificar las células T vírgenes CD4. La tinción de superficie se realizó en las células T CD4 enriquecidas para marcar CD4, CD25, CD44 y CD62L. La estrategia de compuerta empleada fue la siguiente: inicialmente, los linfocitos se comprimieron en función de los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral. Posteriormente, se identificaron células individuales utilizando FSC-H y FSC-W. A continuación, se comprimieron los linfocitos CD4+CD25- para excluir los linfocitos T reguladores (Tregs). Por último, se identificaron los linfocitos T CD44 CD62Lbajo y alto ingenuo. Las células T CD4+ vírgenes aisladas se recolectaron para experimentos posteriores. Abreviaturas: FSC = dispersión directa; SSC = dispersión lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig4.jpg"> 
Figura 4: Ejemplo de transducción exitosa de células T activadas y diferenciación Th17. (A) La eficiencia de diferenciación de Th17 se reduce significativamente, lo que es editado por el ARNg RORγt (activación en mCherry + IL-17a + población). (B) Expresión relativa de ARNm de Rorγt e IL-17a en Th0 (células infectadas cultivadas sin cóctel de diferenciación celular Th17), sgNT (sgRNA no dirigido) y sgRNA-Rorc (sgRNA dirigido al gen RORγt ). p &lt; 0,001 (prueba t de Student de dos colas no apareada; los datos se presentan como media ± SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Componentes de la reacción PCR</td>
			<td colspan="4">Programa de PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Volumen (μL)</td>
			<td>Paso</td>
			<td>Temp.</td>
			<td>Hora</td>
			<td>Ciclo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 × Phanta Mix (Tinte Plus)</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>3 minutos</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH20</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>15 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imprimación-F (10 μM)</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>56 ºC</td>
			<td>15 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Imprimación-R (10 μM)</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">4</td>
			<td rowspan="2">72 ºC</td>
			<td rowspan="2">5 min 30 s</td>
			<td>Ir al paso 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 ×</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plantilla (~30 ng)</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>72 ºC</td>
			<td>5 minutos</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>12 ºC</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Componentes de reacción de PCR y programa de PCR para la construcción de vectores de ARNg.

Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro

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