Name: Electroporación basada en sustrato poroso con monitoreo de impedancia eléctrica transepitelial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprende la electroporación en sustrato poroso con monitoreo de impedancia eléctrica transepitelial para neurociencia y biología celular. Este método optimiza la entrega celular manteniendo alta viabilidad.

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<meta charset="utf8"></head><body>Método TEEI para el análisis de electroporación y predicción de entregas en celdas A431

<ol><li>Brooks, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+highly+controllable+methods+for+in+vitro+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery.</a> Small. 16 (51), e2004917(2020).</li>
<li>Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+by+membrane+disruption%3A+Mechanisms%2C+strategies%2C+and+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts.</a> Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).</li>
<li>Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+electroporation-mediated+molecular+uptake+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability.</a> Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).</li>
<li>Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+electric+field+and+anomalous+heating+caused+by+exponential+pulses+with+aluminum+electrodes+in+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+damage+and+cargo+delivery+in+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation.</a> Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanoscale+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanoscale electroporation.</a> Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).</li>
<li>Patino, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-throughput+localized+electroporation+workflow+with+deep+learning-based+analysis+for+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering.</a> Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).</li>
<li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion force microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).</li>
<li>Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+membrane-based+culture+substrate+for+localized+in+situ+electroporation+of+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B%3A+Chem%22%5BJournal%5D)">A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells.</a> Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).</li>
<li>Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+numerical+and+experimental+investigation+of+localized+electroporation-based+cell+transfection+and+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling.</a> ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalent+circuit+model+for+localized+electroporation+on+porous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates.</a> Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+impedance+increase+following+porous+substrate+electroporation+enables+label-free+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery.</a> Small. 20 (25), 2310221(2023).</li>
<li>Vindiš, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer+into+mammalian+cells+using+commercial+cell+culture+inserts+with+porous+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate.</a> Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).</li>
<li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+with+real-time+impedance+assessment+using+a+constriction+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel.</a> Micromachines. 11 (9), 856(2020).</li>
<li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).</li>
<li>Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tight+junctions+and+loss+of+barrier+function+in+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).</li>
<li>Hunter, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+RJ+%22Zeta+potential+in+colloid+science%3A+Principles+and+applications%22">Zeta potential in colloid science: Principles and applications</a>. 2, Academic Press. (2013).</li>
<li>Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetics+in+microdevices+for+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%2FASME+Trans+Mechatron%22%5BJournal%5D)">Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications.</a> IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).</li>
<li>Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+cell+swelling+for+osmotic+imbalance+induced+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation.</a> Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).</li>
<li>Fox, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cells in microfluidic devices: A review.</a> Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).</li>
</ol>

La electroporación es una técnica en la que las células se exponen a un campo eléctrico, creando poros temporales en la membrana celular a través de los cualespueden pasar las cargas, incluidas las proteínas, el ARN y el ADN. La versión más utilizada es la electroporación a granel (BEP). La BEP se realiza llenando una cubeta con un electrolito que contiene millones de células, exponiendo el electrolito a alto voltaje y permitiendo que la carga entre en las células a través de la difusión oendocitosis. El BEP tiene muchas ventajas, como el alto rendimiento y los numerosos sistemas disponibles en el mercado. Sin embargo, existen limitaciones en la entrega de BEP. El posicionamiento inconsistente de la celda en relación con los electrodos y el blindaje del campo eléctrico de las celdas adyacentes causan una variabilidad significativa en la exposición al campo eléctrico durante BEP 3,4. El alto voltaje requerido para BEP también tiene un impacto negativo significativo en la viabilidad de la celda5. Desde su creación en 20116, ha habido un creciente interés en un método de electroporación llamado electroporación de sustrato poroso (PSEP), aunque a veces se le conoce con otros nombres, como electroporación localizada y nano o microelectroporación 1,7,8. A diferencia de la suspensión celular de BEP, la PSEP se lleva a cabo en células que se adhieren a un sustrato poroso. No solo se prefiere un estado adherente para la mayoría de las líneas celulares humanas9, sino que los poros del sustrato también se centran en la corriente eléctrica, localizando el potencial eléctrico transmembrana (TMP) en regiones específicas de la membrana celular10,11. Esta localización permite una reducción significativa en el voltaje aplicado, disminuyendo el daño y aumentando la viabilidad de la celda. Esta combinación de efectos ayuda a controlar el desarrollo de los poros de la membrana celular, lo que resulta en una entrega más consistente y eficiente 1,5,12.
Un estudio reciente introdujo un dispositivo PSEP con una guía de electrodos chapada en oro de seis pocillos para sostener insertos de membrana porosa disponibles comercialmente13 (Figura 1A,B), una práctica que fue introducida por primera vez por Vindis et al.14. El dispositivo puede aplicar pulsos y medir la impedancia eléctrica a través de la monocapa de la célula, conocida como impedancia eléctrica transepitelial (TEEI), en tiempo real13. La interfaz de usuario del dispositivo permite un control completo sobre la forma de onda y la polaridad de la electroporación. Es importante destacar que las mediciones de impedancia en tiempo real se pueden utilizar para predecir los resultados de la entrega sin la necesidad de reactivos costosos o marcadores fluorescentes, un concepto conocido como administración sin etiquetas15.
La plataforma PSEP consta de dos componentes eléctricos principales personalizados: el cuerpo principal del dispositivo, que alberga el generador de pulsos y el equipo de medición TEEI, y la guía de electrodos, donde se insertan los sustratos porosos y se produce la electroporación. Los diagramas para todos los componentes electrónicos personalizados e impresos en 3D se pueden encontrar en GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. Además de la electrónica personalizada, también se requiere una computadora para que la plataforma funcione correctamente. El software personalizado requiere MATLAB (versión 2021a o posterior) para ejecutarse y Microsoft Excel para almacenar y acceder a los datos para su análisis. El programa controla la electrónica personalizada y proporciona la interfaz gráfica de usuario (GUI) para ajustar la configuración. Estos programas también estuvieron disponibles en GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.
Los datos preliminares sugieren que este proceso es posible para diferentes tipos de células adherentes (Figura 1C), pero en este artículo solo se discutirá la preparación de células A431 utilizando parámetros que Brooks et al.13 encontraron óptimos para esta línea celular. Además, debido a que la carga de yoduro de propidio (PI) es citotóxica, se realizan dos experimentos, el primero con un medio de transfección de PI de alta concentración para cuantificar la eficiencia de la entrega, y el segundo con solo medios de cultivo celular para medir TEEI en escalas de tiempo más largas. Estos experimentos utilizan formas de onda de electroporación idénticas, lo que permite correlacionar los resultados (Figura 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de ensamblaje de la guía de electrodos y datos fundamentales. (A) Modelo CAD de un inserto dentro de un pocillo de la guía de electrodos. (B) Modelo CAD de la guía de electrodos. (C) Aumento de impedancia debido a PSEP para líneas celulares seleccionadas, n = 3 por línea celular. Barra de error: error estándar de la media. (D) Eficiencia de entrega vs. TEEI aumentar los datos de correlación. La eficiencia de la entrega se calculó dividiendo el número de células marcadas en las imágenes de PI y calceína de los experimentos de entrega por el número total de células identificadas con Hoechst. El recuento de células se determinó utilizando una canalización CellProfiler personalizada, n = 6 por voltaje. Barra de error: (eje x e y) error estándar de la media. Esta figura se reproduce de Brooks et al.13 con permiso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga cónico de 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro Desechable de 2 Chips</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Matraz de cultivo de tejidos</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>A431 Celdas</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Calceína AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>Cabina de bioseguridad Clase II Tipo A2</td><td>Labgard</td><td>NU-543-600</td><td></td></tr><tr><td>Componentes personalizados</td><td>YangLab</td><td></td><td>https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga desechable (50 mL)</td><td>fisherbrand</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>A5670401</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de aspiración de fluidos</td><td>VACUubrand</td><td>20727403</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 240i</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Plasma humano Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FIBRP-RO</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente invertido</td><td>Zeiss</td><td>491916-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Labomed</td><td>TCM 400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cytiva</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PCR 200 y micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>72.737</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta (0.2-2 &micro; L)</td> <td>pipeta</td><td>de FBE00002</td><td></td>Elite de la marca</tr> fisher <tr><td>(100-1000 y micro; L)</td> <td>pipeta</td><td>de FBE01000</td><td></td>Elite de fisherbrand</tr><tr><td>(20-200 y micro; L)</td><td>pipeta de FBE00200</td><td></td><td></td>Elite de la marca</tr> fisher <tr><td>(2-20 y micro; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>Iduro de propidio</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de reacción 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall ST 16R Thermo</td><td>Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Thincert (24 pocillos)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662 641</td><td>0,4 y micro; m diámetro de poro, 2x106</s> cm-2</td></tr> densidad de poros, transparente <tr><td>Placa de cultivo de tejidos de PET (24 pocillos)</td><td>fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>Solución azul de tripano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20mL</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

electroporación basada en sustrato poroso con monitoreo de impedancia eléctrica transepitelial

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

El protocolo dado establece un método para utilizar las mediciones TEEI para examinar los procesos intermedios de electroporación y hacer predicciones de entrega, específicamente para la línea de celdas A431 y la carga PI. Si bien la modificación de este protocolo se discute más adelante en el artículo, es importante tener en cuenta ahora que, si bien los valores específicos pueden cambiar, las tendencias generales en la respuesta siguen siendo consistentes. Por ejemplo, los datos de TEEI que caen por debajo de la línea de base inicial corresponden con la muerte celular, mientras que el aumento máximo en el valor de TEEI por encima del mínimo corresponde con la eficiencia de entrega13. Estas tendencias generales y sus implicaciones se analizan a continuación.
Como se muestra en la Figura 2A, puede surgir una serie de tendencias de medición de TEEI e imágenes celulares mientras se utiliza la plataforma PSEP. El resultado ideal de este protocolo es producir una curva similar a los datos saludables optimizados que se muestran en la Figura 2Ai. Este se caracteriza como el resultado ideal, ya que no hay una caída por debajo de la línea de base, lo que indica muy poca o ninguna muerte celular. Además, la curva saludable optimizada tiene el mayor aumento en TEEI desde el mínimo, lo que indica un alto grado de eficiencia en la entrega13. Estas inferencias están respaldadas por las imágenes posteriores a PSEP de la monocapa celular, que revelan una muerte celular insignificante y una monocapa celular sana y completamente confluente (Figura 2Aiii). Además, las imágenes que se muestran en la Figura 2B pueden caracterizar un experimento de entrega exitoso utilizando formas de onda PSEP idénticas. La aplicación adecuada de la forma de onda de electroporación y la concentración de la carga dan como resultado un alto grado de consistencia de entrega y viabilidad de la celda.
La salud y la confluencia de la monocapa celular son críticas para la aplicación exitosa de las predicciones de entrega basadas en TEEI16,17. Incluso con una forma de onda optimizada, una monocapa celular incorrecta o incompleta da como resultado una respuesta TEEI disminuida, como se ilustra en los datos optimizados y saludables de la Figura 2Aii. Sin embargo, obsérvese que las imágenes de este resultado (Figura 2Avi) siguen correspondiendo a la interpretación de la respuesta TEEI dada por Brooks et al.13. No hay una caída por debajo de la línea de base, lo que indica una muerte celular cercana a cero (Figura 2C, D). Además, el aumento reducido desde el mínimo corresponde a un impacto negativo en la eficiencia de la entrega, ya que menos celdas en la monocapa reducen la entrega total de PI (Figura 2C, D).
Si se aplica una forma de onda no optimizada, es posible ver disminuciones aún más significativas en la respuesta TEEI. Dependiendo de la energía total y el período de tiempo en el que se aplica, las formas de onda no optimizadas pueden producir resultados que van desde la disminución de la eficiencia hasta la aniquilación casi total de la monocapa celular (Figura 2Ai, iii, v). Tanto las curvas no optimizadas como las muy no optimizadas muestran una disminución significativa desde la línea de base, lo que indica una muerte celular sustancial. Sin embargo, las formas de onda cada vez más no optimizadas impiden la recuperación de las células, lo que resulta en una disminución de la eficiencia de la entrega.
La eficiencia de la entrega se calculó dividiendo el número de células marcadas en las imágenes de PI y calceína de los experimentos de entrega por el número total de células identificadas con Hoechst. La muerte se calculó tomando las células marcadas con PI en los experimentos de medición de TEEI y dividiéndolas por el número total de células identificadas con Hoechst. El recuento de células se determinó mediante una canalización personalizada de CellProfiler para ambas métricas.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig02.jpg"> Figura 2: Curvas de respuesta TEEI e imágenes para condiciones comunes. (A) (i) Datos de respuesta TEEI que ilustran el cambio porcentual de TEEI para condiciones optimizadas y no optimizadas. (ii) Comparación de la respuesta TEEI entre monocapas sanas y no saludables en condiciones de forma de onda optimizada. (iii-v) Imágenes representativas de resultados potenciales para condiciones de forma de onda optimizadas y no optimizadas que muestran la muerte celular (rojo) y las células vivas (verde). (vi) Imágenes representativas de monocapa en mal estado después de aplicar condiciones de forma de onda optimizadas que muestran la muerte celular (rojo), células vivas (verde). (B) Imágenes que muestran la administración exitosa de PI (rojo), células vivas (verde) y ubicaciones de núcleos (azul). Todas las imágenes se iluminaron para mayor claridad. Barras de escala: 1000 μm. (C) Disminución de TEEI desde la línea de base anterior a PSEP hasta el mínimo posterior a PSEP y aumento desde el mínimo posterior a PSEP hasta el pico posterior a PSEP para voltajes dados. (D) Eficiencia de entrega y porcentajes de muerte de celda para voltajes dados. Las barras de error representan el SEM (n = 6). (C,D) reproducido de Brooks et al.13 con permiso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Electroporación basada en sustrato poroso con monitoreo de impedancia eléctrica transepitelial

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Muchas aplicaciones terapéuticas requieren un transporte seguro y eficiente de los portadores de fármacos y sus cargas a través de barreras celulares en el cuerpo. En este artículo se describe una adaptación de los métodos establecidos para evaluar la tasa y el mecanismo de transporte de nanovehículos drogas (NCS) a través de barreras celulares, tales como el tracto gastrointestinal (GI) epitelio.

Modelos y métodos para evaluar el transporte de Drug Delivery Systems a través de barreras celulares

El transistor orgánico electroquímico está integrado con células vivas y se utiliza para controlar el flujo de iones a través de la barrera epitelial intestinal. En este estudio, un incremento en el flujo de iones, relacionados con la alteración de las uniones estrechas, inducida por la presencia de la EGTA quelante de calcio (ácido etilenglicol-bis (beta-aminoetil éter)-N, N, N ', N'-tetra acético ácido), se mide.

Detección de barrera interrupción del tejido con un transistor orgánico Electroquímica

Este protocolo revisa eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección, un método para registrar y analizar el espectro de impedancia de las células adherentes para la cuantificación de la unión celular, la proliferación, motilidad, y las respuestas celulares a estímulos farmacológicos y tóxicos. La detección de la permeabilidad endotelial y la evaluación de los contactos célula-célula y célula-sustrato que se obtienen.

Eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección para la cuantificación de la proliferación endotelial, la función de barrera, y la motilidad

Aquí se presentan dos métodos para determinar la función de barrera intestinal. Un medidor epitelial (voltios/ohmios) se utiliza para la medición de la resistencia eléctrica transepitelial de epitelio cultivado directamente en los pocillos de cultivo de tejidos. En ratones, el método de sonda de FITC-los dextranos se utiliza para determinar la permeabilidad intestinal en vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

Aquí, demostramos cómo configurar un antímetro de voltios barato con frecuencia de salida programable que se puede utilizar con electrodos de palillo disponibles comercialmente para mediciones de resistencia eléctrica transepitelial/endotelial.

Un enfoque simple para realizar mediciones TEER utilizando un antímetro de voltios autohecho con frecuencia de salida programable

Aquí, describimos la preparación de monocapas epiteliales intestinales derivadas de organoides humanos para estudiar la función de barrera intestinal, la permeabilidad y el transporte. Como los organoides representan la respuesta original del tejido epitelial a los estímulos externos, estos modelos combinan las ventajas de la capacidad de expansión de las líneas celulares y la relevancia y complejidad del tejido primario.

Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal

Este protocolo describe las técnicas de microfabricación necesarias para construir un dispositivo de electroporación microfluídica de laboratorio en un chip. La configuración experimental realiza transfecciones controladas a nivel de una sola célula en un flujo continuo y se puede extender a rendimientos más altos con control basado en la población. Se proporciona un análisis que muestra la capacidad de monitorear eléctricamente el grado de permeabilización de la membrana celular en tiempo real.

La fabricación y operación de un sistema de microelectroporación de flujo continuo con detección de permeabilización

Para el estudio de las respuestas de las células excitables in vitro, el protocolo describe el seguimiento óptico de los cambios en la generación de potencial de acción debidos a la electroporación en un modelo simple de célula excitable simple de células HEK con spiging tet-on modificadas genéticamente, así como los cambios en el voltaje transmembrana con extracción automatizada de parámetros relevantes.

Monitoreo de cambios inducidos por electroporación en la generación de potencial de acción en celdas HEK de Tet-On Spiking diseñadas genéticamente

Este estudio describe un protocolo para generar monocapas 2D de organoides porcinos derivados del intestino delgado y grueso. El crecimiento de estas monocapas se caracteriza por el aumento de los valores de TEER, lo que indica una sólida integridad epitelial. Además, estas monocapas exhiben respuestas secretoras fisiológicas en experimentos en cámara de Ussing después de la aplicación de forskolina.

Organoides intestinales porcinos bidimensionales que reflejan las propiedades fisiológicas del intestino nativo

Este protocolo utiliza modelos computacionales para cuantificar umbrales de electroporación reversibles e irreversibles utilizando la distribución espacial de células transfectadas dentro de un imitador de tejido tridimensional para el análisis de alto rendimiento de protocolos de electroporación.

Modelo tisular tridimensional de alto rendimiento para la cuantificación de umbrales de electroporación

Aquí, presentamos un protocolo para fabricar un dispositivo microfluídico único de dos capas para estudiar la regulación electromecánica de la homeostasis del tejido epitelial. El dispositivo aplica corrientes eléctricas fisiológicas estáticas perpendiculares al plano tisular, lo que afecta la adhesión, proliferación y extrusión célula-célula. Las imágenes de células vivas y las mediciones de estrés mecánico revelan mecanismos de estos procesos.

Revelando el control electromecánico de la homeostasis tisular mediante un dispositivo microfluídico de dos capas

Aprende la electroporación en sustrato poroso con monitoreo de impedancia eléctrica transepitelial para neurociencia y biología celular. Este método optimiza la entrega celular manteniendo alta viabilidad.

Electroporación basada en sustrato poroso con monitoreo de impedancia eléctrica transepitelial

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