Name: Protocolo optimizado para rollos suizos intestinales y tinción inmunofluorescente de tejido incluido en parafina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende la técnica de rollos suizos intestinales y tinción inmunofluorescente en tejido de ratón incluido en parafina. Este protocolo permite visualizar todas las regiones intestinales en un solo bloque con resultados reproducibles.

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Este estudio fue apoyado por las subvenciones K01 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) DK121869 a ACE y esta publicación fue apoyada en parte por T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) y las subvenciones fundamentales de HCS a SAD & RS. Este trabajo contó con el apoyo de fondos iniciales de la Universidad Médica de Carolina del Sur (MUSC) para ACE y contó con el apoyo del Centro Central de Investigación de Enfermedades Digestivas de MUSC (P30 DK123704) y el COBRE en Enfermedades Digestivas y Hepáticas (P20 GM120475). Las imágenes se realizaron utilizando el núcleo de imágenes celulares y moleculares del MUSC.

Método eficiente de Swiss Roll para la inmunotinción de alta calidad del tejido intestinal

<ol><li>Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiating+intestinal+epithelial+cell%3A+Establishment+and+maintenance+of+functions+through+interactions+between+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures.</a> Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).</li>
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<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+the+immunohistochemical+detection+of+infectious+agents+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).</li>
<li>Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fixation+time+and+enzymatic+digestion+on+immunohistochemical+demonstration+of+bromodeoxyuridine+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochemis%22%5BJournal%5D)">Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).</li>
<li>Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+formalin+tissue+fixation+and+processing+on+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry.</a> Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).</li>
<li>Scalia, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+masking+during+fixation+and+embedding%2C+dissected%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen masking during fixation and embedding, dissected.</a> J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).</li>
<li>Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+fixation%2C+antibody+clones%2C+and+signal+amplification+on+steroid+receptor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis.</a> Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).</li>
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<li>Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+area+assessment+of+the+murine+intestinal+tract+as+a+prerequisite+for+oral+dose+translation+from+mouse+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals%22%5BJournal%5D)">Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man.</a> Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).</li>
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<li>Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgf-beta+i+promotes+islet+beta-cell+function+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration.</a> J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).</li>
<li>Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+inherent+niches+in+3d+multicellular+msc+spheroids+reconfigures+metabolism+and+enhances+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential.</a> Cells. 10 (10), 2747(2021).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd36+inhibits+beta-catenin%2Fc-myc-mediated+glycolysis+through+ubiquitination+of+gpc4+to+repress+colorectal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 3981(2019).</li>
<li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+colitis+modeling+using+dextran+sulfate+sodium+%28dss%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss).</a> J Vis Exp. (35), e1652(2010).</li>
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<li>Le Naour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+swiss-rolling+method+for+histological+analyses+of+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue.</a> MethodsX. 9, 101630(2022).</li>
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<li>Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+antigen+retrieval+protocols+on+the+immunohistochemical+detection+of+epigenetic+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications.</a> Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).</li>
<li>Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+techniques+for+a+comprehensive+gut+histopathological+analysis%3A+Swiss+roll+versus+intestine+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips.</a> Exp Mol Pathol. 111, 104302(2019).</li>
<li>Bolognesi, M. aO., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+validated+for+routinely+processed+tissues+stain+frozen+sections+unpredictably%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Techniques%22%5BJournal%5D)">Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably.</a> Bio Techniques. 3 (3), 137-148 (2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, presentamos un método optimizado para la fijación de tejidos utilizando la técnica del rollo suizo para preservar la arquitectura intestinal y promover una inmunotinción precisa. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para investigar una amplia variedad de cuestiones de investigación relacionadas con la fisiología intestinal y la biología celular19. Se han publicado varios métodos de laminación suizos optimizados que son muy útiles20,21. Una ventaja de esta técnica es la facilidad de abrir con precisión el intestino en papel de filtro. Esto permite que el tejido se fije plano, evitando que el tejido se curve hacia adentro al rodar, lo que es especialmente útil cuando se analiza tejido inflamado con músculos engrosados. Además, es esencial destacar el papel fundamental del corte de tejidos para lograr resultados fiables. El corte adecuado garantiza la preservación de la arquitectura del tejido y facilita la inmunotinción precisa, lo que en última instancia contribuye al éxito de los análisis posteriores11. El enfoque optimizado es menos difícil en comparación con otros protocolos, lo que produce resultados consistentes entre diferentes individuos. La técnica propuesta en este artículo también proporciona una arquitectura de tejido bien conservada, versatilidad e inmunotinción altamente reproducible utilizando diversos anticuerpos.
Un aspecto crítico de este protocolo es el tiempo de fijación y procesamiento. La fijación y el procesamiento inadecuados de los tejidos pueden perjudicar los análisis histoquímicos. El tejido que está demasiado fijado se vuelve quebradizo, mientras que el tejido poco fijado permanece demasiado blando. Tanto los tejidos sobrefijados como los subfijados son difíciles de seccionar y comprometen la inmunotinción. Una vez diseccionado en papel de filtro, el tejido debe colocarse inmediatamente en formol para reducir las alteraciones post-mortem22. En este protocolo, el tejido murino se fija en formol durante la noche. Varios estudios han utilizado este tiempo de fijación 20,23,24. Sin embargo, Boenisch et al. demostraron que la inmunotinción es consistente en el tejido fijado en formol hasta por 4 días25. Se requiere la optimización del tiempo de fijación y del fijador en función de los análisis deseados. Por ejemplo, el fijador de Carnoy es a menudo el preferido para las manchas de moco26. La elección de los fijadores y la duración del tiempo de fijación deben ser optimizadas por cada investigador en función de su enfoque experimental. Se recomienda el uso de un procesador de tejidos automatizado para garantizar tiempos de procesamiento precisos y consistentes. Nuestro laboratorio utiliza pequeños alfileres para mantener el tejido intestinal en su lugar como rollos. Sin alfileres, el tejido puede desenrollarse durante el procesamiento. Como estos alfileres son bastante pequeños y afilados, se deben tomar precauciones. Aconsejamos utilizar cortadores de alambre para quitar el extremo afilado del alfiler antes del procesamiento del tejido. Algunos núcleos histológicos no aceptan tejido con clavos; Por lo tanto, es mejor verificar antes de usar. Un enfoque alternativo es usar agar para anclar el tejido antes de procesar27 o se podrían usar esponjas de casete en casetes para ayudar a mantener los rollos.
La inmunotinción es un protocolo que requiere optimización para cada anticuerpo. Se recomienda el uso de anticuerpos validados por knockout siempre que sea posible. Este método para la fijación y el procesamiento de tejidos da como resultado una tinción clara, lo que permite una fácil identificación de la unión de anticuerpos en comparación con la señal de fondo cuando se utilizan anticuerpos no validados. La elección del fijador, la recuperación del antígeno y la dilución del anticuerpo pueden afectar a la especificidad del anticuerpo. Recomendamos que los investigadores evalúen cuidadosamente y optimicen el protocolo ajustando la fijación, la recuperación de antígenos y el tiempo de incubación de cada anticuerpo. Para obtener los mejores resultados, los anticuerpos deben probarse en varias diluciones para determinar la concentración óptima y en diferentes tampones de recuperación de antígenos. La recuperación de epítopos mejora la inmunotinción al romper los puentes de metileno formados durante la fijación. En este protocolo, se utiliza la recuperación de epítopos inducida por calor en lugar de la recuperación de epítopos inducida por proteolíticos porque es más probable que la digestión enzimática altere la morfología del tejido28. Los tampones de recuperación de epítopos inducidos por el calor más comunes son el tampón citrato, el tris-HCl y el tris-EDTA, siendo el tampón citrato el más suave para la morfología tisular29. La elección del tampón varía y debe determinarse para cada anticuerpo. Muchos tampones de recuperación de antígenos, soluciones de bloqueo y diluyentes de anticuerpos están disponibles comercialmente. Sin embargo, estas soluciones pueden ser extremadamente costosas y prohibitivas. Proporcionamos recetas de soluciones comunes de recuperación de antígenos y soluciones de bloqueo y diluyentes de anticuerpos para garantizar la rentabilidad. 
Una limitación de este método es que la fijación y el procesamiento pueden alterar el tejido y enmascarar los epítopos. Un enfoque alternativo es la inmunotinción de tejido fresco congelado. El tejido fresco congelado se congela rápidamente, lo que permite evitar la exposición a fijadores tóxicos, preservar la estructura de la proteína y mejorar la accesibilidad de algunos epítopos. Sin embargo, la arquitectura y la morfología de los tejidos son más pobres que las del tejido fijo e incluido en parafina. Otros desafíos del papel tisú fresco congelado incluyen los materiales y la logística necesarios para seccionar y almacenar bloques y portaobjetos congelados. El análisis de los rollos suizos frente a las tiras de tejido intestinal muestra diferencias en la altura y anchura de las vellosidades y diferencias en las células inmunitarias de la lámina propia, como se describe en un informe anterior30. Estos resultados sugieren que los panecillos suizos intestinales alteran algunas características intestinales, que deben tenerse en cuenta a la hora de planificar experimentos. Además, se requiere la revalidación de anticuerpos, ya que muchos anticuerpos que se unen específicamente al tejido incluido en parafina fijado en formalina no se tiñen bien en el tejido fresco congelado31.
La inmunotinción del tejido intestinal se puede utilizar para responder a una amplia variedad de preguntas sobre la biología y la fisiología de las células gastrointestinales. Esta técnica es ampliamente utilizada para identificar alteraciones epiteliales en el contexto de la inflamación intestinal, después de una infección bacteriana y durante la progresión del cáncer. El método presentado aquí es ideal para la preservación del tejido intestinal porque es rentable, no es técnicamente desafiante y es altamente reproducible. Para garantizar los mejores resultados, fomentamos la optimización de los pasos descritos en este protocolo en función del diseño experimental y la hipótesis que se está probando.

La arquitectura celular del intestino plantea un desafío único para mantener su integridad estructural cuando el tejido intestinal se preserva para la inmunotinción. El intestino delgado está formado por estructuras alargadas en forma de dedos conocidas como vellosidades1. Estas vellosidades a menudo se deforman durante los procesos de incrustación. Asegurarse de que los investigadores dispongan de técnicas para incrustar correctamente los intestinos con el fin de lograr secciones transversales, lo que permite la visualización de todas las regiones del intestino, así como de las capas que componen el intestino (es decir, la muscular propia, la mucosa y la serosa), es crucial para un análisis experimental sólido2. La fijación inadecuada, la fijación excesiva y el manejo inadecuado de los tejidos comprometerán la integridad del tejido, lo que provocará daños inadvertidos en el epitelio intestinal 3,4. El daño del epitelio intestinal durante estos pasos puede disminuir significativamente la calidad de los análisis posteriores, como la inmunofluorescencia, independientemente de la eficacia de los protocolos de inmunohistoquímica y de los anticuerpos empleados.
La inmunotinción, al igual que la fijación adecuada de los tejidos, es una parte importante de la investigación biomédica. Cuando se hace bien, la inmunotinción puede iluminar aspectos previamente desconocidos de la estructura y función celular. La tinción con inmunofluorescencia de secciones de parafina puede ser un desafío debido a las modificaciones fisicoquímicas resultantes del proceso de fijación e inclusión de parafina5. La fijación y la inclusión de parafina dan como resultado un enmascaramiento de antígenos que puede interferir con la inmunofluorescencia, la detección de epítopos de interés6. La fijación tardía puede inducir la degradación proteolítica, lo que resulta en una tinción debilitada o ausente de los epítopos críticos7. Además, los anticuerpos suelen ser imprecisos con altos niveles de antecedentes. Los protocolos de inmunotinción que promueven la unión consistente y específica de anticuerpos y una alta relación señal-ruido pueden proporcionar información valiosa para los investigadores. 
Aquí, proporcionamos un protocolo integral diseñado para obtener imágenes de inmunofluorescencia de alta calidad a través de la fijación de tejido intestinal, la preparación de Swiss roll8 y la inmunotinción. Haciendo hincapié en las directrices para preservar la integridad del intestino, el protocolo tiene como objetivo proporcionar a los investigadores una metodología sólida para mejorar la calidad y la fiabilidad de los estudios de imágenes de inmunofluorescencia. También hemos buscado utilizar recursos rentables, incluido el papel de filtro y la recuperación casera de antígenos, soluciones de bloqueo y diluyentes de anticuerpos para hacer que el protocolo sea más accesible para los laboratorios que pueden tener fondos restringidos. Al igual que con todos los protocolos experimentales, los investigadores deben optimizar el protocolo actual en función de su enfoque experimental y las áreas de interés.

<table><tbody><tr><td>&beta;-CATENIN</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td> Papel de filtro de celulosa Cytiva 10427804 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Papel Whatman grueso</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio cargado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> 23888114 <td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>Pines de disección tamaño 00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>R& D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>Guantes para congelador</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor</td><td>Premiere</td><td>XH-2001</td><td>Calentador de diapositivas</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>64111-04</td><td>Reactivo de limpieza</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo hidrofóbico</td><td>Millipore</td><td>402176</td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>Casetes grandes</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>Pines de minucias</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9679721</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de bloqueo ratón contra ratón</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td>Bloque de ratón</td></tr><tr><td>contra ratón MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>PCNA</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>Olla a presión</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong oro antidecoloración</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Medio de montaje</td></tr><tr><td>Pinzas de acción inversa</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Gradilla de portaobjetos</td><td>Tissue-Tek</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Juego de tinción de portaobjetos</td><td>Tissue-Tek</td><td>62540-01</td><td>Platos resistentes a los disolventes y estructura metálica</td></tr><tr><td>Casetes pequeños</td><td>Fisherbrand</td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio dihidratado</td><td>Fisher Bioreactivos</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Teleostein Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>Tampón de bloqueo</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Fisher Chemical</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-ACTIN</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo optimizado para rollos suizos intestinales y tinción inmunofluorescente de tejido incluido en parafina

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

El intestino es un órgano complejo compuesto por el intestino delgado y el intestino grueso. El intestino delgado se puede dividir a su vez en duodeno, yeyuno e íleon. Cada región anatómica del intestino tiene una función única que se refleja en las diferencias en la estructura celular. La investigación de los cambios en el intestino requiere un análisis en profundidad de las diferentes regiones de los tejidos y las alteraciones celulares. Para estudiar el intestino y visualizar grandes trozos de tejido, los investigadores suelen utilizar una técnica conocida como rollos suizos intestinales. En esta técnica, el intestino se divide en cada región anatómica y se fija en una orientación plana. Luego, el tejido se enrolla cuidadosamente y se procesa para su inclusión en parafina. La fijación y orientación adecuadas del tejido es una técnica de laboratorio que a menudo se pasa por alto, pero es de vital importancia para el análisis posterior. Además, el laminado inadecuado del tejido intestinal puede dañar el frágil epitelio intestinal, lo que conduce a una mala calidad del tejido para la inmunotinción. Asegurar un tejido bien fijado y orientado correctamente con estructuras celulares intactas es un paso crucial que garantiza una visualización óptima de las células intestinales. Presentamos un método rentable y sencillo para hacer panecillos suizos para incluir todas las secciones del intestino en un solo bloque incrustado en parafina. También describimos la tinción optimizada con inmunofluorescencia del tejido intestinal para estudiar diversos aspectos del epitelio intestinal. El siguiente protocolo proporciona a los investigadores una guía completa para obtener imágenes de inmunofluorescencia de alta calidad a través de la fijación de tejido intestinal, la técnica de rollo suizo y la inmunotinción. El empleo de estos enfoques refinados preserva la intrincada morfología del epitelio intestinal y fomenta una comprensión más profunda de la fisiología y la patobiología intestinales.

Se realizó tinción con hematoxilina y eosina (H&amp;E), como se describió previamente12. Utilizando el método optimizado, los panecillos suizos intestinales incluían los tres segmentos del intestino delgado y el intestino grueso en un solo portaobjetos. Tener todo el intestino acomodado en un portaobjetos permite a los investigadores analizar los cambios en todas las partes del intestino y ahorra costos en reactivos de corte y tinción (Figura 1). Además, exponer todos los segmentos intestinales a las mismas soluciones simultáneamente durante la inmunotinción ayuda a garantizar resultados precisos. La micrografía de H&amp;E muestra la arquitectura intestinal preservada de todas las porciones del intestino delgado y del intestino grueso (Figura 2). La medición de las vellosidades duodenales no mostró diferencias significativas en la altura de las vellosidades en el tejido intestinal no abierto en comparación con este método de rollo suizo, lo que sugiere que la apertura del intestino no altera la arquitectura del tejido (Figura 2D). La inmunotinción de rollos suizos intestinales muestra las distintas capas del intestino, así como todo el eje de la cripta vellosa. Las imágenes fluorescentes muestran niveles bajos de fondo de la tinción de anticuerpos primarios y secundarios y representan claramente las células individuales presentes en el epitelio. En la figura 3 se muestra la morfología de los diferentes segmentos intestinales y la tinción de las células caliciformes (células MUC2 positivas)13, la membrana apical (γ-ACTINA)14, la membrana lateral de las células epiteliales (E-CADHERINA)15 y los núcleos. Este protocolo es adecuado para identificar muchos compartimentos celulares diferentes, incluyendo células proliferativas (PCNA)16, intersticio (LAMININ; Figura 4A) 17, el dominio lisosomal (LAMP1)14 y el epitelio (β-CATENINA; Figura 4B) Artículo 18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo para la preparación y el procesamiento de panecillos suizos intestinales. (A) Los segmentos intestinales se lavan con una jeringa que contiene PBS y luego se lavan con PBS. (B) A continuación, el tejido intestinal húmedo se coloca sobre papel de filtro seco. (C) El intestino se corta longitudinalmente en papel de filtro y (D) se extiende suavemente. (E) Se coloca un pedazo de papel de filtro sobre el intestino abierto, y el intestino se intercala suavemente entre el papel de filtro y se grapa. Los segmentos intestinales se fijan durante la noche y (F) se enrolla con fórceps. (G) El intestino se desplaza suavemente de las pinzas de acción inversa y (H) tiene una apariencia de roseta. (I, J) El tejido intestinal se fija con alfileres y se coloca en un casete grande. (K) Los cuatro segmentos intestinales se colocan en el mismo casete para el procesamiento y la inclusión de tejidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig02v2.jpg"> Figura 2: Tinción de hematoxilina y eosina en los cuatro segmentos del intestino. (A) El escaneo de azulejos demuestra la capacidad de visualizar todo el intestino en un solo portaobjetos con rollos suizos individuales del duodeno, yeyuno, íleon y colon. (B) Micrografía de un rollo suizo intestinal y (C) recuadro de mayor aumento para mostrar la arquitectura de las vellosidades y las criptas. (D) La cuantificación de la longitud de las vellosidades del intestino delgado no muestra diferencias significativas entre el tejido suizo enrollado y el tejido sin abrir. Barras de escala = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig03.jpg"> Figura 3: Tinción con inmunofluorescencia de los cuatro segmentos del intestino. Los ratones control C57BL/6J adultos se inmunoteñieron para los núcleos (cian), el marcador de membrana lateral, E-CADHERIN (verde), las células caliciformes identificadas por MUC2 (amarillo) y el marcador de borde de cepillo apical, γ-ACTIN, (magenta). Barras de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig04.jpg"> Figura 4. Tinción de inmunofluorescencia del intestino. (A) Una micrografía representativa de la tinción de inmunofluorescencia del intestino del ratón destaca los núcleos (cian), las células proliferativas, PCNA (verde) y la lámina propia, LAMININA (magenta). (B) Imagen de inmunofluorescencia que identifica los núcleos (cian), el marcador de membrana celular β-CATENINA (verde) y el marcador de lisosoma LAMP1 (magenta) en el intestino. Barras de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El intestino es vital para la digestión y la absorción. Cada región (duodeno, yeyuno, íleon, colon) cumple funciones distintas debido a estructuras celulares únicas. El estudio de la fisiología intestinal exige un análisis meticuloso de los tejidos. Este protocolo describe la fijación y el procesamiento de tejidos mediante la técnica de rollo suizo, lo que garantiza una inmunotinción precisa a través de la preservación y orientación adecuadas de los tejidos.

Protocolo optimizado para rollos suizos intestinales y tinción inmunofluorescente de tejido incluido en parafina

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

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Investigación

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Biología

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