Name: Detección robusta de la amplificación génica en muestras fijadas en formol e incluidas en parafina mediante hibridación fluorescente in situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:35:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: Aprende a detectar amplificación génica en muestras FFPE mediante hibridación fluorescente in situ optimizada. Este protocolo mejora la calidad de datos para estudiar oncogenes en cáncer.

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S.W. es un erudito y cuenta con el apoyo del Instituto de Investigación y Prevención del Cáncer de Texas (RR210034)

Este protocolo de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB, por sus siglas en inglés) del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes antes de la cirugía.
1. Preparación de reactivos y materiales
<ol><li>Prepare la solución de cloruro de sodio (HCl) 0.2 N en una campana extractora agregando lentamente 8.212 mL de HCl (37% p/p o 12.1 N) a 491.788 mL de ddH2O. Almacene a temperatura ambiente (RT). PRECAUCIÓN: Agregue lentamente el ácido al agua. No agregue agua al ácido.</li>
	<li>Prepare 10 mM de solución de ácido cítrico (pH 6.0) disolviendo 1.47 g de citrato trisódico (dihidratado) en 400 mL de ddH2O. Use HCl para ajustar a pH 6.0 y luego lleve el volumen final a 500 mL con ddH2O. Almacene el tampón a RT.</li>
	<li>Prepare la solución de Tween-20 al 10% añadiendo 100 μL de Tween-20 a 900 μL de ddH2O. Guárdela en RT.</li>
	<li>Prepare la solución de IGEPAL al 10% añadiendo 5 mL de IGEPAL CA-630 a 45 mL de ddH2O. Guárdela en RT.</li>
	<li>Prepare la solución 20x SSC (pH 7.0, 3 M NaCl, 0.3 M de citrato de sodio) disolviendo 44.1 g de citrato trisódico (dihidratado) y 87.65 g de cloruro de sodio (NaCl) en 900 mL de ddH2O. Use HCl para ajustar a pH 7.0 y luego lleve el volumen final a 1000 mL con ddH2O. Almacene el tampón en RT.</li>
	<li>Prepare la solución de SSC 2x agregando 100 mL de SSC 20x a 900 mL de ddH2O. Si es necesario, agregue 0,5 mL de conservante (Tabla de Materiales). Guárdalo en RT.</li>
	<li>Prepare el tampón de hibridación de la sonda mezclando 910 μL de ddH2O, 500 μL de SSC 20x, 50 μL de Tween-20 al 10%, 40 μL de RNasa A, 1 mL de sulfato de dextrano al 50% y 2,5 mL de formamida. Alícuota en 1 mL y almacenarlos a -20 °C.</li>
	<li>Prepare el SSC 0.4x con solución de IGEPAL al 0.3% mezclando 100 mL de 2x SSC, 15 mL de IGEPAL al 10% y 385 mL de ddH2O. Guárdelo en RT.</li>
	<li>Prepare el 2x SSC con una solución de IGEPAL al 0,1% añadiendo 5 mL de IGEPAL al 10% a 495 mL de solución 2x SSC. Guárdalo en RT.</li>
	<li>Prepare el tampón de digestión Proteinasa K antes de usarlo añadiendo 1 μL de Proteinasa K a 99 μL de tampón Tris-EDTA.</li>
	<li>Prepare 1 mg/mL de DAPI disolviendo 1 mg de DAPI en 1 mL de ddH2O. Guárdelo a -20 °C y lejos de la luz. Prepare la solución de trabajo DAPI agregando 1 μL de stock de almacenamiento DAPI a 999 μL de solución SSC 2x. Mantener alejado de la luz hasta su uso.</li>
</ol>2. Pretratamiento de la muestra
NOTA: El portaobjetos utilizado aquí contiene el espécimen.
<ol><li>Envejezca el portaobjetos a 60-90 °C durante 20 minutos o toda la noche (Figura 1). NOTA: Este paso facilita la fusión de la parafina. Por lo general, 20 minutos de calentamiento son suficientes. Se puede extender a toda la noche para acomodar el horario.</li>
	<li>Desparafina el portaobjetos sumergiéndolo en xileno o sus sustitutos en un frasco Coplin durante 10 min. Repita este paso con xileno fresco o sus sustitutos. Realice todos los siguientes pasos de pretratamiento y lavado en un frasco Coplin. NOTA: Los sustitutos del xileno son alternativas seguras y ecológicas al xileno. Uno de los sustitutos (ver Tabla de Materiales) funciona tan bien como el xileno, si no mejor. Aunque los sustitutos del xileno producen menos olor que el xileno, se recomienda usarlo dentro de una campana extractora. Si no se dispone de sustitutos del xileno, todos los procedimientos son compatibles con la desparafinación a base de xileno sin ningún cambio.</li>
	<li>Lave el sustituto de xileno con etanol al 100% durante 5 minutos.</li>
	<li>Rehidrate el portaobjetos con inmersión en etanol al 70% durante 5 min.</li>
	<li>Sumerja el portaobjetos en ácido clorhídrico (HCl) 0,2 N a RT durante 20 min. NOTA: El HCl extrae eficazmente proteínas solubles en ácido, como las proteínas nucleares básicas, para mejorar la accesibilidad del ADN a las sondas FISH11.</li>
	<li>Sumerja el portaobjetos en 10 mM de solución caliente de ácido cítrico e incube a 90-95 °C durante 20 min. NOTA: El tratamiento con ácido cítrico a altas temperaturas extrae de manera similar las proteínas solubles en ácido. Se cree que ambos tratamientos ácidos extraen proteínas de la matriz extracelular para disminuir la autofluorescencia12. Se recomienda que la solución cítrica se precaliente al rango de temperatura deseado antes de aplicarla al portaobjetos. El microondas puede ser una forma conveniente de hacerlo. Un baño de agua, como el de una olla sous vide, es la solución más eficaz y económica para la incubación a alta temperatura.</li>
	<li>Enjuague el portaobjetos brevemente con 2x SSC para neutralizar el pH.</li>
	<li>Digiera el tejido añadiendo 100-200 μL (suficiente para cubrir completamente el tejido dependiendo del tamaño de la sección) de tampón de digestión Proteinasa K e incubar a RT durante 1 min. NOTA: La digestión de la proteinasa K aumenta aún más la accesibilidad a las sondas FISH y reduce la autofluorescencia. El tiempo de digestión debe optimizarse en función de los tipos de tejido. En la mayoría de los casos, 1 minuto de digestión es suficiente. La digestión excesiva conduce a una morfología de los núcleos en forma de halo, y el tiempo de digestión debe reducirse.</li>
	<li>Detenga inmediatamente la digestión de la proteinasa K y deshidrate el portaobjetos sumergiéndolo en etanol al 70% durante 2 minutos, seguido de un tratamiento con etanol al 85% y al 100% durante 2 minutos cada uno.</li>
</ol>3. FISH y la imagen
<ol><li>Prepare la mezcla de hibridación FISH diluyendo 2 μL de caldo de sonda FISH con 8 μL de tampón de hibridación y, a continuación, aplíquelo al portaobjetos. Cubra la muestra con un cubreobjetos. NOTA: El material total de sondas FISH utilizado oscila entre 0,5 y 4 μL, dependiendo de la calidad de la imagen. Si la señal es demasiado baja, aumente la entrada de la sonda. Reduzca la entrada de la sonda FISH si el fondo es demasiado alto, especialmente cuando se observan residuos fluorescentes fuera de los núcleos. El tampón de hibridación puede ser el que se proporciona con las sondas compradas comercialmente o preparado como en la sección 1.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en una placa caliente, como un sistema de hibridación de foso de portaobjetos, para desnaturalizar el ADN a 75 °C durante 2-5 minutos. Luego, transfiera el portaobjetos a otra placa caliente configurada a 37 ° C para hibridar durante la noche. NOTA: Si la placa calefactora tiene una bandeja de agua o un depósito para mantener la humedad durante la hibridación, no es necesario sellar el cubreobjetos con cemento de caucho.</li>
	<li>Después de la hibridación, sumerja la corredera en 40-60 °C calentado 0.4x SSC con 0.3% de tampón de lavado IGEPAL CA-630, luego retire con cuidado el cubreobjetos. Continuar el lavado dos veces durante 5 minutos cada una en la oscuridad, con agitación durante los primeros 10-15 s. NOTA: Sumergir la corredera en el tampón de lavado ayuda a liberar suavemente el cubreobjetos.</li>
	<li>Lavar el portaobjetos en SSC con 0,1% IGEPAL CA-630 durante 5 min a RT en la oscuridad, con agitación durante los primeros 10-15 s.</li>
	<li>Para apagar la autofluorescencia, trate el portaobjetos con el kit de enfriamiento por autofluorescencia (consulte la tabla de materiales) aplicando 150 μL de reactivo (50 μL + 50 μL + 50 μL de reactivos A, B, C) durante 2-5 min, luego lávelo con 2x SSC durante 5 min. NOTA: Este es un paso opcional. La autofluorescencia tisular se origina principalmente a partir de componentes de la matriz extracelular, como el colágeno y la elastina. También está significativamente influenciado por los lisosomas y las mitocondrias debido a su contenido de lipofuscina, NADPH y flavina coenzima. La fijación de aldehídos y la presencia de células sanguíneas también pueden aumentar bien la autofluorescencia13,14.</li>
	<li>Tiñe el portaobjetos con DAPI durante 10 min. Enjuague el portaobjetos con 2 tampones SSC durante 5 min. NOTA: Si el portaobjetos no es tratado por el kit de enfriamiento de autofluorescencia, la tinción con DAPI se puede reducir a 2 min.</li>
	<li>Sumerja rápidamente el portaobjetos en agua desionizada durante no más de 1 s, luego séquelo rápidamente absorbiendo la humedad adicional con una toalla de papel. NOTA: Este es un paso opcional. El tratamiento con agua desionizada evita eficazmente la deposición de cristales de sal del tampón SSC en el portaobjetos y mejora la calidad de las imágenes. Sin embargo, en condiciones de iones tan bajos, los enlaces de hidrógeno entre la sonda FISH y el ADN objetivo se debilitan, lo que provoca la disociación de la sonda y la pérdida de señal. Por lo tanto, mantener la etapa de tratamiento del agua durante muy poco tiempo es crucial.</li>
	<li>Seque la corredera y, a continuación, móntela con un medio de montaje antidecoloración. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas antes de tomar imágenes. NOTA: Si el portaobjetos se trata con un reactivo de enfriamiento de autofluorescencia, monte el portaobjetos con un medio de montaje antidecoloración según las instrucciones del fabricante. Además, dependiendo del tipo de medio de montaje, endurecimiento o no endurecimiento, la muestra debe curarse durante 1-24 h antes del sellado y la obtención de imágenes. Se recomienda que la muestra se cure al menos durante la noche para lograr el mejor índice de refracción para la obtención de imágenes.</li>
	<li>Utilice una lente de aceite de 60× para capturar la señal de fluorescencia. Utilice el canal DAPI para ajustar el enfoque. Asegúrese de obtener varias pilas Z. Por lo general, 5-10 pilas z con un intervalo de 1 μm son suficientes. Realiza una proyección 3D máxima para conseguir la mejor resolución. Aplique deconvolución u otros algoritmos de borrado de fondo para mejorar aún más la calidad de la imagen.</li>
</ol>

Mejora del análisis de FISH para impulsores oncogénicos en muestras de tejido canceroso

<ol><li>ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+whole+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of whole genomes.</a> Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).</li>
<li>Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA%3A+An+emerging+hallmark+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer.</a> Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).</li>
<li>Luebeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+in+the+cancerous+transformation+of+Barrett%27s+oesophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett's oesophagus.</a> Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).</li>
<li>Nathanson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+resistance+mediated+by+dynamic+regulation+of+extrachromosomal+mutant+EGFR+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA.</a> Science. 343 (6166), 72-76 (2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+is+associated+with+oncogene+amplification+and+poor+outcome+across+multiple+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers.</a> Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).</li>
<li>Pal Choudhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+cross-resistance+in+small+cell+lung+cancer+due+to+extrachromosomal+DNA+amplification+of+MYC+paralogs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs.</a> Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).</li>
<li>Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+molecular+data+generated+with+FFPE+biospecimens%3A+Lessons+from+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature.</a> Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).</li>
<li>Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+diagnosis+and+tailored+therapies+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors.</a> Molecules. 25 (8), 1864(2020).</li>
<li>Cui, C., Shu, W., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Cell-based+genetic+diagnostic+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 89(2016).</li>
<li>Finn, E. H., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+DNA+FISH+protocol+to+visualize+genome+regions+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100741(2021).</li>
<li>Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections.</a> Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).</li>
<li>Richardson, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-fits-all+pretreatment+protocol+facilitating+fluorescence+in+situ+hybridization+on+formalin-fixed+paraffin-embedded%2C+fresh+frozen+and+cytological+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides.</a> Mol Cytogenet. 12, 27(2019).</li>
<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Annu+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+diminishing+autofluorescence+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+respiratory+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiang%2C+Z+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Lange, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+dynamics+of+extrachromosomal+DNA+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers.</a> Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ecDNA+hubs+drive+cooperative+intermolecular+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression.</a> Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).</li>
<li>Storlazzi, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors%3A+origin+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure.</a> Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li>
<li>Guerin, T. M., Marcand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakage+in+breakage-fusion-bridge+cycle%3A+an+80-year-old+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery.</a> Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).</li>
<li>Nguyen, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mapping+and+accelerated+super-resolution+imaging+of+the+human+genome+using+in+situ+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing.</a> Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).</li>
<li>Deshpande, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+landscape+of+focal+amplifications+in+cancer+using+AmpliconArchitect%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect.</a> Nat Commun. 10 (1), 392(2019).</li>
<li>Rajkumar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcSeg%3A+Semantic+segmentation+of+metaphase+images+containing+extrachromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA.</a> iScience. 21, 428-435 (2019).</li>
</ol>

S.W. es miembro del consejo asesor científico de Dimension Genomics Inc.

FISH es una opción rápida y asequible para el diagnóstico citogenético. Especialmente para determinar si el ECDNA está presente en el cáncer, la evidencia de FISH sigue siendoel estándar de oro. La FISH en el tejido FFPE permite una rápida determinación del estado genético en las muestras de biopsia de un paciente, lo que permite un diagnóstico más rápido y un seguimiento de los cambios a lo largo del progreso de la enfermedad. Esta técnica es particularmente valiosa para analizar muestras clínicas que ya se han recolectado para patología.
Este protocolo implica varios pasos críticos. El primer paso es la desparafinación completa. La parafina residual puede interrumpir la hibridación de FISH. Si la muestra sigue pareciendo cerosa después del paso 2, debe tratarse de nuevo con xileno fresco o sus sustitutos.
En segundo lugar, la extracción y la digestión de proteínas son fundamentales. Estos procesos no solo mejoran la accesibilidad del ADN a la sonda FISH, sino que también reducen significativamente la autofluorescencia. Este protocolo incluye tres pasos de desproteinización. Si bien el tratamiento con HCl 0,2 N y ácido cítrico 10 mM es sencillo, la digestión de la proteinasa K puede requerir optimización. La digestión excesiva es el error más común cuando se usa proteinasa K, lo que resulta en núcleos en forma de halo. Acortar el tiempo de digestión mejorará la morfología de los núcleos. Además, se recomienda no digerir más de cuatro muestras simultáneamente para minimizar la diferencia de tiempo entre la primera y la última muestra. Es importante tener en cuenta que incluso un núcleo intacto puede aparecer como un halo bajo microscopía de gran aumento y alta resolución. Esto se debe a que el núcleo no está en el mismo plano focal. Por lo tanto, se sugiere tomar múltiples pilas Z y realizar una proyección máxima para inspeccionar la morfología nuclear.
Por último, se recomienda apagar la autofluorescencia. Aunque la extracción de ácido y la digestión de la proteinasa K pueden reducir significativamente el fondo derivado de proteínas, los metabolitos fluorescentes aún pueden afectar la calidad de la imagen.
Si bien FISH ofrece una resolución espacial sin precedentes en la identificación de la amplificación de genes focales, tiene limitaciones. En primer lugar, el contenido y el rendimiento son bajos en comparación con los enfoques basados en PCR o secuenciación de próxima generación (NGS). Por lo general, se pueden aplicar de una a tres sondas FISH de diferentes colores a un solo portaobjetos sin equipo especializado. No obstante, los avances en las tecnologías de automatización han hecho factibles los FISH de alto contenido y alto rendimiento, como la secuenciación in situ 21. En segundo lugar, el diseño de la sonda FISH requiere información previa. Los esfuerzos continuos para identificar eventos recurrentes de amplificación focal en el cáncer han permitido la creación de paneles FISH prediseñados para aplicaciones clínicas y de laboratorio. Por ejemplo, los oncogenes de la familia MYC se amplifican con frecuencia como ADNec en el cáncer de pulmón de células pequeñas para mediar la resistencia a la quimioterapia. Por lo tanto, un panel FISH dirigido a los genes MYC, MYCL y MYCN puede acelerar la determinación de las respuestas al tratamiento en las biopsias. En comparación, la NGS permite un cribado más imparcial de los genes de interés. Sin embargo, entre las tecnologías basadas en NGS, solo la secuenciación del genoma completo con un análisis costoso por cálculo22 puede caracterizar el ADNec.
En resumen, presentamos instrucciones sólidas y completas para investigar la amplificación focal de genes en muestras de FFPE. Al examinar el patrón de señal FISH, queda inequívocamente claro si un locus genético se amplifica y cómo. Anticipamos la integración del aprendizaje automático en el análisis de imágenes23 de núcleos de interfase para extraer información citogenética sobre el número de copias y la forma de amplificación (cromosoma o ecDNA), agilizando así el proceso de diagnóstico molecular y mejorando nuestra comprensión de los mecanismos patogenéticos en el cáncer.

El estudio de la amplificación de oncogenes focales es crucial, ya que impulsa la formación, progresión y resistencia al tratamientodel cáncer 1. Es importante destacar que los oncogenes y los genes inmunorreguladores pueden amplificarse como ADNec extracromosómicos (ADNec), cuya herencia asimétrica promueve la heterogeneidad genética en el cáncer 2,3. El ADNec se ha relacionado con la resistencia a la terapia y los resultados clínicos desfavorables 4,5,6.
Las muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) representan un vasto recurso de archivo en los laboratorios de patología, ya que ofrecen abundante información para estudios retrospectivos. Sin embargo, la extracción de datos moleculares de muestras de FFPE a través de PCR o secuenciación es un desafío debido a la fragmentación, degradación y reticulación de ácidos nucleicos durante la fijación7. Entre la gama de técnicas disponibles para el análisis molecular de tejidos FFPE, la hibridación fluorescente in situ (FISH) ha demostrado ser eficaz para visualizar secuencias específicas de ADN8.
A pesar del avance de las técnicas modernas de diagnóstico molecular, la capacidad de FISH para visualizar y cuantificar la amplificación génica a nivel de una sola célula proporciona información valiosa sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la tumorigénesis y los resultados clínicos. Mediante el uso de sondas marcadas con fluorescencia complementarias al gen objetivo de interés, FISH puede resolver convenientemente la localización de un oncogén y puede inferir la forma de amplificación del oncogén (como el ecDNA) dentro de las células individuales, lo que de otro modo sería imposible o costoso a través de otras tecnologías. Por lo tanto, FISH ofrece una forma económica de evaluar la heterogeneidad tumoral y la evolución clonal9. Además, los avances en la automatización, la obtención de imágenes y el análisis computacional han facilitado el análisis de alto rendimiento de los datos FISH, lo que permite una cuantificación robusta de la amplificación génica en grandes cohortes de tejidos10.
Sin embargo, la aplicación de FISH al tejido FFPE presenta desafíos inherentes, incluidos los artefactos de reticulación y la autofluorescencia de fondo. La superación de estos obstáculos requiere una optimización cuidadosa de cada procedimiento para garantizar resultados precisos y reproducibles. Este documento proporciona un protocolo paso a paso totalmente optimizado para aplicar FISH para investigar la amplificación de genes en muestras de tejido FFPE. Utilizando una sonda dirigida al locus del gen ERBB2 (HER2), demostramos que FISH puede detectar de manera robusta el estado de amplificación de ERBB2 en muestras de FFPE de pacientes con cáncer de mama. Incluso es posible estimar si ERBB2 se amplifica como ADNec. Al sintetizar la literatura existente y nuestros hallazgos experimentales, dilucidamos las consideraciones metodológicas, los desafíos técnicos y las posibles trampas del análisis basado en FISH. También discutimos la relevancia clínica del perfil de amplificación génica en varios tipos de cáncer, destacando su importancia pronóstica y su potencial para estrategias terapéuticas personalizadas.
En resumen, este artículo subraya la importancia de FISH como una herramienta valiosa para estudiar la amplificación génica en muestras de tejido FFPE, ofreciendo información sin precedentes sobre la biología tumoral y guiando la toma de decisiones clínicas en oncología. Con el continuo refinamiento e integración con ensayos moleculares complementarios, el análisis basado en PET está preparado para mejorar aún más nuestra comprensión de la patogénesis del cáncer y mejorar los resultados de los pacientes en la era de la medicina de precisión.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5748</td><td>Tinción de núcleos</td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano solución al 50%</td><td>EMD Millipore Sigma</td><td>S4030</td><td>Tampón de hibridación de sonda</td></tr><tr><td>ERBB2 (HER2) Sonda FISH</td><td>Empire Genomics</td><td>ERBB2-20-RE</td><td>Sonda FISH</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>Tejido deshidratante e hidratante</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Thermo Scientific Productos químicos</td><td>205821000</td><td>Tampón de hibridación de sonda</td></tr><tr><td>Formula 83 (sustituto del xileno)</td><td>CBG Biotech</td><td>CH0104A</td><td>Eliminación de parafina</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td>Pretratamiento de muestras</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J19628K2</td><td>Lavado de portaobjetos</td></tr><tr><td>Proclin 300</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48914-U</td><td>Conservante para tampón SSC (opcional)</td></tr><tr><td>Proteinasa K (800 unidades/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>ARNasa A de digestión de proteínas (20 mg/mL)</td><td>Tampón de hibridación de sonda</td><td>T3018L</td> de <td>New England Biolabs</td></tr><tr><td>Sistema</td> <td>de hibridación de foso de portaobjetosBoekel Scientific 280001</td><td></td><td>Desnaturalización e hibridación de muestras. Las placas calefactoras alternativas son aceptables.</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S2713</td><td>Tampón SSC</td></tr><tr><td>Citrato de sodio dihidratado</td><td></td><td>Tampón de FLBP3271 SSC de</td><td>Fisher BioReagents</td> y pretratamiento de muestras Tampón</tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2473500</td><td>Tampón de digestión Proteinasa K</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td>Tampón de hibridación de sonda</td></tr><tr><td>Vectashield medios de montaje antidecoloración</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>H190010</td><td>Montaje de corredera</td></tr><tr><td>Vector TrueVIEW</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>SP8400</td><td>Kit de enfriamiento de autofluorescencia</td></tr></tbody></table>

detección robusta de la amplificación génica en muestras fijadas en formol e incluidas en parafina mediante hibridación fluorescente in situ

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

La amplificación focal de genes, como el ADN extracromosómico (ADNec), desempeña un papel importante en el desarrollo del cáncer y la resistencia a la terapia. Si bien las metodologías basadas en la secuenciación permiten una identificación imparcial del ADNec, las técnicas basadas en citogenética, como la hibridación fluorescente in situ (FISH), siguen siendo rentables y siguen siendo rentables para identificar el ADNec en muestras clínicas. La aplicación de FISH en muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) ofrece una vía única para detectar genes amplificados, particularmente cuando no se dispone de muestras viables para el examen del cariotipo. Sin embargo, no hay procedimientos consensuados para esta técnica. Este protocolo proporciona instrucciones completas, totalmente optimizadas y paso a paso para realizar FISH con el fin de detectar la amplificación de genes, incluido el ADNec, en muestras de tejido FFPE que presentan desafíos únicos que este protocolo pretende superar y estandarizar. Siguiendo este protocolo, los investigadores pueden adquirir de forma reproducible datos de imagen de alta calidad para evaluar la amplificación génica.

Utilizamos muestras de FFPE de cánceres de mama HER2 positivos y negativos para demostrar el resultado de las imágenes FISH. La amplificación de HER2 (codificada por el gen ERBB2 ) es un marcador favorable debido a la disponibilidad y eficacia de las terapias de diana molecular de HER2. Por el contrario, las pacientes con cánceres de mama triple negativos, que carecen de expresión de HER2, receptores de estrógeno (RE) y receptores de progesterona (PR), se enfrentan a malos resultados debido a las limitadas opciones terapéuticas. Por lo tanto, determinar el estado de HER2 es crucial en la investigación y el tratamiento del cáncer de mama15.
En la muestra de cáncer de mama triple negativo, la mayoría de los núcleos muestran dos puntos distintos que representan las señales FISH de HER2/ERBB2 . Es posible que algunos núcleos solo tengan un punto debido al sesgo de sección (Figura 2, izquierda). Por el contrario, las muestras positivas para HER2 presentan abundantes señales FISH con dos patrones diferentes. Un patrón muestra puntos dispersos por todo el núcleo (Figura 2, centro). Este patrón es una característica de la morfología del ADNec, ya que es posible que los ADNec no ocupen un territorio nuclear único y organizado16. Además, la segregación asimétrica de los ADNec durante la mitosis impulsa la variación del número de copias, lo que conduce a la heterogeneidad de la señal entre los núcleos17. Algunos núcleos pueden mostrar grupos ocasionales, indicativos de centros de ADNec18 (Figura 2, derecha). El otro tipo de amplificación de HER2 muestra principalmente agregados condensados en forma de varilla. Esta morfología probablemente indica amplificación basada en cromosomas, como regiones de tinción homogénea (HSR)19 o a través del ciclo de rotura-fusión-puente (BFB)20. En particular, la amplificación de ecDNA, HSR y BFB puede coexistir en el mismo núcleo. Por lo tanto, se recomienda examinar múltiples núcleos para inferir la forma de amplificación focal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de FISH en muestras de FFPE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig02.jpg"> Figura 2: Imagen representativa de FISH en muestras FFPE de cáncer de mama. Ampliación: 600x; Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo proporciona un método reproducible para visualizar la amplificación de genes en muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE).

Detección robusta de la amplificación génica en muestras fijadas en formol e incluidas en parafina mediante hibridación fluorescente in situ

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

robust-detection-gene-amplification-formalin-fixed-paraffin-embedded

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ampliPHOX tecnología de detección colorimétrica se presenta como una alternativa económica a la detección por fluorescencia de microarrays. Sobre la base de fotopolimerización, ampliPHOX produce manchas de polímero sólido visible a simple vista en tan sólo unos minutos. Resultados son imágenes e interpretado de forma automática con un paquete de software simple pero poderosa.

ampliPHOX colorimétrico de detección de un microarray de ADN para la influenza

Este video describe una estrategia de hibridación secuencial que implica la hibridación de sondas de ARNm con ARNm objetivo específico. Después de la hibridación de la sonda, se realiza una amplificación de la señal para mejorar la resolución a través de la reducción de la relación señal-ruido durante el ARN-CISH de las muestras histológicas.

Hibridación de sonda y amplificación de señal en ARN Hibridación in situ: una técnica para detectar secuencias específicas de ARN en secciones de tejido

Hemos establecido un fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para la detección de un genoma del virus de ADN persistente dentro de las secciones de tejido de modelos animales. Este protocolo permite el estudio de proceso de infección por codetection del genoma viral, sus productos de ARN, y proteínas virales o celulares dentro de las células individuales.

Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

Aquí, presentamos un método simple para realizar la hibridación in situ de ADN fluorescente (DNA ISH) para visualizar secuencias heterocromáticas repetitivas en cromosomas montados en portaobjetos. El método requiere reactivos mínimos y es versátil para su uso con sondas cortas o largas, diferentes tejidos y detección con señales basadas en fluorescencia o no fluorescencia.

Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

El objetivo de este video es demostrar cómo llevar a cabo la extracción de ADN automatizado de parafina embebido (FFPE) referencia las líneas celulares estándar fijado en formol y gotita digital de PCR (ddPCR) análisis para detectar mutaciones raras en un entorno clínico. La detección de mutaciones en muestras de FFPE demuestra la utilidad clínica de ddPCR en muestras FFPE.

El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Hibridación in situ de la fluorescencia (pescado) se requiere a menudo en combinación con la histopatología y el diagnóstico molecular para la selección del tratamiento en la medicina personalizada. Fijador de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol novedoso que permite alta calidad morfológica, molecular y análisis de peces de la misma muestra por adición de un paso de la fijación antes de pescado se presenta.

Protocolo para HER2 de los pescados usando un fijador de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol para combinar las ventajas de la criopreservación y la fijación de formalina

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Aprende a detectar amplificación génica en muestras FFPE mediante hibridación fluorescente in situ optimizada. Este protocolo mejora la calidad de datos para estudiar oncogenes en cáncer.

Detección robusta de la amplificación génica en muestras fijadas en formol e incluidas en parafina mediante hibridación fluorescente in situ (Video) | JoVE Journal

Detección robusta de la amplificación génica en muestras fijadas en formol e incluidas en parafina mediante hibridación fluorescente in situ

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