Name: Circuitos inmunometabólicos en la infección para el avance de las terapias dirigidas al huésped (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende a diseñar circuitos sintéticos inducibles controlados por tetraciclina para eliminar Leishmania major y modular citocinas en macrófagos. Este protocolo avanza terapias inmunometabólicas dirigidas al huésped contra la leishmaniasis.

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Los autores desean agradecer al Director del Consejo de Investigación e Innovación en Biotecnología- Centro Nacional de Ciencia Celular (BRIC-NCCS), Pune, por apoyar nuestra investigación y al Centro de Bioinformática del BRIC-NCCS.

Diseño de circuitos sintéticos controlados con tetraciclina para el tratamiento de la leishmaniasis

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<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los resultados obtenidos ponen de manifiesto la eficiencia de la tubería, que ha sido canalizada para el diseño e implementación de un circuito sintético. La construcción de este circuito sintético fue un paso hacia el desarrollo de la medicina de precisión para enfermedades infecciosas como la leishmaniasis. A través del ensamblaje in silico de partes genéticas y la simulación determinista, se monitorizó el distinguido efecto modulador del sistema TetON. El efecto del circuito, en particular, podría haber llevado a la expresión biestable recíproca de TetR y SDHA/GFP. La expresión de SDHA fue periódica, lo que podría indicar que solo en presencia de doxiciclina su expresión se incrementó. Para observar los cambios potenciales en los patrones de expresión durante un período, se seleccionó una unidad de tiempo de 100. Los resultados identifican que el circuito sintético mostró un comportamiento periódico para TetR y SDHA/GFP, probablemente atribuible a su naturaleza ortogonal21. El ensamblaje de piezas genéticas del registro de partes iGEM desempeñó un papel fundamental, ya que proporcionó los componentes genéticos necesarios para la construcción de circuitos sintéticos22. La disposición modular de las partes genéticas es esencial, ya que la traducción y el funcionamiento del circuito pueden verse afectados, lo que puede conducir a una expresión ineficiente y a un efecto modulador en las células23.
El tamaño de la inserción del circuito sintético fue de aproximadamente 1,3 kb para garantizar que el tamaño del vector no sea demasiado grande, lo que puede reducir potencialmente la eficiencia de la transformación24. La selección de un vector apropiado es un paso crítico, ya que debe poseer partes genéticas, que son esenciales para aumentar el número de copias en el sistema bacteriano y producir copias de plásmidos altas, y su maquinaria de expresión debe adaptarse bien en el sistema de los mamíferos25. El vector pEGFP-N1 está bien caracterizado en la línea celular RAW264.7 y posee una estructura plásmida compacta con un sitio de clonación múltiple26. Se emplearon soluciones tampón estandarizadas en laboratorio para el aislamiento de plásmidos con el fin de garantizar la producción de plásmidos puros y altamente concentrados, lo que se validó mediante estimación espectrofotométrica y AGE. La inserción del circuito sintético en el vector pEGFP-N1 se validó mediante digestión de restricción, y las muestras se analizaron en AGE y secuenciación. Los resultados de AGE representaron una banda de inserción de 1,3 kb, una banda de 4,7 kb del vector pEGFP-N1 y una banda de 6 kb de todo el circuito sintético. 
La transfección se realizó utilizando proporciones 1:1, 1:2 y 2:1 de ADN: PEI, donde la proporción observada de 1:1 funcionó mejor sin alterar la morfología celular (datos no mostrados). Se recomienda utilizar una concentración de 400 μg/mL - 1000 μg/mL de G418 para la selección de células transfectadas27. Se utilizaron 500 μg/mL de G418 para la selección de las células transfectadas, ya que suprimió eficazmente el crecimiento de las células no transfectadas sin comprometer el crecimiento celular o la morfología de las células transfectadas (datos no mostrados). Dada la importancia del fenotipo celular en la eficiencia de la transfección, particularmente en líneas celulares de macrófagos, que pueden sufrir diferenciación y volverse difíciles de transfectar, se utilizó un número de paso bajo de la línea celular RAW264.7 para la transformación28. El número de pasos celulares también podría ser un factor crítico en la eficiencia de la transfección. Un número de paso alto puede conducir a una transfección ineficiente29. Dox es el inductor preferido para el sistema de inducción Tet-ON debido a su alta eficiencia de unión a TetR, distribución tisular favorable, baja toxicidad y una vida media de 24 h30. Después de la transfección, las células fueron inducidas con dox durante 24 h, y se observó la expresión de GFP. Para las células RAW264.7, la concentración de dox utilizada para la inducción de circuitos sintéticos fue de 1 μg/mL, que se encuentra en el rango recomendado de 1-2 μg/mL31 (datos no mostrados). Sin embargo, la regulación de la concentración de SDHA después de la inducción fue indeterminada. En general, la determinación y estandarización del número de paso celular, la concentración de ADN: PEI, la concentración de marcadores de selección de transfección en mamíferos y la concentración de inducción de doxiciclina son factores cruciales en el proceso de transfección.
Tras la inducción del circuito sintético post-infección en diferentes momentos temporales, se observó una reducción significativa de la carga parasitaria intracelular. Una comparación de las cargas de parásitos entre las muestras infectadas y las IMTI reveló una menor carga en las células inducidas con el circuito sintético, probablemente atribuible a la expresión de SDHA. Dado que la expresión de SDHA se asocia con la producción de NO, se observó que las células IMTI tienen una forma morfológica irregular y rugosa, que ocurre en la línea celular RAW264.7 cuando se produce NO32. Los niveles de IL-10 e IL-12 después de la infección a las 6 h fueron los más altos, ya que se ha informado que ambas citocinas están reguladas al alza en este momento, lo que experimenta una modificación fenotípica adicional para producir IL-10 más que IL-1219. Dado que los niveles de IL-10 e IL-12 no alteraron significativamente la post-transfección y en muestras de IMTI, se realizó un perfil de citocinas para detectar respuestas de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias. 
Se identificaron los niveles de expresión de TNF-α, IFN-γ y TGF-β en muestras de infección a las 6 h y de IMT a las 24 h. Para eliminar los parásitos intracelulares, el TNF-α y el IFN-γ son principalmente esenciales, ya que inducen ráfagas oxidativas a través de la producción de NO. Los macrófagos M2 polarizados expresan TGF-β, que regula a la baja las citocinas proinflamatorias33. La muestra de IMTI a las 24 h mostró una mayor expresión de TNF-α e IFN-γ que TGF-β, lo que sugiere que los macrófagos, tras la transfección e infección con L. major, podrían haberse polarizado a un fenotipo que expresa citocinas proinflamatorias. El estudio, por lo tanto, proporciona información sobre las alteraciones fenotípicas inducidas tras la transfección con un circuito sintético y destaca la dinámica de la infección. Se puede investigar el efecto de los circuitos sintéticos como terapéuticos, ya que su inducción ha aumentado significativamente la expresión de citocinas proinflamatorias en comparación con las citocinas antiinflamatorias. Por lo tanto, el estudio no solo estableció la construcción y entrega de circuitos sintéticos, sino que también demostró su potencial terapéutico en un modelo de leishmaniasis a través de la regulación positiva de citocinas proinflamatorias en células huésped desafiadas por Leishmania.

El avance de la medicina holística e integrativa es un vínculo significativo que se ha identificado entre las alteraciones metabólicas en las células inmunitarias y su capacidad para modular el fenotipo de las células inmunitarias en las enfermedades infecciosas. El inmunometabolismo ofrece nuevas perspectivas para dilucidar la patogénesis de las enfermedades infecciosas prevalentes en los seres humanos. Además, proporciona técnicas prometedoras para el desarrollo de vacunas y fármacos mediante la identificación de nuevas dianas para la intervención1. La reprogramación metabólica de las células inmunitarias se identifica en varias enfermedades infecciosas, incluida la leishmaniasis. Leishmania spp. es responsable de causar leishmaniasis, de la cual la Leishmania major (L. major) causa leishmaniasis cutánea (LC). Los parásitos principales de L. tienen un impacto significativo en el metabolismo de las células huésped, particularmente en los macrófagos, para la proliferación y la supervivencia como parásitos intracelulares2. Por lo general, los macrófagos pueden polarizarse en subconjuntos activados clásicamente (M1) o alternativamente activados (M2) donde las células M1 poseen una alta secreción de citocinas proinflamatorias y producción de óxido nítrico (NO) a través del metabolismo de las especies de nitrógeno. Las células M2 exhiben niveles elevados de citocinas antiinflamatorias y muestran una alta actividad de arginasa a través del metabolismo del nitrógeno3. Así, ambos fenotipos no solo difieren por su respuesta inmunitaria, sino también por sus vías metabólicas.
La biología de sistemas de la leishmaniasis tiene como objetivo identificar dianas moleculares para el diseño de nuevas terapias a través del diseño y desarrollo de fármacos. La reconstrucción de las redes de señalización y las vías metabólicas ayuda a comprender la leishmaniasis como un modelo holístico y aporta información para la identificación del componente principal que impulsa el estado de enfermedad. El modelado matemático es uno de los enfoques analíticos aplicados más favorecidos para comprender las complejidades de la leishmaniasis4. Las redes inmunometabólicas y los modelos matemáticos permitieron identificar la succinato deshidrogenasa (SDHA) como un componente clave del fenotipo M1, que se expresa para eliminar el parásito5. La biología sintética tiene aplicaciones en el diagnóstico, el desarrollo de vacunas y la terapéutica de la leishmaniasis. El metabolismo dirigido a la modulación de la respuesta inmunitaria puede lograrse a través de herramientas de biología sintética. Para la modulación de la fosforilo ceramida sintasa de inositol, que regula el metabolismo de los esfingolípidos y altera la señalización inmunitaria del huésped, se utilizó un circuito genético que poseía un comportamiento biestable para ajustar sintéticamente la robustez intrínseca del modelo de infección por L. major 6,7. Por lo tanto, la biología de sistemas y sintética puede proporcionar una plataforma de ingeniería genética basada en modelos para el desarrollo de la medicina de precisión en el sistema modelo de Leishmania.
El fenotipo M1 se caracteriza por la expresión de redes de señalización inmunometabólica donde la producción de citocinas inflamatorias y vías metabólicas mejora sinérgicamente la eliminación del parásito. La polarización M1 significa la producción de citocinas proinflamatorias como la interleucina-12 (IL-12), el interferón-gamma (IFN-γ) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α). Las vías metabólicas que están altamente enriquecidas en el fenotipo M1 incluyen la glucólisis, la vía del fosfato de pentosas y el ciclo del ácido tricarboxílico truncado (ciclo TCA)5. El ciclo truncado de TCA dirige la maquinaria de eliminación de parásitos a través del aumento de los niveles de succinato y citrato, que guían la producción de NO3. La acumulación de succinato por SDHA conduce a la activación del factor de transcripción factor 1-alfa inducible por hipoxia (HIF-1α), que induce la producción de IL-1β8. En el fenotipo M2, se observa oxidación de ácidos grasos, aumento en la utilización de glutamina y una mayor fosforilación oxidativa de la glucosa junto con la producción de citocinas antiinflamatorias como la interleucina-10 (IL-10), el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), la interleucina-4 (IL-4) y la interleucina-13 (IL-13)3. M2 exhibe mitocondrias alargadas como una característica distintiva, lo que conduce a una mayor eficiencia en la generación de energía. Utilizan ácidos grasos, glucosa y glutamina como sustratos para alimentar el ciclo del TCA, generando así ATP a través de la fosforilación oxidativa a una tasa más alta para promover el crecimientoy la proliferación de parásitos. La enzima SDHA responsable de la acumulación de succinato a través del TCA truncado no solo puede promover la producción de NO, sino también iniciar un consumo de oxígeno dependiente de succinato a través del transporte de electrones10. En los macrófagos infectados con Leishmania, la SDHA se regula a la baja en 2,17 veces, lo que indica que la respiración aeróbica también podría estar regulada a la baja11. Con el fin de aumentar el consumo de succinato para inducir la producción de NO mediada por citocinas proinflamatorias y promover la eliminación del parásito, la expresión de SDHA es esencial.
El circuito sintético ofrece terapias dirigidas de precisión que pueden alterar el sistema enfermo para lograr una oscilación biestable que puede restaurar un fenotipo saludable a nivel espacio-temporal. La entrega y la expresión del circuito sintético hacen que el sistema sea dinámico y robusto. Un factor fundamental que contribuye al avance de la biología sintética radica en la capacidad de ensamblar partes y elementos genéticos de manera modular para permitir la generación de arquitecturas complejas y funcionalidades personalizadas12. Las limitaciones asociadas con las técnicas de expresión tradicionales han estimulado la aparición de circuitos sintéticos de plásmidos inducibles basados en operones de tetraciclina, lo que permite una evaluación rápida del plásmido y una fácil administración en varios tipos de células13. La proteína represora que responde a la tetraciclina (TetR), cuando existe como dímero, exhibe una fuerte afinidad de unión al operón tet (TetO), suprimiendo eficazmente la transcripción. Sin embargo, tras la interacción de su ligando, la doxiciclina (dox), TetR sufre una alteración estructural, lo que resulta en su disociación de TetO, lo que permite que la transcripción continúe sin obstáculos. Este circuito puede exhibir control de la traducción de proteínas14. Por lo tanto, a través de la metodología definida, se permitió que el circuito sintético de plásmido inducible basado en operones de tetraciclina diseñado expresara SDHA en el vector pEGFP-N1. La evaluación de la eficiencia de transformación del circuito y su rendimiento proporcionó información sobre la competencia de entrega. A través de la digestión restringida del vector, se confirmó la determinación de la eficiencia de la clonación. Además, se observó una línea celular de macrófagos de ratón RAW264.7 transfectada derivada de macrófagos peritoneales de ratones Balb/c para la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) dependiente de la dosis de doxiciclina en células transfectadas. Además, se corroboró el efecto de eliminación del parásito en las células transfectadas con una expresión del circuito sintético. Además, se observó la inducción y expresión de citoquinas proinflamatorias, que se dirigió a través de un aumento en el punto de tiempo de infección en el circuito sintético transfectado e inducido por las células, lo que se asoció directamente con el funcionamiento del circuito sintético.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; L puntas</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>10X tampón de restricción</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Restricción digestión</td></tr><tr><td>1mL puntas</td><td>Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>1mL</td><td>tubo Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; Puntas en L</td><td>Tarson</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>matraz de 25cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>tinción nuclear</td></tr> tubo de <tr><td>50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>placas de 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt Cian/Orange Tampón</td> <td>de cargaThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>Carga de muestras para AGE</td></tr><tr><td>96 placa de fondo de cubrepozos</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>Para la obtención de imágenes confocales y la transfección Micro</td></tr><tr><td>placa de prueba de 96 pocillos Pocillos de fondo plano</td><td>Tarson</td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>para AGE</td></tr><tr><td>Montaje de electroforesis en gel de agarosa</td><td>GeNei</td><td>93</td><td>para AGE</td></tr><tr><td>Flujo laminar bacteriano</td><td>ESCO Lifesciences 2120765</td><td></td><td>Para la transformación</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Flujo de aire laminar para cultivo celular</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>1323TS</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Raspador</td> celular <td>Genetix</td><td>90020</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Esparcidor celular</td><td>Fischer Centrífuga Scientific</td><td>12822775</td><td></td></tr><tr><td>para tubos de 1,5 ml</td><td>Centrífuga Eppendorf</td><td>EP5404000537</td><td></td></tr><tr><td>para halcón de 50 ml</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Clorode</td><td>Fischer Scientific</td><td>67-66-3</td><td>Para aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>incubadora de CO2</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>3110</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Cubeta</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td>Estimación de la concentración de plásmidos</td></tr><tr><td>CYTIVA IQ 500 generador de imágenes en gel</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>para AGE</td></tr><tr><td>DEPC TRATADO H2O 1000 ML</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>750023</td><td>Para el aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Merck</td><td>33429</td><td>Para la inducción de células transfectadas</td></tr><tr><td>Bloque calefactor seco</td><td>Labnet</td><td></td><td>Para la transformación e inactivación de enzimas de restricción</td></tr><tr><td>Medio Eagle modificado de Dulbecco</td> Centro Nacional de <td>Ciencia</td><td></td> Celular <td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00983</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Sigma</td><td>E7637</td><td>Para AGE</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminérgico tetraacético</td><td>Fischer Scientific</td><td>12635</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Microscopio de campo claro Evos</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td> <td>para la construcción de circuito sintético</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>FV31S-SW software</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Adquisición de imágenes</td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>1563411</td><td>para la transfección Método</td></tr><tr>de<td>montaje de Gibson para la clonación</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>Construcción de un circuito sintético</td></tr><tr><td>Prisma Graphpad</td><td></td><td></td><td>Análisis estadístico</td></tr><tr><td>Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4368814</td><td>para la síntesis de ADNc</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>13825</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td>Para transformación y selección de colonias</td></tr><tr><td>Caldo Luria Bertini</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td>Para cultivo E.coli</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP214</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Micro Filt Flujo de aire laminar vertical</td><td>Microfilt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Tira de 8 tubos, 0,1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4358293</td><td>para qRT-PCR</td></tr><tr><td>MicroAmp Tiras ópticas de 8 tapas</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4323032</td><td>para horno microondas qRT-PCR</td></tr><tr><td></td><td>LG</td><td>MC-7649DW</td><td>para AGE</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1 (IFN-&gamma;)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Sondas Taqman</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Sondas Taqman</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1(TGFB)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Sondas Taqman</td></tr><tr><td>Kit ELISA de ratón IL-10</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS614</td><td>para ELISA</td></tr><tr><td>Kit ELISA de ratón IL-12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS616</td><td>para ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky con pantalla táctil + &mu; Placa de caída</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>51119600DP</td><td>para mezcladores de microplacas ELISA</td></tr><tr><td>MX-M Mezclador de placas de cultivo celular de 96 pocillos ajustable 0-1500 rpm Agitador agitador de laboratorio</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centro Nacional de Biotecnología</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov</td><td></td><td>de información para la construcción de circuitos sintéticos</td></tr><tr><td>Cámara de Neubauer</td><td>Marienfeld superior</td><td>640010</td><td>Para el recuento de células</td></tr><tr><td>Matraz sin ventilación de 25cm2 </td><td>Corning 353014</td><td></td><td>Para el cultivo de parásitos</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>Enzima de restricción</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Biodesign</td><td>1QIA</td><td>Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3 software</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Olympus FV 3000</td><td>Olympus</td><td></td><td>Para la adquisición de imágenes confocales</td></tr><tr><td>Medios OPTI-MEM</td><td>Medios 31985070 Gibco</td><td></td><td>para la transfección</td></tr><tr><td>Vector pEGFP-N1 clonado con circuito sintético</td><td>Biomatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15070063</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Polietilenimina</td><td>MERCK</td><td>764965</td><td>para transfección</td></tr><tr><td>Acetato de potasio</td><td>Fischer Tampón</td><td>de YBP364500</td> Scientific <td>/ Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP366</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio Monobásico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Paquete de alimentación</td><td>BIORAD</td><td>1645070</td><td>para AGE</td></tr><tr><td>Registro de partes biológicas estándar https://parts.igem.org/Main_Page</td><td></td><td></td><td>para la construcción de circuitos sintéticos</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>Takara</td><td>38220090</td><td>para el aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>ARNasa A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td></td><td>12091021 Preparación de tampones / reactivos</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medio</td> Centro <td>Nacional de Ciencias</td><td></td> Celulares <td>Para el cultivo de parásitos</td></tr><tr><td>incubadora Shaker</td><td>REMI</td><td>CIS 24 plus</td><td>Para el cultivo de E.coli</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Qualigens</td><td>Q27605</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fischer Scientific</td><td>15895</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio Dibasic</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>Tampón / Reactivo preparación</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Estimación de la concentración de plásmidos</td></tr><tr><td>Spin win</td><td>Trason</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StepOne plus Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Tecnologías de vida 272006777</td><td></td><td>Para el software qRT-PCR</td></tr><tr><td>StepOne versión 2.3</td><td>Tecnologías</td><td></td> de vida <td>Para qRT-PCR</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), sin AmpErase UNG</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4366072</td><td></td></tr><tr><td>Tinker cell</td><td></td><td></td><td>Construcción y simulación de circuitos sintéticos</td></tr><tr><td>Escalera de ADN TrackIt 1 Kb Plus</td><td>ThermoFischer Scientific 10488085</td><td>para</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de aminometano Tris (hidroximetil) Himedia</td><td></td><td>MB029</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Tris-acetato-EDTA</td><td>SERVA</td><td>42549.1</td><td>Tampón / Preparación de reactivos</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Para recuento de células</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Enzima de restricción</td></tr></tbody></table>

circuitos inmunometabólicos en la infección para el avance de las terapias dirigidas al huésped

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

El inmunometabolismo es un determinante fundamental en la progresión de la leishmaniasis. El enfoque basado en la biología sintética ha atraído una atención significativa como un paso hacia la intervención terapéutica dirigida a los factores asociados al huésped que impulsan la leishmaniasis. La biología sintética implica la ingeniería de componentes genéticos de forma ortogonal y modular para modular con precisión los sistemas biológicos, impartiendo funciones novedosas a las células. En el estudio presentado, la elucidación de una línea sistemática para el desarrollo de un circuito sintético inducible controlado con tetraciclina (TetON) tuvo como objetivo administrar succinato deshidrogenasa como agente terapéutico para facilitar la eliminación de parásitos intracelulares de Leishmania . El protocolo descrito describe el diseño de un circuito sintético y su posterior validación. La estrategia propuesta también se concentra en la incorporación de circuitos sintéticos en la red troncal del plásmido como vehículo de entrega. Además, se utilizó maquinaria de administración que emplea nanopartículas basadas en poliplex para la entrega de circuitos sintéticos en líneas celulares de macrófagos murinos sin comprometer la morfología celular. Se llevó a cabo la estandarización del método para seleccionar las células transfectadas y determinar la concentración óptima de inducción para la expresión de circuitos sintéticos. Las observaciones revelan una clara reducción de la carga parasitaria intracelular en las células transfectadas en comparación con las células infectadas. Las citocinas proinflamatorias se expresaron después de la infección en células transfectadas e inducidas en circuitos sintéticos como mecanismo para promover la eliminación del parásito. Esto subraya el método basado en la biología sintética como un enfoque potente en la leishmaniasis al dirigirse a los factores del huésped asociados con la progresión de la enfermedad.

La disposición de las partes genéticas que forman el circuito sintético para expresar el circuito sintético se muestra en la (Figura 1A). Las partes correspondientes se clonaron en el vector pEGFP-N1 de forma ortogonal y modular, que se representa en la Figura 1B. La simulación del circuito sintético reveló una dinámica oscilatoria tanto en SDHA como en el represor de tetraciclina. Esta observación sugiere un patrón de expresión recíproca caracterizado por funciones de onda periódicas. El aumento en la concentración de SDHA puede atribuirse a la inducción de doxiciclina, mientras que la expresión de TetR puede ser el resultado de la disminución de los niveles de doxiciclina (Figura 1C). Dada la expresión oscilatoria inducible de SDHA y TetR observada in silico, se diseñó e implementó una estrategia para la entrega de circuitos sintéticos a través del vector plásmido pEGFP-N1.
Las partes de iGEM identificadas para el estudio incluyen BBa_K1493803 para TetO, BBa_K4344028 para la secuencia de Kozak, BBa_C0040 para TetR y BBa_K1537016 para P2A, respectivamente. El ID de acceso de NCBI para SDHA es NM_025848. Estos componentes se ensamblaron para construir un circuito sintético TetON inducible por doxiciclina, que abarca un total de 1317 pares de bases (Archivo Suplementario 1). Como TetO funciona como un elemento regulador del ADN, su secuencia no fue traducida. Se eligió la secuencia aguas abajo de la secuencia de Kozak, que se extiende desde 5' TetR hasta el extremo 3' de P2A, posicionada aguas abajo de SDHA, para la validación in silico de la traducción. La observación reveló la ausencia de codones de parada internos, lo que garantiza una traducción ininterrumpida a lo largo de toda la longitud de la secuencia (Archivo Suplementario 2). Las partes reguladoras de un circuito sintético que comprende 1317 pb se insertaron entre los sitios de restricción NotI y XhoI, que están a 5' aguas arriba de EGFP (Figura 1B). Los resultados de la secuenciación ponen de manifiesto que la secuencia de inserción se clonó en el plásmido (Archivo Suplementario 3).
La introducción de un circuito inmunometabólico en la cepa de E. coli DH5α condujo al crecimiento de colonias transformadas que exhiben resistencia a la kanamicina, el antibiótico empleado como marcador selectivo durante la transformación bacteriana. La abundante presencia de colonias transformadas en la placa de selección fue mayor, lo que sugiere que las células competentes mostraron un alto potencial de transformación, indicativo de la eficiencia del protocolo de transformación utilizado (Figura 1D).
Se aisló una sola colonia y se sembró en 10 mL de LB suplementado con kanamicina para el aislamiento del plásmido. El rendimiento de plásmidos derivado de un cultivo de 10 mL se detalla en la Tabla 1. Para este procedimiento se empleó un método estándar para el aislamiento de plásmidos. Las soluciones tampón se prepararon el día antes del aislamiento del plásmido y se optimizaron las condiciones de incubación para maximizar el rendimiento del plásmido. La concentración de plásmidos obtenida superó 1 μg/μL, con relaciones 260/280 y 260/230 que superaron 1,8 y 2,0, respectivamente. Estos hallazgos indican que los plásmidos aislados eran de alta pureza y desprovistos de contaminantes como proteínas, EDTA, carbohidratos y fenol.
Se evaluó el desplazamiento de la movilidad electroforética para el circuito sintético aislado. La digestión de restricción se realizó utilizando enzimas de restricción NotI y XhoI, ya que fueron los sitios de restricción donde se insertó el circuito sintético. Se observaron dos bandas en gel de agarosa al 1%, una banda cercana a 1500 pb y otra entre 4 kb y 5 kb. Dado que el tamaño del inserto es de 1317 pb, es probable que la banda a 1500 pb corresponda al inserto. El vector pEGFP-N1 tiene un tamaño de 4,7 kb. Por lo tanto, se supone que la banda cercana a 5 kb es el vector pEGFP-N1. En consecuencia, se dedujo que un circuito sintético completo e intacto estaba presente dentro del vector de entrega. Además, se detectó una banda de aproximadamente 6 kb para el circuito sintético intacto no digerido, lo que indica que el vector pEGFP-N1 alberga un inserto de casi 1,3 kb dentro del vector plásmido (Figura 1E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg"> Figura 1: Diseño y validación de circuito sintético. (A) Representación de circuitos sintéticos mediante el ensamblaje de partes genéticas y componentes reguladores. (B) Gráfico de simulación determinista que muestra la expresión periódica de SDHA y TetR a 100 unidades de tiempo. (C) Circuito sintético transformado de colonias de E. coli DH5α resistentes a kanamicina. La unidad es una unidad de 100 tiempos, ya que es una simulación determinista. (D) Electroforesis en gel de agarosa de circuito sintético intacto y digerido por restricción utilizando enzimas de restricción NotI y XhoI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentración de plásmido (μg/mL)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr><tr><td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr><tr><td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr><tr><td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Rendimiento de la construcción de circuito sintético obtenida después del aislamiento del plásmido. La tabla muestra la concentración de plásmido en μg/mL, su relación 260/280 y 260/230.
En las células control e infectadas, la intensidad de fluorescencia observada fue baja para GFP. Sin embargo, se observó que la transfección del circuito sintético con una proporción de plásmido y PEI de 1:1 con 500 μg/mL de G418 y la inducción con 1 μg/μL de dox inducían una alta expresión de GFP en las células IMT. En las células IMTI a las 6 h, la expresión de GFP también fue significativamente mayor, aunque la expresión de GFP fue menor que en la muestra de IMT (Figura 2A,B). Además, se observó un aumento en la expresión de GFP en las muestras de IMTI de 12 h, IMTI de 18 h y IMTI de 24 h. Este aumento puede deberse a un aumento en el tiempo de infección, que podría haber inducido mayores alternancias metabólicas en macrófagos por parásito residencial17. Los niveles intracelulares de SDHA podrían verse afectados debido a un aumento en el tiempo de infección18. A medida que el dox se complementó con estas muestras de IMTI, los niveles de SDHA a través de circuitos sintéticos podrían haber aumentado, lo que condujo a un aumento en la expresión de SDHA.
La tinción con DAPI se realizó para identificar el número de parásitos residenciales en los macrófagos. En 6 h L. de macrófagos principales infectados, el número observado de parásitos intracelulares fue de 6 células por macrófago, que es mayor en comparación con la muestra IMTI de 6 h, que tenía 1-2 parásitos intracelulares por macrófago. Después de la transfección y la inducción de dox, se observó una reducción significativa en la carga parasitaria intracelular en diferentes puntos temporales de la infección (Figura 2C). Las observaciones sugirieron que los circuitos sintéticos pueden haber inducido efectos de eliminación de parásitos al estimular la expresión de SDHA.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg"> Figura 2: Microscopía de barrido láser confocal. Imágenes de muestras de control, infectadas, IMT e IMTI. (A) Análisis de la expresión de GFP en todas las muestras experimentales con una barra de escala de 50 μm para control, 6 h infectadas e IMT, 20 μm para IMTI de 6 h, 10 μm para IMTI de 12 h, IMTI de 18 h, IMTI de 24 h respectivamente. Los canales utilizados fueron DIC, DAPI, GFP e imágenes fusionadas de todos los canales. (B) ANOVA de un factor con la prueba de corrección de Tukey de todas las muestras experimentales (n = 3) para la expresión de GFP (p &lt; 0.05 se considera significativo) Las barras de error representan la desviación estándar. (C) Se realizó un análisis de ANOVA de una vía con la prueba de corrección de Tukey de la carga parasitaria en 100 células de macrófagos para muestras de (A) (n = 3) (p &lt; 0.05 se considera significativo). Las barras de error representan la desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La detección de los niveles de IL-10 e IL-12 en los medios de todas las muestras reveló que las concentraciones de IL-10 e IL-12 fueron más altas a las 6 h después de la infección, con una regulación a la baja en los niveles de citocinas después de la infección a las 24 h. No hubo diferencias significativas en los niveles de IL-10 e IL-12 tras la transfección e inducción de circuitos sintéticos. Además, hubo una diferencia no significativa en los niveles de IL-10 e IL-12 en las muestras de puntos de tiempo IMTI (Figura 3). La muestra infectada a las 6 h ya ha sido reportada para mostrar expresión de IL-10 e IL-1219,20, observándose una diferencia no significativa en IL-10 e IL-12 nos llevó a investigar el efecto del circuito sintético sobre otras citocinas.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg"> Figura 3: ELISA de IL-10 e IL-12 para identificar sus niveles secretores en medios de diferentes muestras. Las muestras (n = 2) incluyen control, 6 h infectados, 24 h infectados, IMT, 6 h IMTI, 12 h IMTI, 18 h IMTI, 24 h IMTI. Se realizó un ANOVA de dos vías con el análisis de la prueba de corrección de Tukey (p &lt;,05 se considera significativo). Las barras de error representan la desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La detección de los niveles de transcripción de TNF-α, IFN-γ y TGF-β en muestras infectadas de 6 h, IMT y 24 h IMTI reveló que se observó un aumento significativo de TNF-α a 2,5 veces en la muestra de IMTI de 24 h en comparación con las muestras de infección e IMT (Figura 4). En la muestra de IMTI de 24 h, se observó un aumento de 35 veces en los niveles de IFN-γ en comparación con las muestras de infección y IMT. Los niveles de TGF-β, aunque mostraron una regulación positiva significativa a 1,5 veces en la muestra de IMTI de 24 h, el cambio relativo del pliegue fue menor en comparación con TNF-α e IFN-γ, lo que sugiere que las citocinas proinflamatorias están significativamente reguladas al alza en la muestra de IMTI de 24 h.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg"> Figura 4: Análisis qRT-PCR de citoquinas. (A) TNF-α, (B) IFN-γ y (C) TGF-β para muestras de 6 h infectadas, IMT y 24 h IMTI (n=2). Se realizó un ANOVA de un factor con la prueba de corrección de Tukey (p &lt; 0,05 se considera significativo). Las barras de error representan la desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Ficha complementaria 1: Secuencia de nucleótidos de partes genéticas ensambladas para formar el circuito sintético. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: Secuencia traducida de circuito sintético que expresa TetR, P2A y SDHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Ficha complementaria 3: Resultado de la secuenciación del circuito sintético clonado en el plásmido pEGFP-N1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Aquí, se presenta un protocolo para diseñar, construir y administrar un circuito sintético inducible basado en tetraciclinas. El efecto de los circuitos sintéticos sobre la eliminación de parásitos y la expresión de citoquinas se puede estudiar mediante la canalización de la tubería presentada. Este protocolo es relevante para los investigadores que estudian terapias basadas en circuitos sintéticos en enfermedades infecciosas.

Circuitos inmunometabólicos en la infección para el avance de las terapias dirigidas al huésped

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

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Bioengineering

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Los monocitos son componentes integrales del sistema inmune innato humano que dependen del metabolismo glucolítico cuando se activan. Describimos un protocolo de citometría de flujo para medir la expresión del transportador de glucosa y la absorción de glucosa por monocitos totales y subpoblaciones de monocitos en sangre total fresca.

Una citometría de flujo simple método para medir la captación de glucosa y la expresión del transportador de la glucosa por monocitos subpoblaciones en sangre entera

Este protocolo describe cómo inocular ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) y para medir el interferón-γ (IFN-γ) las respuestas de las células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), y adaptativa linfocitos T después de la infección. Este protocolo también describe cómo llevar a cabo estudios de supervivencia en ratones después de la infección con una dosis DL50 modificada del patógeno.

La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

Este protocolo describe un flujo de trabajo detallado para la generación y ex vivo de caracterización de virus oncolíticos para expresión de inmunomoduladores, usando virus de sarampión codificación tienen células T actores como ejemplo. Aplicación y adaptación a otras plataformas de vector y los transgenes acelerarán el desarrollo de nuevos immunovirotherapeutics para la traducción clínica.

Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo

Describimos una célula mononuclear de sangre periférica humana (PBMC), modelo de ratón xenoinjerto humanizado basado para la investigación traslacional de inmunooncología. Este protocolo podría servir como una guía general para establecer y caracterizar modelos similares para la evaluación de la terapia I-O.

Un modelo de xenoinjerto humanizado de sangre periférica humana (PBMC) para la investigación de inmunooncología traslacional (I-O)

En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular, la biología del cáncer requiere nuevas herramientas in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado. Describimos protocolos para explotar cocultivos microfluídicos inmunes al tumor en entornos 2D y 3D, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico de las funciones celulares.

Modelos de cocultivo microfluídico para diseccionar la respuesta inmune en microambientes tumorales in vitro

Los inmunoensayos basados en sangre total proporcionan una herramienta fácil y eficiente en recursos para analizar la inmunidad específica del antígeno con fines de diagnóstico e investigación. Este artículo proporciona un protocolo optimizado basado en sangre total con coestimulación dual para un análisis exhaustivo de la inmunidad del huésped a patógenos fúngicos y virales, incluida una versión de bajo volumen para pacientes pediátricos y animales pequeños.

Ensayo de sangre total con coestimulación dual para el análisis específico de antígenos de la inmunidad del huésped a patógenos fúngicos y virales

Este informe describe un protocolo automatizado para ensayos de inmunofluorescencia múltiple (mIF) en un tintor de portaobjetos automatizado. Demuestra la alta reproducibilidad de la proteómica espacial en autotinciones tisulares estándar de alto rendimiento y generadores de imágenes de fluorescencia de portaobjetos completos, lo que es ideal para ensayos mIF personalizados en un gran número de portaobjetos de tejido en investigación traslacional.

Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

El presente protocolo describe un flujo de trabajo experimental que permite el análisis ex vivo de la estimulación de células T humanas en un sistema de cocultivo alogénico con células tumorales pretratadas.

Análisis de la actividad de las células T humanas en un entorno de cocultivo alogénico de células tumorales pretratadas

Este artículo describe un método versátil para crear células derivadas de los anillos de tejido celular por auto-ensamblaje. Las células musculares lisas sembradas en forma de anillo total de agarosa pozos y el contrato de forma sólida en tres dimensiones (3D) de los tejidos dentro de 7 días. A escala milimétrica los anillos de tejido son propicias para los ensayos mecánicos y servir de base para el montaje del tejido.

Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos

Este protocolo muestra los métodos utilizados para establecer entornos 2D y 3D en las cámaras de electrotactic de diseño personalizado, que puede rastrear las...

Campo eléctrico controlado por migración dirigida de células progenitoras neurales en entornos 2D y 3D

Aprende a diseñar circuitos sintéticos inducibles controlados por tetraciclina para eliminar Leishmania major y modular citocinas en macrófagos. Este protocolo avanza terapias inmunometabólicas dirigidas al huésped contra la leishmaniasis.

Circuitos inmunometabólicos en la infección para el avance de las terapias dirigidas al huésped

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