Name: Implantación de dispositivos optoelectrónicos en la médula espinal de los roedores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Aprenda a implantar sondas optoelectrónicas en la médula espinal de roedores mediante laminectomía lateral o medial. Este protocolo accesible permite investigar los circuitos neuronales espinales sin requerir experiencia quirúrgica previa.

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S.S. está parcialmente financiado por una beca doctoral de cuatro años de la Universidad de Columbia Británica. A.M. cuenta con el apoyo parcial de una beca de posgrado de Canadá - Maestría del Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR). D.S. agradece la financiación del premio Michael Smith Health Research British Columbia Scholar Award. Este trabajo fue parcialmente financiado por el Fondo de Nuevas Fronteras en Investigación - Transformación del Gobierno de Canadá (NFRFT-2020-00238). El esquema de la Figura 1 se generó utilizando Biorender.com y el modelo 3D se obtuvo con el permiso de sketchfab.com.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas del Consejo Canadiense para el Cuidado de los Animales y supervisados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Columbia Británica. Las ratas hembras Long-Evans, con un peso de 350-450 g y una edad de 6-8 meses, fueron alojadas en grupo (21 °C; ciclo de luz de 12 h:12 h) y se les dio acceso ad libitum a una dieta estándar para roedores antes y después de la cirugía. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados para este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación preoperatoria
<ol><li>Esterilice todas las herramientas quirúrgicas utilizando un autoclave.</li>
	<li>Anestesiar al animal con isoflurano (5% para inducción y 2% para mantenimiento) suministrado en oxígeno a un caudal de 1 L/min.</li>
	<li>Transfiera el animal de la cámara de inducción a una almohadilla térmica y conecte rápidamente el cono nasal de isoflurano. Verifique que el animal esté bajo un plano quirúrgico de anestesia asegurándose de una pérdida completa del reflejo de pellizco de los dedos del pie en ambas patas.</li>
	<li>Afeita la espalda de la rata comenzando por la base de las orejas, como se muestra en la Figura 2A.</li>
	<li>Aplique una cantidad generosa de ungüento oftálmico estéril sobre los ojos e inyecte buprenorfina (diluida a 0,03 mg/kg) y 10 ml de ringers lactatos por vía subcutánea (calentada a la temperatura corporal).</li>
	<li>Limpie el área afeitada con un exfoliante quirúrgico antiséptico (clorhexidina) seguido de alcohol isopropílico con movimientos circulares comenzando desde el centro del área afeitada y ensanchando el diámetro del círculo. Repite el proceso de jabón/alcohol dos veces más.</li>
	<li>Asegure al animal en un marco estereotáxico, colocando la cabeza usando barras auditivas lubricadas para mayor estabilidad (Figura 2A). NOTA: A lo largo de todo el procedimiento, proporcione soporte térmico de manera constante, verifique la profundidad de la anestesia a través del reflejo de pellizco de los dedos de los pies y controle los signos vitales.</li>
	<li>Coloque un paño quirúrgico estéril encima del animal.</li>
</ol>2. Exposición de la médula espinal cervical
<ol><li>Usando pinzas estériles, comience palpando la base del cráneo. Siente una apófisis espinosa prominente que se extiende rostrocaudalmente cerca de la base del cráneo; esto es C214 (Figuras 1B y Figura 2B).</li>
	<li>Proceda con la palpación caudal a C2 para encontrar una apófisis espinosa notablemente aguda y puntiaguda, identificable como T215 (Figuras 1B y Figura 2C).</li>
	<li>Con un bisturí, haga una incisión en la piel, comenzando desde C2 y extendiéndose caudalmente durante aproximadamente 1,5 cm (Figura 2D). NOTA: El tamaño de la incisión puede variar entre animales de diferentes tamaños. Asegúrese de identificar los puntos de referencia anatómicos con anticipación y proceda en consecuencia.</li>
	<li>Corta cuidadosamente la capa adiposa subcutánea con el bisturí para exponer la musculatura dorsal subyacente intacta.</li>
	<li>Una vez que los músculos dorsales estén expuestos, realice una disección roma separándolos de la línea media con dos pinzas de Adson (Figura 2E). NOTA: Es importante realizar una disección roma (separando las fibras musculares) en lugar de cortar los músculos para minimizar el sangrado. La exposición adecuada de la musculatura dorsal debe revelar un músculo en forma de bola (Figura 2G). Este músculo cubre completamente C2 y cubre parcialmente C3.</li>
	<li>Con ayuda de rongeurs y pinzas estériles, levante un colgajo de piel inmediatamente caudal a la zona incisa. Use rongeurs para crear una pequeña bolsa subcutánea: esta será la ubicación del dispositivo (Figura 2F). NOTA: El bolsillo subcutáneo debe ser más grande que el propio dispositivo. Se recomienda que el cirujano o cirujanos se reposicionen para mirar al animal hacia delante para mejorar el control y la visibilidad al abrir la bolsa subcutánea.</li>
	<li>Colocar un retractor para exponer la columna vertebral (Figura 2G).</li>
	<li>Con el uso de rongeurs, retire cualquier músculo o tejido restante que cubra las vértebras y comience a identificar los segmentos de la médula espinal. Inmediatamente caudal al músculo en forma de bola se encuentra C4, seguido de C5 y C6 (Figura 2G-I). Una vez completado, enjuague el área quirúrgica con solución salina estéril y seque con gasa estéril. NOTA: El músculo en forma de bola envuelve completamente a C2 y se extiende parcialmente sobre C3. El segmento de la médula espinal directamente caudal a él, con un contacto mínimo, se designa como C4.</li>
	<li>Realice laminectomías en función de la finalidad prevista de la sonda.<ol><li>Para una sonda debajo de la lámina, realice una laminectomía lateral en C5 y C6, creando una abertura lateralizada en la lámina para la colocación futura de la sonda (Figura 2H, Figura complementaria 1A).</li>
		<li>Para una sonda sobre la lámina, realice una laminectomía medial de C5, asegurándose de no extirpar los aspectos laterales de la apófisis espinosa, simplemente exponiendo una vía medial para la colocación de la sonda (Figura 2I, Figura complementaria 1B).</li>
		<li>Después de la laminectomía, enjuague la región con solución salina estéril y séquela con gasa estéril para eliminar cualquier residuo óseo. NOTA: Al realizar la laminectomía, es fundamental empujar los rongeurs contra el hueso y evitar cualquier movimiento hacia abajo para evitar daños en el cordón.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Colocación epidural del dispositivo
<ol><li>Sujete el dispositivo estéril con pinzas estériles de punta de plástico (Figura 3A) e introdúzcalo dentro de la abertura subcutánea realizada anteriormente en el paso 2.9. NOTA: Es fundamental evitar tocar el dispositivo con guantes/herramientas no estériles para mantener la esterilidad del dispositivo. Use pinzas estériles designadas para colocar el dispositivo debajo de la piel.</li>
	<li>Suturar o pegar el dispositivo a la capa muscular vecina para mantenerlo seguro (Figura 3B). NOTA: Utilice suturas no absorbibles si sutura el dispositivo a los músculos. De lo contrario, el dispositivo es propenso a moverse después de la absorción de la sutura en el cuerpo. Si usa pegamento, asegure la estabilidad a largo plazo y la biocompatibilidad del pegamento/adhesivo. Evite fijar el dispositivo a la capa subcutánea de grasa/adiposo para garantizar puntos de anclaje fiables.<ol><li>Planifique la posición del cuerpo del dispositivo antes de continuar con este paso. Dado que el dispositivo estará sujeto permanentemente, pueden surgir problemas con la colocación de la sonda (paso 3.4) si el dispositivo se encuentra demasiado cerca o demasiado lejos del nivel deseado en la médula espinal.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque el retractor alrededor de la médula espinal y abra una ventana adecuada para colocar la sonda en la médula espinal.</li>
	<li>Colocación de sondas:<ol><li>Colocación de la sonda debajo de la lámina: Inserte cuidadosamente la sonda con pinzas de punta de plástico debajo de las láminas (C5 y C6) deslizándola a través de los canales lateralizados realizados en el paso 2.9.1 (Figura 3D).</li>
		<li>Colocación de la sonda sobre la médula espinal:<ol><li>Ajuste la sonda con pinzas de punta de plástico para alinear y coloque la punta de la sonda en la parte superior de la ventana medial creada en C5 en el paso 2.9.2 (Figura 3C).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>En un recipiente estéril, pequeño y preferiblemente cerámico, prepare el cemento mezclando una cucharada de cemento dental en polvo, 3 gotas de grasa de alta tecnología y una gota de catalizador. Mezclar con palillos estériles hasta conseguir una consistencia viscosa. NOTA: Se recomienda encarecidamente que una persona que no esté realizando la cirugía prepare el cemento para que el cirujano pueda mantener la sonda en su lugar y secar el área deseada inmediatamente antes de aplicar el cemento. Este paso es urgente. Asegúrese de que el cirujano coloque la sonda antes de preparar el cemento. Una vez que se aplica el catalizador, el cemento se espesará demasiado para unirse eficazmente con el hueso si hay un retraso. Practique con el cemento antes de la cirugía para asegurarse de lograr la consistencia adecuada antes de colocarlo en la sonda/hueso.</li>
	<li>Seque completamente el área de cementación prevista en las vértebras para crear un punto de anclaje confiable. Aplique 1-2 gotas de cemento dental en la punta de la sonda, que debe colocarse sobre el nivel vertebral previsto, en este caso, C4 (Figura 3C,D). NOTA: Es fundamental que las vértebras estén lo más secas posible antes de la cementación. De lo contrario, el cemento no se adherirá y la sonda no estará asegurada.</li>
	<li>Haga una pausa de 30 segundos y toque suavemente el cemento para verificar que esté curado.</li>
	<li>Si el cemento no está completamente curado, espere 20 segundos adicionales y vuelva a aplicar cemento recién hecho hasta que la sonda esté firmemente asegurada al hueso. NOTA: El cemento se ha adherido correctamente cuando se vuelve duro y rígido al tacto. PRECAUCIÓN: Aplicar el cemento mientras está demasiado líquido puede hacer que se filtre en el tejido de la médula espinal entre las vértebras. Si esto ocurre, espere aproximadamente 10 segundos para que el cemento se espese hasta obtener una consistencia más parecida a la goma antes de usar suavemente pinzas para eliminar el cemento que ha entrado en contacto con la médula espinal.</li>
</ol>4. Procedimientos postquirúrgicos
<ol><li>Una vez finalizada la cirugía, sutura el sitio de la incisión con suturas de vicryl 5-0. Retire suavemente al animal del aparato estereotáxico y transfiéralo a una cámara de recuperación calentada. Durante los primeros 3 a 5 días después de la cirugía, proporcione al animal comida blanda y humedecida, golosinas y agua de hidrogel.</li>
	<li>Monitoree minuciosamente al animal dos veces al día durante la primera semana después de la cirugía. Administre buprenorfina e inyecciones de Ringer lactato calentado dos veces al día durante los 2 días siguientes, o más tiempo si los signos de dolor persisten. Continúe con los controles diarios hasta que el animal no muestre problemas de salud clínica. A partir de entonces, controle al animal al menos una vez por semana.</li>
	<li>(Opcional) Delinee el perímetro del dispositivo en la piel después de la cirugía y el cierre de la incisión para obtener una indicación visual de la ubicación del dispositivo en el cuerpo (Figura 4A). NOTA: Este paso es particularmente útil cuando el dispositivo requiere acceso externo, como los dispositivos que necesitan ser alimentados de forma inalámbrica a través de un transmisor externo donde el acoplamiento de la antena es crítico, o las bombas de administración de fármacos que deben rellenarse a través de la piel 16,17,18.</li>
</ol>

Cirugía de la médula espinal e implante óptico de vástago en roedores

<ol><li>Osseward, P. J., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+and+circuit+modules+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cell type and circuit modules in the spinal cord.</a> Curr Opin Neurobiol. 56, 175-184 (2019).</li>
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<li>Keomani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+cervical+spinal+cord+injury+to+study+post-lesional+respiratory+neuroplasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A murine model of cervical spinal cord injury to study post-lesional respiratory neuroplasticity.</a> J Vis Exp. (87), e51235(2014).</li>
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<li>Agrawal, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformal+phased+surfaces+for+wireless+powering+of+bioelectronic+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Conformal phased surfaces for wireless powering of bioelectronic microdevices.</a> Nat Biomed Eng. 1 (3), 0043(2017).</li>
<li>Park, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretchable+multichannel+antennas+in+soft+wireless+optoelectronic+implants+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (50), E8169-E8177 (2016).</li>
<li>Manoufali, M., Bialkowski, K., Mohammed, B., Abbosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+power+link+based+on+inductive+coupling+for+brain+implantable+medical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Antennas+and+Wirel+Propaga+Lett%22%5BJournal%5D)">Wireless power link based on inductive coupling for brain implantable medical devices.</a> IEEE Antennas and Wirel Propaga Lett. 17 (1), 160-163 (2018).</li>
<li>Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rating+scale+for+open-field+evaluation+of+behavioral+recovery+after+cervical+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats.</a> J Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+use+of+wireless+reprogrammable+multilateral+optogenetic+devices+for+behavioral+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation and use of wireless reprogrammable multilateral optogenetic devices for behavioral neuroscience.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1073-1096 (2022).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+multilateral+devices+for+optogenetic+studies+of+individual+and+social+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors.</a> Nat Neurosci. 24 (7), 1035-1045 (2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

La neuromodulación y las intervenciones terapéuticas de la médula espinal a menudo requieren la colocación de sondas en segmentos precisos y dirigidos 3,4,7,13. Dada la movilidad inherente de la médula espinal, la sonda debe estar asegurada de forma fiable para permitir estudios crónicos. Según la aplicación específica, puede ser importante controlar si la sonda está en contacto físico con la médula espinal, o si el contacto se puede reducir para disminuir la respuesta del tejido inflamatorio cuando sea posible. Por lo tanto, se describen los pasos quirúrgicos para cada uno de los dos métodos. El protocolo detalla específicamente cómo colocar una sonda en el segmento cervical de la médula espinal en C5. No obstante, utilizando el punto de referencia descrito para T2 o T10 de la médula espinal, la sonda se puede colocar de manera similar en una ubicación precisa sobre la región torácica o lumbar mediante la cuenta regresiva de las vértebras desde T2 o T10, respectivamente, una vez que están expuestas. Además, para minimizar el daño al tejido de la médula espinal, aseguramos el cuerpo del dispositivo, que suele ser más grande y rígido en comparación con la sonda conectada, en un espacio subcutáneo alejado de la médula espinal.
Hay algunos puntos críticos para implantar el dispositivo que se acopla con la sonda. En primer lugar, es fundamental decidir la ubicación del cuerpo del dispositivo antes de cementar la sonda. Esto garantiza que la distancia entre la punta de la sonda y el cuerpo del dispositivo esté optimizada para reducir la tensión en la sonda, así como para evitar tener una longitud adicional de la sonda, lo que puede, por ejemplo, causar torsión o desplazamiento de la sonda. Esencialmente, el objetivo es garantizar que la longitud de la sonda sea similar a la distancia desde el espacio subcutáneo donde se coloca el cuerpo del dispositivo hasta la región de la médula espinal objetivo donde se cementa la sonda. Mediante la realización de procedimientos de cirugía terminal en los que se prueban varias longitudes de sonda, se puede determinar el tamaño óptimo para un segmento específico.
Para mantener la esterilidad, el dispositivo debe manipularse con cuidado para evitar el contacto con la capa externa de la piel durante la inserción en la bolsa subcutánea. Dicho contacto puede comprometer la esterilidad del dispositivo, lo que puede provocar una infección postoperatoria. Además, es importante minimizar la cantidad de fuerza aplicada al dispositivo al sujetarlo con pinzas para evitar dañar su recubrimiento, que suele ser una fina capa protectora, aislante y estéril20,21. La eliminación del recubrimiento puede reducir drásticamente la vida útil del dispositivo, por ejemplo, acortando el circuito, causando una descarga eléctrica al animal y/o provocando una respuesta inflamatoria en el cuerpo. Manipular el dispositivo con pinzas de punta de plástico puede ayudar a reducir estas complicaciones.
Al suturar el dispositivo a los tejidos blandos, es importante evitar suturar el tejido adiposo subcutáneo. Como se observó en ensayos preliminares, las capas de grasa no son un punto de anclaje confiable para las suturas, ya que son propensas a romperse. En su lugar, el cuerpo del dispositivo se suturó a una capa muscular adyacente en el espacio subcutáneo utilizando suturas no absorbibles para la colocación permanente del dispositivo en el cuerpo. Por otro lado, al asegurar la sonda a los procesos espinosos, es importante asegurarse de que el sitio al que se asegura la sonda esté seco antes de aplicar el cemento. El hueso/sonda mojado prolonga el tiempo de curado y puede resultar en el fracaso completo del proceso.
Hay algunas consideraciones críticas asociadas con un dispositivo implantable que deben abordarse cuidadosamente antes de la cirugía de implantación. (1) Las partes eléctricamente activas del dispositivo deben estar encapsuladas por una capa de pasivación aislante. Cualquier privación en la capa pasivante podría causar un error funcional del dispositivo. (2) El implantable debe estar completamente esterilizado de acuerdo con el protocolo de animales de la instalación. (3) La unión entre el dispositivo y las sondas neuronales o los vástagos estimuladores debe estar formada de forma segura. La conexión pasará por un esfuerzo mecánico repetitivo debido a los movimientos constantes de los animales. (4) Las sondas neuronales o los vástagos estimuladores conectados al dispositivo deben ser lo suficientemente flexibles y elásticos para evitar que se rompan en varios puntos.
El protocolo descrito puede extenderse a dispositivos de implante en modelos animales de diferentes tamaños. Después de identificar los puntos de referencia anatómicos, los métodos quirúrgicos descritos se pueden personalizar metódicamente para asegurar cualquier sonda neural o vástago estimulador en segmentos específicos de la médula espinal e implantar sus módulos de control asociados. Sin embargo, dependiendo de la aplicación, los diferentes dispositivos pueden tener diferentes tamaños, materiales y espesores del implantado en este documento; Por ejemplo, los dispositivos conectados a un módulo de control externo requieren consideraciones adicionales. Además, hay que tener en cuenta que, si bien este protocolo está diseñado para la estimulación optogenética, otras aplicaciones neuromoduladoras, como la administración de fármacos o la estimulación/registro eléctrico, requieren procedimientos quirúrgicos ligeramente diferentes. Específicamente, estas aplicaciones necesitan implante subdural para asegurar el contacto directo con la médula espinal debajo de la duramadre7. Sin embargo, para la optogenética, el contacto íntimo con el tejido suele ser innecesario porque la duramadre del roedor no impide significativamente la penetración de la luz, lo que permite colocar fuentes de luz por vía epidural10.

La médula espinal facilita una serie de funciones esenciales del sistema nervioso central, desde la coordinación de comportamientos motores hasta la regulación de procesos homeostáticos como la respiración 1,2. Dilucidar el papel de la sofisticada red de circuitos a través de la médula espinal requiere interfaces, ya sea para la estimulación eléctrica, el registro, la administración de fármacos o la estimulación óptica a áreas específicas 3,4,5,6. A pesar de haber sido desarrollados dispositivos para permitir tales interrogatorios 7,8,9,10,11, se requieren técnicas quirúrgicas especializadas para su implantación crónica en la médula espinal 4. En particular, la médula espinal y las vértebras asociadas tienen una mayor susceptibilidad a las deformaciones mecánicas causadas por movimientos naturales como la extensión y la flexión 8,12,13. Estas características únicas de la médula espinal hacen que sea intrínsecamente difícil garantizar que las sondas implantadas permanezcan estables, funcionales y aseguradas en un segmento específico durante largos períodos de tiempo.
En este artículo, se describe un protocolo quirúrgico para insertar y asegurar un vástago óptico en un segmento específico de la médula espinal (Figura 1A). Dado que se ha demostrado que la interfaz con la región cervical en particular presenta desafíos únicos9, los pasos de implantación se demuestran específicamente sobre la región cervical C5. Se postula que la complejidad de la columna cervical surge de su posición más profunda y la abundancia de musculatura, una característica no tan prominente a lo largo del resto de la médula espinal. En cualquier caso, los procedimientos descritos en este protocolo están diseñados para ser adaptables a cirugías en varias regiones de la médula espinal. Se proporcionan instrucciones escalonadas para localizar e identificar segmentos de la médula espinal utilizando "puntos de referencia" anatómicos pronunciados identificables desde arriba de la piel (Figura 1B). A continuación, el protocolo aclara dos técnicas para la implantación quirúrgica: una adaptada para las sondas que requieren contacto directo con la médula espinal y otra para las sondas que pueden no requerir contacto directo. Los pasos descritos están diseñados para ser reproducidos por cualquier investigador con formación en cirugía de supervivencia de roedores.
Este protocolo incluye instrucciones paso a paso para la implantación de un dispositivo optoelectrónico (18 mm x 13 mm) con un vástago óptico flexible adjunto sobre el nivel cervical C5. El dispositivo implantable se fija subcutáneamente caudal a C5 y consta de un indicador de diodo emisor de luz (μLED) a microescala, que se ilumina cuando se produce la estimulación óptica de la médula espinal, proporcionando información en directo de la funcionalidad del dispositivo. Se evaluó el efecto del vástago óptico implantado en la función motora natural en roedores que habían recibido implantes y se comparó con roedores con cirugías simuladas. Los resultados indican que las sondas no afectan negativamente a la función natural de las extremidades posteriores y anteriores del animal siete días después de la implantación.

<table><tbody><tr><td>Pinzas de Adson&nbsp;</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Alm Retractor de 3 puntos</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>17010-10</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina / Vetergesic&nbsp;</td><td>CDMV</td><td>124918</td><td>El fabricante proporciona a 0,3 mg/mL, pero debe diluirse a 0,03 mg/kg para su uso en ratas</td></tr><tr><td>Solución de clorhexidina al 2%</td><td>Partnar</td><td>PCH-020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de hemostático largas curvadas</td><td>KaamKaaj Tools</td><td>14.5</td><td>Pinzas de hemostático largas curvadas con pinza de bloqueo de trinquete de acero inoxidable</td></tr><tr><td>Máquina de parileno CVD: SCS Labcoter 2</td><td>Sistemas de recubrimiento especiales</td><td>PDS 2010</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dental - Catalizador&nbsp;</td><td>Parkell, Inc</td><td>S371</td><td></td></tr><tr><td>Cemento Dental - Metabond</td><td>Parkell, Inc</td><td>S398</td><td></td></tr><tr><td>Cemento Dental - Polvo&nbsp;</td><td>Pinzas Parkell, Inc</td><td>S396</td><td></td></tr><tr><td>con puntas de plástico reemplazables</td><td>Fine Science Tools</td><td>11980-13</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs&nbsp;</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano USP</td><td>Fresenius Kabi&nbsp;</td><td>CP0406V2</td><td>Proporcionado al 5% para la inducción y al 2% para el mantenimiento a través del vaporizador de precisión&nbsp;</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico 70%</td><td>McKesson</td><td>350600</td><td></td></tr><tr><td>Lacri-Lube Ungüento ocular estéril&nbsp;</td><td>Actualizar&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Long Evans Rats</td><td>Charles River Laboratories</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>Pasta de soldadura a baja temperatura</td><td>Chip Quik Inc.</td><td>11.38</td><td></td></tr><tr><td>Imanes</td><td>Imanes Radiales, Inc.</td><td>0.53</td><td>Imán Neodimio Hierro Boro (NdFeB) N35 (3.00 mm x 1.00 mm)</td></tr><tr><td>Portaagujas Olsen-Hegar con cortadores de sutura&nbsp;</td><td>Herramientas de Bellas Ciencias</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>PDMS: SYLGARD&nbsp; 184</td> Hojas de bisturí <td>Sigma Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>- #15</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí - #3</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Chip de fundente de soldadura</td><td>Quik Inc.</td><td>14.25</td><td></td></tr><tr><td>Marco estereotáxico&nbsp;</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 900</td><td></td></tr><tr><td>Estéril Kwik-Sil Adhesivo</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL-S</td><td></td></tr><tr><td>Linterna UV</td><td>Vansky</td><td>19.99</td><td></td></tr><tr><td>Cargador inalámbrico</td><td>Nilkin</td><td>NKT06</td><td></td></tr><tr><td>Bobina de carga inalámbrica</td><td>TDK Corporation</td><td>WT202012-15F2-ID</td><td></td></tr></tbody></table>

implantación de dispositivos optoelectrónicos en la médula espinal de los roedores

Implantation of Optoelectronic Devices in the Rodent Spinal Cord

La neuromodulación puede proporcionar aplicaciones diagnósticas, moduladoras y terapéuticas. Si bien se ha realizado un extenso trabajo en el cerebro, la modulación de la médula espinal sigue siendo relativamente inexplorada. El tejido de la médula espinal, inherentemente delicado y móvil, impone limitaciones que dificultan la implantación precisa de las sondas neuronales. A pesar de los recientes avances en los dispositivos de neuromodulación, en particular la bioelectrónica flexible, las oportunidades para ampliar su uso en la médula espinal se han visto limitadas por las complejidades quirúrgicas de la implantación de dispositivos. Aquí, proporcionamos una serie de protocolos quirúrgicos diseñados específicamente para la implantación de un dispositivo optoelectrónico hecho a medida que interactúa con la médula espinal en roedores. Aquí se detallan los pasos para colocar y anclar un vástago óptico en un segmento específico de la médula espinal a través de dos métodos diferentes de implantación quirúrgica. Estos métodos están optimizados para una amplia gama de dispositivos y aplicaciones, que pueden o no requerir contacto directo con la médula espinal para la estimulación óptica. Para dilucidar la metodología, primero se hace referencia a la anatomía vertebral para identificar puntos de referencia prominentes antes de hacer una incisión en la piel. Se muestran los pasos quirúrgicos para asegurar un vástago óptico sobre la columna cervical en roedores. A continuación, se describen los procedimientos para asegurar el dispositivo optoelectrónico conectado al vástago óptico en un espacio subcutáneo alejado de la médula espinal, minimizando el contacto directo innecesario. Los estudios de comportamiento que comparan los animales que recibieron los implantes con los que se sometieron a cirugías simuladas indican que los vástagos ópticos no afectaron negativamente la función de las extremidades posteriores o anteriores siete días después de la implantación. El presente trabajo amplía el conjunto de herramientas de neuromodulación para su uso en futuros estudios destinados a investigar diversas intervenciones de la médula espinal.

Un dispositivo optoelectrónico con su diagrama funcional detallado que se muestra en la Figura Suplementaria 2 se implantó en cuatro ratas Long Evans. La Figura complementaria 3 muestra el dispositivo optoelectrónico final listo para implantar. Otros tres animales recibieron cirugías simuladas, que implicaron una laminectomía medial en C5 sin implante de dispositivo. El dispositivo optoelectrónico consistía en una sonda flexible con un μLED integrado en la punta que se activaba mediante un controlador LED integrado. El controlador LED está controlado por un microcontrolador con firmware programable. También consistía en un cuerpo de dispositivo que se suturaba a la capa muscular inmediatamente debajo de la piel. Una capa de parileno-C (~10 μm) se deposita en todo el dispositivo mediante deposición química de vapor (CVD). Una segunda capa de polidimetilsiloxano (PDMS) (~800 μm) cubrió el cuerpo del dispositivo optoelectrónico (Figura complementaria 3) para formar una interfaz blanda con el tejido. La punta de la sonda se aseguró en C4 con el μLED flotando sobre C5. Se utilizó un indicador μLED en el dispositivo (con su luz visible desde debajo de la piel) que se encendió simultáneamente con el μLED del vástago óptico para la verificación en vivo de la funcionalidad del dispositivo. Los animales fueron monitoreados durante un período de 7 días después de la cirugía para confirmar la confiabilidad sostenida de su rendimiento a lo largo del tiempo (Figura 4B).
Las funciones motoras de los animales se evaluaron utilizando la escala de calificación locomotora de campo abierto de Martínez19. Para evaluar el comportamiento en campo abierto, dos observadores entrenados que desconocían los grupos de tratamiento realizaron las pruebas antes de las operaciones, así como en los días tres, cinco y siete después de la cirugía. Después de la recopilación de datos, se llevó a cabo la prueba U de Mann-Whitney para determinar las diferencias en cada punto de tiempo para las puntuaciones de las extremidades anteriores y posteriores entre los grupos de implantes y simulados. Nuestro análisis indica una puntuación similar de la función de las extremidades anteriores en los grupos de implantes y simulados al séptimo día (Figura 5A). Del mismo modo, no hubo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos para las puntuaciones de las extremidades posteriores en todos los puntos temporales (Figura 5B).
La verificación post-mortem se realizó 7 días después de la implantación para confirmar si la sonda y el cuerpo del dispositivo habían permanecido en su lugar. No se encontró ningún desprendimiento visible de la sutura o del dispositivo. Además, tirar del cuerpo del dispositivo no provocó su desprendimiento del tejido (Figura complementaria 4A). A continuación, los músculos previamente diseccionados y suturados se expusieron sobre la médula espinal, y se confirmó que las sondas permanecían firmemente cementadas sobre la médula espinal (Figura suplementaria 4B). Al igual que en el cuerpo del dispositivo, el cabezal de la sonda se retiró sucesivamente contra el punto de cementación para evaluar su unión mecánica a la unión mecánica entre la sonda y la lámina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig01.jpg"> Figura 1: Vista general esquemática de la implantación del dispositivo y los puntos de referencia anatómicos. (A) Demostración de la colocación de la sonda sobre la médula espinal y la colocación subcutánea del dispositivo. (B) Modelo 3D que indica los puntos de referencia utilizados para determinar los niveles de la médula espinal. Las apófisis espinosas C2, T2 y T10 se muestran como referencia. Los colores más oscuros indican el nivel correspondiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig02.jpg"> Figura 2: Exposición de la médula espinal y preparación de una bolsa subcutánea. (A) El estereotáxico se coloca en el animal. (B) La apófisis espinosa C2 y (C) la apófisis espinosa T2 se identifican a través de la palpación. (D) Se realiza una incisión a través de la piel y la capa adiposa subcutánea para exponer la musculatura dorsal en el punto de interés a nivel cervical. (E) A través de la disección roma de la musculatura dorsal, las vértebras cervicales quedan expuestas. (F) Se crea una bolsa subcutánea para asegurar el dispositivo implantable caudal al sitio de la incisión. (G) Se coloca un retractor después de una disección adecuada para exponer las vértebras cervicales y el músculo en forma de bola, cubriendo completamente C2 y enmascarando parcialmente C3. La línea discontinua indica el músculo en forma de bola. Una vez que la médula espinal cervical ha sido expuesta, (H) se realizan dos laminectomías laterales en C5 y C6 para la colocación de la sonda debajo de las vértebras, o (I) se realiza una laminectomía medial en C5 para la colocación de la sonda sobre las vértebras. Los asteriscos indican el sitio de la laminectomía lateral. Barras de escala = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig03.jpg"> Figura 3: Implantación del dispositivo y colocación de la sonda. (A) El dispositivo se coloca en el bolsillo subcutáneo. (B) El dispositivo se sutura a la musculatura. (C) La sonda se asegura en la parte superior de la lámina C5, que había sido sometida a una laminectomía medial. (D) El dispositivo se coloca debajo de la lámina C5 y C6, ambas recibieron laminectomía lateral. Tanto en (C) como en (D), la punta de la sonda está cementada en un C4 intacto. Barras de escala = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig04.jpg"> Figura 4: Dispositivo de marcado y verificación de la funcionalidad después de la cirugía. (A) La ubicación del dispositivo puede marcarse opcionalmente sobre la piel después de la sutura para facilitar su identificación después de la cirugía. (B) La figura representa a un animal después de la implantación. La funcionalidad del dispositivo se validó observando el indicador μLED visible debajo de la piel, lo que confirma el funcionamiento exitoso del dispositivo (la protuberancia en el lado derecho del animal es donde se implanta el cuerpo del dispositivo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66992/66992fig05.jpg"> Figura 5: Puntuaciones conductuales de campo abierto de Martínez en grupos simulados e implantes para el rendimiento de las extremidades anteriores y posteriores a lo largo del tiempo. Los gráficos ilustran las puntuaciones medias del comportamiento para las evaluaciones de campo abierto de las extremidades anteriores (A) y (B) las traseras en cuatro puntos temporales: 0 (línea de base), 3 días, 5 días y 7 días después de la implantación (DPI). Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM). Las diferencias significativas (p &lt; 0,05) entre los grupos simulado y de implantes se indican con asteriscos (*) en puntos temporales específicos. La leyenda de la figura indica los grupos simulados mostrados por la línea punteada, mientras que el grupo de implantes se muestra por la línea continua. El tamaño de la muestra simulada fue n = 3 y el implante fue n = 4. Se utilizó la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney para evaluar la significancia de las diferencias entre los grupos en cada punto temporal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/66992fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Ilustración de la laminectomía. Las líneas discontinuas indican las regiones que se deben resecar para (A) dos laminectomías laterales para la colocación de la sonda debajo de las vértebras, y (B) laminectomía medial para la colocación de la sonda sobre las vértebras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Esquema del dispositivo optoelectrónico. Se muestra el diagrama de bloques detallado del dispositivo. El bloque superior izquierdo representa un tanque LC resonante de antena receptora de energía inalámbrica. La potencia recibida se rectifica y se alimenta a un regulador de voltaje de baja caída (LDO). Una unidad de microcontrolador activa automáticamente el dispositivo en función de los parámetros programados, y un controlador LED alimenta cualquier μLED integrado en la sonda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 3: Dispositivo optoelectrónico. El dispositivo optoelectrónico final con encapsulación biocompatible conectado a un vástago óptico compuesto por 1 μLED en la punta. El rectángulo discontinuo representa la ubicación del μLED. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 4: Verificación post mortem de la estabilidad del dispositivo. Siete días después de la implantación, (A) el cuerpo del dispositivo había permanecido suturado a la musculatura en la misma posición en la que se implantó, y (B) la sonda cementada permanecía asegurada en la parte superior de la lámina C4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66992/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo detalla un procedimiento quirúrgico para realizar una cirugía de la médula espinal y para implantar y asegurar un vástago óptico sobre la médula espinal en roedores.

Implantación de dispositivos optoelectrónicos en la médula espinal de los roedores

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