Imágenes moleculares de organoides cerebrales humanos mediante espectrometría de masas

Estudiamos la metabolómica del cerebro humano en desarrollo. Un reto para investigar in vivo. Para abordar esto, utilizamos modelos de organoides cerebrales in vitro y técnicas metabolómicas especiales avanzadas.

En los últimos años, las tecnologías avanzadas basadas en la tecnología maestra se han aplicado rápidamente para la caracterización de organoides, una tendencia que se espera que continúe. Estudios metabolómicos recientes que utilizan imágenes de espectrometría de masas o MSI demuestran las ventajas de los modelos de organoides en la comprensión de los mecanismos moleculares del desarrollo y la enfermedad humanos, incluidas las afecciones raras, y las aplicaciones en medicina personalizada. Mantener la integridad molecular y la morfología de los organoides durante la obtención de imágenes moleculares es un desafío, ya que requiere un manejo y preparación precisos de las muestras. Para abordar esto, se ha desarrollado una técnica especializada para el análisis multi MALDI MSI de alta resolución de organoides cerebrales. Optimiza el espectro de masas entre las condiciones de imagen, la matriculación y la preservación de tejidos para garantizar datos confiables de alta calidad. Este protocolo integral demuestra el potencial de MSI de alta resolución y brinda a los investigadores los recursos que necesitan para utilizar completamente esta tecnología para investigar la topografía metabolómica de los organoides en detalle.

Nuestra investigación anunciará nuestra comprensión de la neurogénesis, metabolito asociado con tipos específicos de células en organoides cerebrales. Este perfil metabólico detallado no solo iluminará la regla de estos metabolitos en el desarrollo del cerebro, sino que también identificará un objetivo potencial para que las intervenciones terapéuticas imiten los trastornos del neurodesarrollo.

[Narrador] Para comenzar, retire el matraz que contiene los organoides cerebrales derivados de las células madre pluripotentes inducidas de la incubadora. Con puntas de gran diámetro, transfiera los organoides del matraz al plato. Lave los organoides tres veces con DPBS sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio para enjuagar el medio. Luego enjuague rápidamente con agua destilada para eliminar las sales del DPBS. Agregue 10 miligramos de gelatina obtenida de la piel fría del pescado en un matraz que contenga 100 mililitros de DPBS. Caliente y revuelva la mezcla a 70 a 80 grados centígrados durante dos horas. Luego mueva la solución a una incubadora a 37 grados Celsius durante 30 minutos para eliminar las burbujas. Con una punta de pipeta pequeña, sujete el organoide en el centro de un molde de plástico. Vierta suavemente la solución de inclusión de gelatina al 10% en el molde hasta que el organoide esté completamente sumergido. Coloque el molde en una placa de Petri que contenga etanol frío al 100% sobre hielo seco. Cuando esté completamente congelado, evidenciado por el cambio de color a blanco sólido, retire el bloque de gelatina organoide de la placa de Petri. Envuelva el bloque en papel de aluminio o colóquelo en una taza de hojalata. Selle y almacene el bloque a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para la sección criogénica. Para el corte criogénico, coloque los bloques de plástico que contienen organoides dentro de la cámara criogénica a menos 20 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Luego, en el criotoma, secciona los organoides en secciones de 14 micrómetros y móntalos en portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de indio y estaño para imágenes de espectrometría de masas o MSI. Guarde los portaobjetos a menos 80 grados Celsius hasta obtener imágenes. Para comenzar, retire el portaobjetos recubierto de óxido de indio y estaño montado con secciones de organoides cerebrales a menos 80 grados Celsius. Coloque el portaobjetos en un desecado durante 20 minutos para minimizar la condensación de agua atmosférica en la superficie. Después de la desecación, con un pulverizador neumático calentado, rocíe 10 miligramos por mililitro de NEDC en metanol al 70% sobre las secciones de organoides. Para lograr una plataforma MALDI MSI de alta resolución para visualizar metabolitos organoides cerebrales, monte una fuente de iones con una interfaz de embudo de iones dual en un espectrómetro de masas. Utilice un láser ND de frecuencia triplicada de conmutación Q conectado con una longitud de onda de 349 nanómetros, una tasa de repetición de un kilohercio y una energía de pulso de aproximadamente 1,3 a 1,4 microjulios. Para evitar el sobremuestreo, enfoque el láser a un tamaño de punto de aproximadamente 15 micrómetros de diámetro. Conecte la muestra a la etapa del inyector MALDI . Opere y mantenga el embudo de iones de alta presión a 7.4 a 7.5 Torr, y el embudo de iones de baja presión a 1.6 a 1.8 Torr. Aplique voltajes de radiofrecuencia de 780 kilohercios a 191 voltios pico a pico a bajo, y 604 kilohercios a 80 voltios pico a pico a los embudos de iones de alta presión. Para mejorar la sensibilidad de los metabolitos pequeños en el rango de masa baja, reduzca las amplitudes de RF en el embudo de baja y alta presión de la fuente MALDIDMSI a aproximadamente 20 y 15% respectivamente. Establezca la resolución de masa en 70.000. Luego seleccione el área y el tamaño de píxel de 25 micrómetros por píxel. Establezca el rango de carga maestra entre 80 y 900 en los modos de iones negativos y positivos. Mantenga el control automático de ganancia desactivado, luego configure el tiempo de inyección en 250 milisegundos y adquiera espectros de masas de transformación furier en el modo de perfil. Importe los datos espectrales de espectrometría de masas directamente al software compatible. Realice la corrección de línea base mediante el algoritmo de convolución y normalice los datos mediante el recuento total de iones. Genere la lista de características de las imágenes de iones a partir de los archivos de datos sin procesar utilizando un ancho de contenedor de carga maestra delta igual a 0,01 o 5:00 PPM para distinguir las imágenes de relación de carga maestra en función del defecto de masa y la cobertura de píxeles. Genere imágenes de color falso o RGB a partir de especies individuales de iones metabolitos. Cargue la lista de relación de carga maestra de los archivos de datos sin procesar obtenidos de MALDI MSI a la base de datos de metabolomas humanos para identificar metabolitos. Los metabolitos relacionados con el ciclo de Krebs en organoides cerebrales humanos de 60 días se mapearon espacialmente utilizando MSI con incrustación de gelatina de pescado.