Name: Imágenes moleculares de organoides cerebrales humanos mediante espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a realizar imágenes moleculares de alta resolución en organoides cerebrales humanos mediante espectrometría de masas MALDI. Este protocolo optimizado permite mapear metabolitos del ciclo de Krebs y estudiar neurogénesis.

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<meta charset="utf8"></head><body> Mapeo avanzado MALDI-MSI de metabolitos en organoides cerebrales

<ol><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+Organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: Organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Sandoval, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+in+human+brain+organoid+research%3A+Where+we+are+and+where+we+need+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility in human brain organoid research: Where we are and where we need to go.</a> Stem Cell Rep. 19 (6), 796-816 (2024).</li>
<li>Dei-Ampeh, A. K., Shah, M., Cappuccio, G., Young, D. W., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+models+as+new+tools+for+drug+development+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Phenotyping+of+Human+iPSC-derived+Neurons%22%5BJournal%5D)">Human models as new tools for drug development and precision medicine.</a> Phenotyping of Human iPSC-derived Neurons. , 155-171 (2023).</li>
<li>Choi, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+mammalian+brain+reveals+regional+differences%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Sys+Bio%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of mammalian brain reveals regional differences.</a> BMC Sys Bio. 12 (S8), 127(2018).</li>
<li>Kandel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleic+acid+is+an+endogenous+ligand+of+TLX%2FNR2E1+that+triggers+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Oleic acid is an endogenous ligand of TLX/NR2E1 that triggers hippocampal neurogenesis.</a> PNAS. 119 (13), e2023784119(2022).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+platforms+and+techniques+to+study+stem+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical platforms and techniques to study stem cell metabolism.</a> Methods Mol Biol. 1842, 265-281 (2018).</li>
<li>Chen, K., Baluya, D., Tosun, M., Li, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry%3A+A+new+tool+to+assess+molecular+underpinnings+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry: A new tool to assess molecular underpinnings of neurodegeneration.</a> Metabolites. 9 (7), 135(2019).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+for+spatially+resolved+multi-omics+molecular+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Imaging%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging for spatially resolved multi-omics molecular mapping.</a> NPJ Imaging. 2 (1), (2024).</li>
<li>Spruill, M. L., Maletic-Savatic, M., Martin, H., Li, F., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+analysis+of+drug+absorption%2C+distribution%2C+metabolism%2C+and+toxicology+using+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Spatial analysis of drug absorption, distribution, metabolism, and toxicology using mass spectrometry imaging.</a> Biochem Pharmacol. 201, 115080(2022).</li>
<li>Sekera, E. R., Akkaya-Colak, K. B., Lopez, A., Mihaylova, M. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+histology+for+the+analysis+of+budding+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and histology for the analysis of budding intestinal organoids.</a> Anal Chem. 96 (10), 4251-4258 (2024).</li>
<li>Wang, Y., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS+imaging+of+multicellular+tumor+spheroids+and+organoids+as+an+emerging+tool+for+personalized+medicine+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">MS imaging of multicellular tumor spheroids and organoids as an emerging tool for personalized medicine and drug discovery.</a> J Biol Chem. 297 (4), 101139(2021).</li>
<li>Bakker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+ductal+epithelial+organoids+for+high-spatial-resolution+molecular+profiling+using+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparing ductal epithelial organoids for high-spatial-resolution molecular profiling using mass spectrometry imaging.</a> Nat Protoc. 17 (4), 962-979 (2022).</li>
<li>Cappuccio, G., Khalil, S. M., Osenberg, S., Li, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+as+an+emerging+tool+for+studying+metabolism+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Molecular+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging as an emerging tool for studying metabolism in human brain organoids.</a> Front Molecular Biosci. 10, 1181965(2023).</li>
<li>Khalil, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+Imaging+mass+spectrometry+visualizes+the+distribution+of+antidepressant+duloxetine+and+its+major+metabolites+in+mouse+brain%2C+liver%2C+kidney%2C+and+spleen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">MALDI Imaging mass spectrometry visualizes the distribution of antidepressant duloxetine and its major metabolites in mouse brain, liver, kidney, and spleen tissues.</a> Drug Metab Dispos. 52 (7), 673(2024).</li>
<li>Swales, J. G., Hamm, G., Clench, M. R., Goodwin, R. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+its+application+in+pharmaceutical+research+and+development%3A+A+concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and its application in pharmaceutical research and development: A concise review.</a> Int J Mass Spectrom. 437, 99-112 (2019).</li>
<li>Müller, W. H., Verdin, A., De Pauw, E., Malherbe, C., Eppe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+imaging%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging: A review.</a> Mass Spectrom Rev. 41 (3), 373-420 (2022).</li>
<li>Langridge, J. I., Claude, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+and+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+coupled+to+ion+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption and desorption electrospray ionization mass spectrometry coupled to ion mobility.</a> Methods Mol Biol. 2084, 245-265 (2020).</li>
<li>Khalil, S. M., Römpp, A., Pretzel, J., Becker, K., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+topography+of+whole-body+sections+of+the+Anopheles+stephensi+mosquito%2C+characterized+by+high-resolution+atmospheric-pressure+scanning+microprobe+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid topography of whole-body sections of the Anopheles stephensi mosquito, characterized by high-resolution atmospheric-pressure scanning microprobe matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging.</a> Anal Chem. 87 (22), 11309-11316 (2015).</li>
<li>Khalil, S. M., Sprenger, R. R., Hermansson, M., Ejsing, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDA-imaging+with+structural+identification+of+lipid+molecules+on+an+Orbitrap+Velos+Pro+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">DDA-imaging with structural identification of lipid molecules on an Orbitrap Velos Pro mass spectrometer.</a> J Mass Spectrom. 57 (9), e4882(2022).</li>
<li>Bender, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+method+for+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+fresh-frozen+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Sample preparation method for MALDI mass spectrometry imaging of fresh-frozen spines.</a> Anal Chem. 95 (47), 17337-17346 (2023).</li>
<li>Paşca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids%3A+Advances%2C+applications+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), dev166074(2019).</li>
<li>Ferguson, C. N., Fowler, J. W. M., Waxer, J. F., Gatti, R. A., Loo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+tissue+imaging+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mass+Spectrom+Biomed+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based tissue imaging of small molecules.</a> Adv Mass Spectrom Biomed Res. 806, 283-299 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+imaging+of+metabolites+with+a+N+-%281-Naphthyl%29+Ethylenediamine+Dihydrochloride+matrix+and+its+application+to+colorectal+cancer+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS imaging of metabolites with a N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride matrix and its application to colorectal cancer liver metastasis.</a> Anal Chem. 87 (1), 422-430 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>(1S, 2S)-1,2-di-1-diclorhidrato de naftil-etilendiamina</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)</td><td>1052707-27-3</td><td>Sustancia de matriz para MALDI-MS, &ge; 99,0% (HPLC)</td></tr><tr><td>1&veces; Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato (DPBS)</td><td>Life Technologies, USA</td><td>14190-144</td><td>Sin CaCl2 y MgCl2</td></tr><tr><td>ART Puntas de pipeta filtradas de gran diámetro</td><td>Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA</td><td>2069G</td><td>Reduce la contaminación potencial</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Tissue-Tek</td><td>25608-916</td><td>Molde estándar con superficie plana&nbsp;</td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>M1079610500 Cubreobjetos</td></tr><tr><td>Eosina Y</td><td>Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)</td><td>E511-25</td><td>Tinción biológica certificada</td></tr><tr><td>Gelatina de pescado</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)</td><td>G7041</td><td>Forma de polvo a partir de piel de pescado de agua fría</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)</td><td>517-28-2</td><td>Tinción biológica certificada Presión elevada fuente de imágenes con</td></tr><tr><td>pulverizador HTX M5+</td><td>HTX Technologies LLC, Carrboro, EE. UU.</td><td></td><td>Pulverizador de matriz</td></tr><tr><td>de indio estaño</td><td>Hudson Surface Technology,</td> <td>PL-IF-000010-P25</td><td>Proporciona una superficie conductora para la obtención de imágenes MALDI</td></tr><tr><td>Fuente de iones MALDI</td><td>Spectroglyph LLC, EE. UU.</td><td></td><td>interfaz de embudo de iones duales</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)</td><td>67-56-1</td><td>HPLC óxido de grado</td></tr><tr><td>(ITO) conductor&ndash; diapositivas recubiertas&nbsp; &nbsp;</td><td>Nueva York, Estados</td><td></td><td></td>Unidos</tr><tr><td>Gelatina porcina</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)</td><td>G1890</td><td>Forma de polvo de piel porcina</td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas Q-Exactive</td><td>Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.</td><td></td><td>Espectrometría de masas de alta resolución</td></tr><tr><td>Software SCiLS Lab</td><td>&nbsp; versión 2024a Pro</td><td></td><td>para procesar los datos&nbsp;</td></tr><tr><td>Water</td><td>Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA)</td><td>Grado</td><td></td></tr> HPLC W6500(<tr><td>Waltham, MA, EUA)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes moleculares de organoides cerebrales humanos mediante espectrometría de masas 

Molecular Imaging of Human Brain Organoids Using Mass Spectrometry

A continuación, se muestra un protocolo que optimiza las imágenes moleculares (metabólicas) utilizando MSI (Figura 1, consulte también Cappuccio et al.)15. Los datos más fiables y la preservación de la morfología de los tejidos se lograron con gelatina al 10% de piel de pescado fría, confirmada por la tinción histológica de secciones seriadas. Utilizando gelatina de pescado incorporada a organoides cerebrales humanos de 60 días, los metabolitos relacionados con el ciclo de Krebs se mapearon utilizando MSI, demostrando su distribución espacial (Figura 2).
En general, el protocolo optimizado proporcionó resultados sólidos de manera consistente, con un 10% de gelatina de piel de pescado fría como material de inclusión preferido y configuraciones de pulverización de matriz NEDC ajustadas para mejorar la resolución de la imagen. Los pequeños metabolitos detectados en los organoides cerebrales proporcionan información valiosa sobre las complejidades moleculares de este tejido.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66997/66997fig01.jpg"> 
Figura 1: Línea general de estudio del metaboloma de organoides del cerebro humano. Los organoides derivados de los fibroblastos individuales a través de células madre pluripotentes inducidas se utilizan para LC-MS y MSI para resaltar la distribución espacial de los metabolitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66997/66997fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66997/66997fig02.jpg"> 
Figura 2: Mapeo de metabolitos relacionados con el ciclo de Krebs. Identificación y distribución de metabolitos relacionados con el ciclo de Krebs utilizando organoides de 60 días derivados de controles sanos utilizando MSI. Se muestra la tinción de hematoxilina y eosina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66997/66997fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Imágenes moleculares de organoides cerebrales humanos mediante espectrometría de masas 

Brain organoid models serve as a powerful tool for studying human brain development and function. Mass spectrometry imaging (MSI), a cutting-edge ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este estudio introduce y describe protocolos para derivar dos organoides neuronales humanos específicos como un modelo relevante y preciso para el estudio de 1) desarrollo de glioblastoma humano dentro de organoides neuronales humanos exclusivamente en humanos y 2) neurona dopaminérgica diferenciación que genera un organoide tridimensional.

Organoides neuronales humanos para el estudio del cáncer cerebral y las enfermedades neurodegenerativas

Este protocolo se generó como un medio para producir organoides cerebrales de una manera simplificada y de bajo costo sin factores de crecimiento exógenos o matriz de membrana de sótano sin dejar de mantener la diversidad de tipos de células cerebrales y muchas características de la organización celular.

Un método autodirigido estático para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación de la muestra al planificar experimentos con MALDI MSI para maximizar la detección metabólica y molecular en muestras biológicas.

Preparación de muestras para perfiles metabólicos utilizando imágenes de espectrometría de masas MALDI

Describimos un protocolo detallado para la generación de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos y su uso en el modelado de enfermedades mitocondriales.

Generación de organoides cerebrales humanos para el modelado de enfermedades mitocondriales

Este protocolo describe un método semiautomatizado para exámenes de detección de fármacos con organoides de rendimiento medio a alto y software de análisis de imágenes automatizado e independiente del microscopio para cuantificar y visualizar las respuestas multiparamétricas a fármacos de un solo organoide para capturar la heterogeneidad intratumoral.

Detección multiparamétrica de fármacos organoides tumorales mediante imágenes de células vivas de campo amplio para análisis a granel y de un solo organoide

Aquí, presentamos un protocolo integral para la generación y el análisis posterior de organoides cerebrales humanos utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula y un solo núcleo.

Generación y análisis posterior de transcriptomas de una sola célula y de un solo núcleo en organoides cerebrales

Presentamos un protocolo para generar un organoide cerebral humano con microglía residente mediante la incorporación de células progenitoras hematopoyéticas (HPC) derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en el desarrollo de organoides.

Derivación de un organoide cerebral humano con desarrollo de microglía

Presentamos un protocolo paso a paso para imágenes tridimensionales, sin etiquetas y de alta resolución de organoides mediante holotomografía de baja coherencia. Este protocolo detalla la preparación del cultivo de organoides, la adquisición de imágenes y el análisis computacional de imágenes, lo que permite la visualización en tiempo real de la dinámica estructural y las respuestas a los fármacos en organoides vivos.

Imágenes 3D de alta resolución y análisis de aprendizaje automático sin etiquetas de organoides intestinales mediante holotomografía de baja coherencia

Este protocolo detalla los pasos clave para permitir una medición rigurosa y reproducible tanto del glucógeno como de los glicanos N-linked mediante imagen por espectrometría de masas.

Imagen Molecular Espacial del Glycome mediante espectrometría de masas

Aquí se describe un método rápido y sencillo a las células de la imagen marcados con fluorescencia en rodajas de cerebro semi-espesa. Mediante la fijación, corte, limpieza y ópticamente el tejido cerebral se describe la forma de imagen estándar de epifluorescencia y confocal se puede utilizar para visualizar las células individuales y las redes neuronales en el tejido nervioso intacto.

Un enfoque rápido para imágenes de fluorescencia de alta resolución en rodajas de cerebro semi-gruesa

Aprenda a realizar imágenes moleculares de alta resolución en organoides cerebrales humanos mediante espectrometría de masas MALDI. Este protocolo optimizado permite mapear metabolitos del ciclo de Krebs y estudiar neurogénesis.

Imágenes moleculares de organoides cerebrales humanos mediante espectrometría de masas

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