Ensamblaje de organoides de la retina con microglía
July 26th, 2024
La microglía es una célula inmunitaria residente única en la retina que desempeña un papel crucial en diversas enfermedades degenerativas de la retina. La generación de un modelo de cocultivo de organoides retinianos con microglía puede facilitar una mejor comprensión de la patogénesis y el progreso del desarrollo de las enfermedades de la retina.
Para comenzar, obtenga las células madre embrionarias humanas en el medio de células madre con una densidad celular del 80 al 90%Después de eliminar el medio gastado, enjuague las células en cada pocillo con un mililitro de 1X DPBS. Incubar las colonias de células madre en cada pocillo con un mililitro de EDTA 0,5 milimolar durante aproximadamente cinco minutos a 37 grados centígrados. Revise la morfología de la colonia para confirmar que los bordes estén ligeramente enroscados con espacios sueltos.
Aspire el EDTA y, si es necesario, incube las células a 37 grados centígrados durante uno o dos minutos más, pero sin exceder los ocho minutos. Enjuague suavemente las células de cada pocillo con seis mililitros de medio A que contenga seis microlitros de solución de 10 milimolares de inhibidor de ROCK Y-27632. Golpea suavemente el fondo del plato para ayudar a enjuagar las células.
Después de 24 horas, observe las células bajo el microscopio para confirmar la formación del cuerpo embrionario. Con una pipeta de 10 mililitros, recoja los cuerpos embrionarios en un tubo centrífugo de 15 mililitros y espere a que los cuerpos embrionarios se asienten en el fondo durante cinco minutos. A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender los cuerpos embrionarios en seis mililitros de medio fresco A. Transfiéralos a un nuevo pocillo de baja adherencia de una placa de seis pocillos y cultive en una incubadora a 37 grados centígrados.
Al cuarto día, cubra un plato de 10 centímetros con tres mililitros de solución de gelatina de pescado al 0,1% e incube durante al menos una hora en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Luego retire la solución de gelatina y enjuague el plato una vez con cinco a seis mililitros de 1X DPBS. Recoja cuidadosamente los cuerpos embrionarios en un tubo centrífugo de 15 mililitros y espere a que los cuerpos embrionarios se asienten en el fondo en cinco minutos.
Vuelva a suspender suavemente los cuerpos embrionarios con 15 mililitros de B medio y transfiéralos al plato de 10 centímetros recubierto. Cultivo en una incubadora de 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono durante una semana después de 49 días. Centrifugar las células a 200 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender las células con dos mililitros de medio fresco C. Transfiera a un nuevo pocillo de baja adherencia de una placa de seis pocillos. Incube la placa en una incubadora de 5% de dióxido de carbono, a 37 grados centígrados. En el día 56, reemplace el medio gastado con dos mililitros de medio C por pocillo.
Examine la placa bajo un microscopio para identificar la microglía ramificada que se adhiere al fondo del pozo de baja adherencia. Para cosechar microglía para el cocultivo, reemplace suavemente el medio C en cada pocillo con un mililitro de Accutase e incube a 37 grados Celsius durante tres minutos. Con una pipeta de cinco mililitros, recoja las células de la microglía en un tubo de 15 mililitros y centrifugue las células a 200 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de desechar el sobrenadante, suspenda la microglía con un mililitro de E medio.
Visión general
Este estudio investiga el papel de la microglía en las enfermedades degenerativas de la retina mediante la generación de un modelo de co-cultivo de organoides retinales y microglía. Este modelo tiene como objetivo mejorar la comprensión de la patogénesis y el desarrollo de las enfermedades de la retina.
Componentes clave del estudio
Área de ciencia
- Neurociencia
- Biología de la retina
- Inmunología
Antecedentes
- La microglía son células inmunes residentes en la retina.
- Juegan roles cruciales en la patología de las enfermedades degenerativas de la retina.
- Entender las funciones de la microglía puede ayudar en el desarrollo de terapias.
- Los modelos de co-cultivo permiten un análisis más completo de las interacciones celulares.
Propósito del estudio
- Desarrollar un modelo de co-cultivo confiable de organoides retinales y microglía.
- Investigar los mecanismos patógenos subyacentes a las enfermedades de la retina.
- Mejorar la comprensión del comportamiento de la microglía en el ambiente retinal.
Métodos utilizados
- El estudio utilizó un modelo de co-cultivo que involucra organoides retinales y microglía humana derivada de células madre embrionarias.
- Las células madre embrionarias humanas se cultivaron hasta alcanzar una densidad específica, seguida de la isolation de la microglía.
- El modelo observó las etapas de desarrollo durante un período de 30 días.
- Las condiciones de cultivo incluyeron incubaciones a 37 grados Celsius con gases controlados.
- Se utilizaron técnicas de inmunofluorescencia para confirmar la presencia de microglía y marcadores retinales.
Resultados principales
- Los organoides retinales co-cultivados mostraron una autofluorescencia GFP significativa que indica microglía activa.
- La inmunofluorescencia confirmó la expresión de marcadores de fotorreceptores retinales (CRX) y marcadores de microglía (IBA1).
- El estudio destaca la interacción entre la microglía y las células de la retina durante la modelización de la enfermedad.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un modelo de co-cultivo funcional que refleja la complejidad de las enfermedades de la retina.
- Permite obtener información sobre los roles de la microglía en la patogénesis de la retina, potencialmente guiando estrategias terapéuticas.
- Las implicaciones del modelo se extienden a una mejor comprensión de los mecanismos de interacción neuroinmune en las enfermedades oculares.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Integrating microglia into human retinal organoids addresses a critical gap in disease-relevant modeling for retinal and CNS drug discovery. This co-culture system enhances predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for neuroimmune interactions. The platform supports translational continuity from discovery through preclinical research, enabling more informed portfolio decisions in ophthalmic and neurodegenerative pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microglia-mediated mechanisms in retinal disease models.
- Supports functional target validation by recapitulating immune cell interactions.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroimmune targets in ophthalmology.
- Improves predictive confidence for early-stage asset triage.
Screening & Assay Development
- Provides a validated co-culture system for compound screening in a human-relevant context.
- Enables quantitative assessment of microglial and photoreceptor marker expression.
- Supports reproducible assay development for immune-modulating therapeutics.
- Prepares a scalable platform for screening neuroinflammatory modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems for translational biomarker exploration.
- Bridges discovery and preclinical validation for retinal and CNS indications.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on human cell-derived data.
- Supports mechanistic studies of neuroimmune interactions in disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
This co-culture model fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational research for retinal and CNS drug programs.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of microglia-retina interactions and pathway clarification.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible organoid systems with quantifiable immune and neuronal markers.
- Analytics: Provides immunofluorescence and autofluorescence readouts for comparative analysis of disease and intervention effects.
- Translational Research: Supports alignment with human disease mechanisms and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse neuroimmune and ophthalmic research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Standardizes co-culture protocols for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by modeling human disease complexity early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of assets targeting retinal and CNS diseases.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell differentiation and co-culture techniques.
- Needs access to advanced imaging and immunofluorescence analytics.
- Demands cross-team standardization for reproducible outputs.
- May require adaptation for different disease models or cell sources.
- Potential variability in cellular responses should be considered in experimental design.
