Combinación de imágenes y electrofisiología para visualizar y registrar las despolarizaciones que se propagan en ratones
4 de octubre de 2024
Este protocolo demuestra la combinación de imágenes y electrofisiología para detectar de forma fiable las despolarizaciones que se extienden en ratones adultos después de una lesión cerebral traumática leve.
El alcance de nuestra investigación es comprender la relación entre las despolarizaciones que se propagan y las lesiones cerebrales traumáticas leves utilizando modelos cerebrales. Nuestro grupo y otros han demostrado recientemente que las despolarizaciones que se propagan ocurren en lesiones leves de cráneo cerrado en ratones. Los amplificadores de electrofisiología in vivo comúnmente utilizados filtrarán los cambios extracelulares lentos asociados con las despolarizaciones en expansión, lo que hace casi imposible detectar la despolarización en expansión.
La ventaja de este protocolo es aprovechar tanto la imagen como la electrofisiología in vivo para confirmar la ausencia o presencia de despolarizaciones dispersas después de una lesión cerebral traumática leve. Hemos comenzado a comprender el papel de las despolarizaciones generalizadas en el comportamiento agudo, la patología y los déficits cognitivos a largo plazo asociados con los MTBI. Para comenzar, coloque al animal anestesiado en un marco estereotáxico y mantenga la temperatura corporal del animal con una almohadilla térmica.
Con una hoja de bisturí número 10, haga una incisión a lo largo de la línea media desde la rostral hasta la caudal. E inmediatamente aplique pegamento de cianoacrilato a la incisión. Luego, extiende la piel lateralmente para exponer el cráneo.
Agregue una o dos gotas adicionales de pegamento de cianoacrilato sobre el cráneo para brindar protección adicional. Mientras se seca el pegamento, use tijeras quirúrgicas estériles para aumentar el tamaño de la incisión sobre el cerebelo. A continuación, con una broca de 0,8 milímetros, perfore agujeros piloto a través del cráneo y gire los tornillos en el cráneo.
Enrolle el exceso de alambre alrededor del tornillo, dejando algo de holgura para la colocación de la etapa de la cabeza más tarde. Una vez que todos los tornillos de calavera estén en su lugar, conecte todos los pines dorados en el conector de etapa de cabeza deseado. Sosteniendo el conector en su lugar con el brazo estereotáxico, coloque las clavijas del conector cerca de las cabezas de los tornillos sin contacto con el cable.
Selle toda el área con pegamento de cianoacrilato, asegurándose de que el área de imagen frente a los tornillos del cráneo no se altere. Acumula cemento dental alrededor de la base de los alfileres de oro, asegurándote de que los alfileres de oro de los tornillos del cráneo no estén conectados a los de la etapa de la cabeza. Deje que el cemento dental se cure antes de quitar el conector de la etapa principal.
Para comenzar, encienda la computadora IOS y la placa del panel LED. Monte el animal anestesiado implantado con electrodos en un lecho de impacto debajo de la cámara. Y ajuste el anillo de enfoque para cubrir la superficie cortical.
Después de cargar la señal óptica intrínseca o la configuración de IOS, presione el botón Live para ver el mouse y centrar el cráneo del animal debajo de la cámara. A continuación, pulse Adquisición Multi-D para acceder a la configuración de adquisición y seleccionar los puntos de tiempo deseados. Guarde las imágenes en la ruta de archivo designada con el prefijo de nombre adecuado.
Conecte los pines dorados del animal al conector de la etapa principal y luego a la etapa principal. Encienda la computadora de electrofisiología y conecte la computadora al equipo de electrofisiología. Después de cargar la configuración del software Intan, haga clic en el icono Elegir formato de archivo y, en la ventana emergente, seleccione Un archivo por formato de tipo de señal.
A continuación, en la pestaña BW en Ancho de banda de hardware, seleccione el ancho de banda del amplificador de 0,13 a 500 hercios. Seleccione Ancho en Selector de pantalla de filtro. Después de configurar los filtros de paso bajo y alto, haga clic en el icono Seleccionar nombre de archivo para seleccionar la ruta de archivo deseada para guardar.
Para el impacto, encienda el impactador electromagnético y mueva la palanca para verificar si la punta se retrae y se extiende correctamente. Coloque rápidamente al animal en una cama de espuma y deslice la cama por debajo de la punta del impactador. Alinee la punta del impactador con la línea media y colóquela a un milímetro de bregma.
Luego, baje la punta del impactador hasta que toque firmemente la parte superior de la cabeza del animal. Empuje la palanca para retraer la punta del impactador, luego bájela manualmente cinco milímetros antes de activar la palanca de impacto. Retire inmediatamente al animal de la cama de espuma y colóquelo debajo de la cámara para obtener imágenes en cinco segundos.
Haga clic en Adquirir para iniciar la creación de imágenes de IOS en la ventana de adquisición multidimensional. Capture imágenes durante cuatro minutos para registrar todo el evento de despolarización en propagación. Para iniciar el registro de electrofisiología, haga clic en el icono Grabar en el software Intan.
Una vez finalizada la grabación, desconecte el animal de la etapa principal y del conector y vuelva a colocarlo en su jaula. Para abrir la pila de imágenes, haga clic en Archivo, seguido de Importar y Secuencia de imágenes. Dibuje un cuadrado con el cursor, definiendo la región de interés, para generar el gráfico de la despolarización en dispersión.
Vaya a Imagen, seguido de Pilas, y Trazar perfil del eje Z para trazar el gráfico y haga clic en el botón En vivo. En la gráfica generada, haga clic en Lista para generar una lista de valores. Para la visualización, convierta la imagen en escala de grises con una tabla de búsqueda de incendios.
Se observaron despolarizaciones que se propagaban a través de la corteza y grandes vasos sanguíneos a través de la ventana. La actividad de alta frecuencia en los registros de electrofisiología mostró un rápido retorno en los animales simulados después de la eliminación de isoflurano. Pero en los animales despolarizados, la actividad de alta frecuencia permaneció suprimida durante varios minutos antes de la recuperación.
Los diagramas de potencia demostraron un claro aumento de la potencia después de la recuperación de la supresión en ambas condiciones.
Descripción general
Este estudio investiga la conexión entre las despolarizaciones propagadas y los traumatismos craneoencefálicos leves utilizando ratones adultos como modelo. Al integrar técnicas de imagen con electrofisiología in vivo, el protocolo tiene como objetivo detectar de manera confiable las despolarizaciones propagadas, arrojando luz sobre su importancia en el comportamiento agudo y en los déficits cognitivos a largo plazo asociados con los traumatismos craneoencefálicos leves.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- Las despolarizaciones propagadas pueden ocurrir en lesiones leves del cráneo cerrado en ratones.
- Los métodos comunes de electrofisiología in vivo pueden no detectar los cambios extracelulares lentos asociados a estas despolarizaciones.
- Este estudio tiene como objetivo combinar imágenes y electrofisiología para mejorar la detección de las despolarizaciones propagadas.
- La investigación contribuye a comprender el comportamiento agudo, la patología y los resultados cognitivos tras una lesión cerebral traumática leve.
Objetivo del estudio
- Demostrar un protocolo que detecte de manera confiable las despolarizaciones propagadas en un modelo murino de lesión cerebral traumática leve.
- Investigar los posibles efectos de las despolarizaciones propagadas sobre el comportamiento y los déficits cognitivos.
- Mejorar los métodos de detección que actualmente están limitados por las prácticas electrofisiológicas comunes.
Métodos Utilizados
- El estudio emplea un protocolo que combina imágenes con electrofisiología en ratones adultos.
- Los ratones sufren una lesión cerebral traumática leve, tras la cual se realizan grabaciones de imágenes y electrofisiológicas para identificar despolarizaciones propagadas.
- Los pasos clave incluyen la anestesia del animal, la preparación quirúrgica y la integración cuidadosa del equipo de imágenes y electrofisiología.
- Los datos electrofisiológicos se registran tras la lesión y se correlacionan con los resultados de imágenes para analizar los eventos de despolarización.
Resultados principales
- Se observaron despolarizaciones propagadas a través de la corteza en respuesta a una lesión cerebral traumática leve.
- Los registros de electrofisiología indicaron una actividad de alta frecuencia suprimida en los animales despolarizados, destacando retrasos significativos en la recuperación.
- Las gráficas de potencia mostraron diferencias notorias en los patrones de recuperación entre animales control y lesionados.
- El enfoque combinado permitió una detección y análisis más efectivos de las despolarizaciones propagadas.
Conclusiones
- Este estudio demuestra con éxito un protocolo novedoso para detectar desolarizaciones propagadas tras una lesión.
- Los hallazgos mejoran la comprensión de los mecanismos neuronales asociados con deterioros cognitivos y cambios conductuales tras lesiones cerebrales traumáticas leves.
- El uso combinado de imágenes y electrofisiología proporciona información crítica sobre las implicaciones de las desolarizaciones propagadas en el contexto de lesiones cerebrales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección confiable de las despolarizaciones propagadas (SD) es fundamental para comprender las consecuencias neurológicas agudas y a largo plazo tras una lesión cerebral. La integración de imágenes con electrofisiología in vivo mejora la confianza predictiva en la identificación de SD, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas y la validación de objetivos en la investigación de neurotrauma. Este enfoque de doble modalidad fortalece el descubrimiento temprano y la continuidad traslacional para el avance de carteras en el sistema nervioso central (CNS).
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite una investigación rigurosa de las SD como contribuyentes mecánicos a la patología post-lesión.
- Apoya la validación funcional de dianas al confirmar la presencia o ausencia de SD en modelos relevantes para la enfermedad.
- Mejora la confianza predictiva para las pruebas de hipótesis terapéuticas posteriores.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Facilita la preparación de modelos in vivo validados para la selección de compuestos dirigidos a la modulación de la despolarización sostenida (SD).
- Proporciona imágenes cuantitativas y salidas electrofisiológicas para la estandarización de ensayos.
- Permite la detección reproducible de despolarizaciones sostenidas (SD), apoyando la evaluación confiable de intervenciones candidatas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea modelos preclínicos con mecanismos de lesión relevantes para humanos mediante la visualización de la propagación de las despolarizaciones (SD).
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al vincular las SD con resultados funcionales.
- Reduce los riesgos en la progresión traslacional al confirmar puntos finales mecanicistas in vivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo combinado de imagen y electrofisiología sitúa la detección de la depresión esparcida en la intersección entre el descubrimiento temprano, la identificación de compuestos activos y la investigación preclínica en modelos de lesión del sistema nervioso central.
- Biología del Descubrimiento: Confirma hipótesis mecanicistas sobre la participación de la despolarización de propagación (SD) en lesiones cerebrales agudas y crónicas.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles para evaluar compuestos que modulan la despolarización de propagación.
- Análisis: Ofrece datos sincronizados de imágenes y datos electrofisiológicos para comparaciones estadísticas rigurosas entre condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con puntos finales preclínicos relevantes para el desarrollo de fármacos del sistema nervioso central.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo ampliamente adoptable, adaptable a diversos modelos de neurotrauma y neurovasculares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de lesiones del SNC.
- Valor operativo: Estandariza la detección de SD con flujos de trabajo escalables y reproducibles, adecuados para estudios multisitio.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o no continuar al aclarar la participación de SD en la patología objetivo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de activos del SNC basada en puntos finales mecanicistas validados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia tanto en técnicas de imagen in vivo como en electrofisiología.
- Exige acceso a infraestructura sincronizada para imagen y grabación electrofisiológica.
- Necesita la estandarización cruzada entre equipos de los protocolos de adquisición y análisis de datos.
- Adaptable a diversos modelos de roedores, aunque puede requerir optimización del protocolo para diferentes tipos de lesión.
- Depende de la disponibilidad de amplificadores e sistemas de imagen compatibles para la detección confiable de depresión sostenida (SD).
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:04
Preparing the Skull for Imaging and Electrophysiology to Monitor Spreading Depolarizations in Injured Mouse Brain
2:52
Detecting the Spreading Depolarizations in Mouse Brain Injury Model with Intrinsic Optical Signal Imaging and AC-Electrophysiology
